金銀花多糖的指紋圖譜及體外抗病毒活性研究

丁潔 閆光玲 楊培 張永清 劉玉紅

中圖分類號 R284.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）09-1061-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.09.08

摘 要 目的：建立金銀花多糖的指紋圖譜，并考察其對呼吸道合胞病毒（RSV）的體外抑制作用。方法：通過水提、二次醇沉制備金銀花多糖;所得多糖經(jīng)三氟乙酸水解和鹽酸羥胺、吡啶等衍生化后，采用氣相色譜法（GC）建立指紋圖譜。色譜柱為HP-5毛細管色譜柱，檢測器為火焰離子化檢測器，進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為300 ℃，程序升溫，載氣為氮氣（流速50 mL/min），分流進樣（分流比60 ∶ 1），進樣量為2.0 μL。以鼠李糖為參照，繪制12批金銀花藥材樣品（S1～S12）的GC指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》進行相似度評價并確定共有峰;采用SPSS 21.0軟件進行聚類分析和主成分分析。以利巴韋林為陽性對照，以半數(shù)有效濃度（EC50）、治療指數(shù)（TI）為指標，采用MTT法考察金銀花多糖對RSV的體外抑制作用。結(jié)果：12批金銀花藥材樣品的GC指紋圖譜有12個共有峰，相似度≥0.994;共指認鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、肌醇六乙酸酯等7個共有峰。12批藥材樣品共聚為兩類，即S1、S7、S10、S11聚為一類，其余聚為一類;主成分分析中，3個主成分的特征值均大于1（分別為5.659、2.745、1.724），其累積貢獻率為84.400%。樣品綜合得分以S12最高，S5次之，S11最低。金銀花（S12）總多糖、80%醇沉多糖、50%醇沉多糖、20%醇沉多糖的EC50值分別為0.76、0.61、1.03、3.04 g/L，TI值分別為15.36、18.51、11.69、4.22;其中，80%醇沉多糖的EC50值最低，TI值與陽性對照（20.08）接近。結(jié)論：所建指紋圖譜可為金銀花藥材的質(zhì)量評價提供參考。金銀花多糖對RSV具有一定的體外抑制活性，且以80%醇沉多糖活性最強。

關(guān)鍵詞 金銀花多糖;指紋圖譜;氣相色譜;主成分分析;抗病毒活性

Study on Fingerprint and in vitro Antiviral Activity of Lonicera japonica Polysaccharide

DING Jie1，YAN Guangling1，YANG Pei1，ZHANG Yongqing1，2，LIU Yuhong1，2（1. School of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China; 2. Fine Breeding Engineering Center of Chinese Medicinal Materials of Shandong Province， Jinan 250355， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the fingerprint of Lonicera japonica polysaccharide， and to investigate in vitro inhibitory effect of it on respiratory syndrome virus （RSV）. METHODS： Polysaccharide from L. japonica was prepared by water extraction and twice alcohol precipitation method. After hydrolysis with trifluoroacetic acid， derivatization with hydroxylamine hydrochloride and pyridine， the fingerprint was established by GC method. The determination was performed on HP-5 capillary column， and the detector was flame ionization detector; the temperature of the sample inlet was 250 ℃; the temperature of the detector was 300 ℃ （programmed temperature）; the carrier gas was nitrogen （flow rate of 50 mL/min）; split sampling was adopted （split ratio of? ? ?60 ∶ 1）; the sample size was 2.0 μL. Using rhamnose as reference substance， GC fingerprint of 12 batches of L. japonica （S1-S12） was drawn， and the similarity evaluation was performed with Similarity Evaluation System of TCM Fingerprint （2012 edition）. Cluster analysis and principal component analysis were conducted by using SPSS 21.0 software. Using ribavirin as positive control， half effective concentration （EC50） and treatment index （TI） as indexes， MTT assay was used to investigate in vitro inhibitory effect of L. japonica polysaccharide on RSV. RESULTS： There were 12 common peaks in GC fingerprint of 12 batches of L. japonica. The similarity was greater than or equal to 0.994. Seven common peaks were identified， such as rhamnose， arabinose， fucose， mannose， glucose， galactose， inositol hexaacetate. According to the cluster analysis， 12 batches of samples could be divided into two categories， i.e. S1， S7， S10 and S11 clustered into one category， and others clustered into one category. In principal component analysis， the eigen values of 3 principal components were all greater than 1 （5.659， 2.745， 1.724 respectively）， and their cumulative contribution rate was 84.400%. The comprehensive score of S12 was the highest， the second was S5， and the lowest was S11. EC50 of total polysaccharide， 80% alcohol precipitated polysaccharide， 50% alcohol precipitated polysaccharide and 20% alcohol precipitated polysaccharide of L. japonica （No. S12） were 0.76， 0.61， 1.03， 3.04 g/L， respectively; TI were 15.36， 18.51， 11.69， 4.22， respectively. EC50 of 80% ethanol alcohol precipitated polysaccharide was the lowest， and its TI was close to that of positive control （20.08）. CONCLUSIONS： Established fingerprint provides reference for the quality evaluation of L. japonica. L. japonica polysaccharide has a certain inhibitory activity on RSV in vitro， and the 80% alcohol precipitated polysaccharide has the strongest activity.

KEYWORDS? ?Lonicera japonica polysaccharide; Fingerprint; Gas chromatography; Principal component analysis; Antivirus activity

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，始載于《名醫(yī)別錄》，為上品，臨床上廣泛用于治療多種上呼吸道病毒感染，療效顯著[1-3]。金銀花多糖是該藥材發(fā)揮降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗病毒等功效的重要活性成分之一[4-7]。然而，現(xiàn)有金銀花的質(zhì)量評價主要集中在綠原酸、木犀草苷等小分子成分的含量控制上[1，8]，而對于多糖等重要有效成分的含量卻未作規(guī)定，使得金銀花藥材的質(zhì)量標準不夠完善。指紋圖譜是目前應(yīng)用廣泛的質(zhì)量評價方法之一，具有整體性、特征性、關(guān)聯(lián)性等特點，適用于中藥復(fù)雜體系的質(zhì)量研究[9]。筆者通過檢索文獻發(fā)現(xiàn)，雖已有金銀花指紋圖譜的相關(guān)研究報道，但仍以小分子成分作為指標，缺乏以金銀花多糖等大分子有效成分為指標的指紋圖譜研究。為此，本研究采用氣相色譜法（GC）建立金銀花多糖指紋圖譜，并進行聚類分析和主成分分析，旨在為金銀花藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金銀花多糖具有抗H1N1流感病毒的作用，主要機制包括調(diào)節(jié)免疫、促進免疫以及抑制炎癥反應(yīng)等[7]。基于此，本研究初步考察了金銀花多糖對呼吸道合胞病毒（RSV）的體外抑制活性，旨在為金銀花臨床藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的進一步闡釋提供參考。

1 材料

1.1 儀器

6980型GC儀（美國Agilent公司）;Model 680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）;3111型CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;BT25S型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）;5427R型高速低溫離心機（德國Eppendorf公司）;YRE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司）。

1.2 藥材與試劑

金銀花藥材購自于山東省漱玉平民大藥房、同仁堂等藥房，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李佳教授鑒定為真品。樣品信息見表1。

鼠李糖對照品（批號：C10110722，純度：≥99%）、阿拉伯糖對照品（批號：C10127747，純度：≥99%）、巖藻糖對照品（批號：C10111725，純度：≥99%）、甘露糖對照品（批號：C10122746，純度：≥99%）、葡萄糖對照品（批號：C10110127，純度：≥99%）、半乳糖對照品（批號：C10126514，純度：≥99%）均購自上海麥克林生化科技公司;肌醇六乙酸酯對照品（單糖組成檢測用內(nèi)標，本實驗室自制[10]，純度：>97%）;利巴韋林原料藥（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：J1202A，純度：>99%）;RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、胰酶（美國Gibco公司，批號分別為1662222、25300055）;胎牛血清（美國Hyclone公司，批號：nxa0544）;MTT試劑（美國Ameresco公司，批號：1046935）;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 病毒

RSV標準病毒株由山東省立醫(yī)院提供。

1.4 細胞

非洲綠猴腎細胞Vero由山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 金銀花多糖樣品制備

稱取金銀花藥材50.0 g，加入15倍量（mL/g，下同）水，在85 ℃下回流提取2 h，重復(fù)2次。合并提取液，濃縮至一定體積，以3 500 r/min離心6 min，取上清液，加4倍量無水乙醇，靜置過夜;收集沉淀，加適量水復(fù)溶，再用4倍量無水乙醇重復(fù)醇沉1次，收集沉淀。將上述沉淀于60 ℃真空干燥，即得金銀花多糖樣品（每100 g藥材得金銀花多糖樣品5 g）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 多糖完全酸水解樣品 精密稱取按“2.1”項下方法制備的S1～S12金銀花多糖樣品各10.00 mg，置于具塞試管中，加2 mol/L三氟乙酸溶液6 mL，加塞封口，于110 ℃水解5 h后，于60 ℃下減壓濃縮至干;殘渣加少量甲醇復(fù)溶，蒸干，重復(fù)5次操作，即得金銀花多糖完全酸水解樣品，備用。

2.2.2 多糖衍生化樣品溶液 將“2.2.1”項下多糖完全酸水解樣品真空干燥12 h后，加鹽酸羥胺10 mg、吡啶0.6 mL、肌醇六乙酸酯1 mg，于90 ℃攪拌反應(yīng)30 min;冷卻，加醋酸酐1.6 mL，于90 ℃繼續(xù)反應(yīng)30 min。反應(yīng)液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后，用氯仿定容至5 mL，即得金銀花多糖衍生化樣品溶液，備用。

2.2.3 混合單糖對照品衍生化樣品溶液 精密稱取葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、巖藻糖對照品各5 mg，混合，加鹽酸羥胺30 mg、吡啶1.8 mL、肌醇六乙酸酯4 mg，于90 ℃攪拌反應(yīng)30 min;冷卻，加醋酸酐4.8 mL，于90 ℃繼續(xù)反應(yīng)30 min。反應(yīng)液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后，用氯仿定容至5 mL，即得各單糖質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的混合單糖對照品衍生化樣品溶液，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：HP-5毛細管色譜柱（3 m×320 μm，0.25 μm）;檢測器：火焰離子化檢測器（FID）;進樣口溫度：250 ℃;檢測器溫度：300 ℃;升溫程序：初始溫度165 ℃，保持3 min，以1 ℃/min速度升溫至185 ℃，保持3 min，最后以2 ℃/min速度升溫至210 ℃，保持3 min;載氣：氮氣;氮氣流速：50 mL/min;氫氣流速：30 mL/min;空氣流速：50 mL/min;進樣量：2.0 μL;進樣方式：分流進樣;分流比：60 ∶ 1。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取“2.2.2”項下金銀花多糖衍生化樣品溶液（編號：S1），按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以鼠李糖（3號峰）為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，12個共有峰相對保留時間的RSD均小于1%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取“2.1”項下金銀花多糖樣品（編號：S1）共6份，按“2.2.1”“2.2.2”項下方法制備多糖衍生化樣品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以鼠李糖（3號峰）為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，12個共有峰相對保留時間的RSD均小于3%（n=6），相對峰面積的RSD均小于4%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下金銀花多糖衍生化樣品溶液（編號：S1），分別于室溫放置0、2、4、6、8、12、24 h時按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以鼠李糖（3號峰）為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果顯示，12個共有峰相對保留時間的RSD均小于2%（n=7），相對峰面積的RSD均小于3%（n=7），表明上述樣品在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 指紋圖譜的建立及相似度分析

取12批金銀花藥材，按“2.1”“2.2.1”“2.2.2”項下方法制備多糖及其衍生化樣品溶液，再按“2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。將各樣品的GC圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》中，設(shè)置S1樣品的GC圖譜為參照圖譜，時間窗寬度為0.1 s，采用中位數(shù)法生成對照圖譜（R），進行全峰匹配，建立指紋圖譜（見圖1）。結(jié)果，共得到12個共有峰（色譜峰從左到右依次編號為1～12號）。將GC指紋圖譜與混合單糖對照品衍生化樣品的GC圖譜（見圖2）進行比對，根據(jù)保留時間共指認出了7個色譜峰，其中3號峰為鼠李糖，4號峰為阿拉伯糖，5號峰為巖藻糖，9號峰為甘露糖，10號峰為葡萄糖，11號峰為半乳糖，12號峰為肌醇六乙酸酯。因3號峰峰面積較大且分離度良好，故將該峰作為參照。

借助《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》對12批藥材的相似度進行分析。結(jié)果，12批藥材的相似度≥0.994，詳見表2。

2.6 聚類分析

將12批藥材共有峰的峰面積作為變量，利用SPSS 21.0軟件進行聚類分析。本研究采用系統(tǒng)聚類法，將樣品之間的距離定義為歐氏距離，并將類與類之間的距離作為最短距離，進行聚類分析并得到樹狀關(guān)系圖，詳見圖3。由圖3可知，當歐式距離為10～25時，樣品可以分為兩大類，即S1、S7、S10、S11聚為一類，其余聚為一類;在其余批次這類中，又可以分為兩類，其中S3、S6聚為一類，S2、S4、S5、S8、S9、S12聚為一類。

2.7 主成分分析和因子分析

將12個批藥材共有峰的峰面積作為變量，利用SPSS 21.0軟件進行主成分分析和因子分析。采用降維理論[11]，通過高度概括相關(guān)指標來達到濃縮數(shù)據(jù)的目的。以主成分分析得到的相關(guān)矩陣的特征值和方差貢獻率為基礎(chǔ)，進行因子分析[11];根據(jù)主成分個數(shù)確定原則，保留特征值≥1的主成分或累積貢獻率≥80%的主成分[12-13]。金銀花藥材的主成分分析結(jié)果見表3，碎石圖見圖4。由表3可見，共有3個成分的特征值大于1，分別為5.659、2.745、1.724;且這3個成分的累積貢獻率為84.400%，超過80%。由圖4可見，4號成分為轉(zhuǎn)折處的特征根編號，故4號成分前面的因子即為要提取的數(shù)目，即應(yīng)提取前3個主成分為宜。

主成分數(shù)目確定后，利用因子載荷矩陣表計算綜合得分，且綜合得分越高，表明樣品的綜合評價結(jié)果越好、品質(zhì)越高[11，14]。12批藥材樣品的主成分得分、綜合得分及排名見表4。由表4可見，S12藥材的品質(zhì)最好，S5次之，S11最末?；诖?，本課題組選取S12藥材樣品進行后續(xù)的體外抗病毒研究。

2.8 金銀花多糖的體外抗RSV研究

2.8.1 多糖樣品處理 取“2.7”項下綜合得分最高的金銀花藥材（編號：S12），按“2.1”項下方法制備金銀花多糖樣品，即為總多糖。取上述總多糖用水溶解后，加0.25倍量無水乙醇進行20%醇沉，靜置過夜，收集沉淀;繼續(xù)于上清液中加入0.6倍量無水乙醇進行50%醇沉，靜置過夜，收集沉淀;繼續(xù)于上清液中加入1.5倍量無水乙醇進行80%醇沉，靜置過夜，收集沉淀。將總多糖和上述沉淀分別于60 ℃真空干燥，得總多糖樣品和20%醇沉多糖樣品、50%醇沉多糖樣品、80%醇沉多糖樣品（根據(jù)多糖醇沉性質(zhì)，當乙醇濃度低時，所得醇沉樣品中的多糖分子量大;醇沉濃度參考相關(guān)文獻[10，15]設(shè)置）。

2.8.2 RSV擴增 取RSV，加入至長成單層的Vero細胞中，確保病毒量占完全培養(yǎng)基（即含2%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，下同）的10%，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。待細胞生長至90%時收集，參考相關(guān)文獻方法[16]將細胞反復(fù)凍融（-80～37 ℃）3次，以1 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱中凍存，備用。

2.8.3 病毒毒力測定 取Vero細胞適量，經(jīng)胰酶消化后，按1×104個/孔接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h至細胞長成單層，棄去培養(yǎng)基。用完全培養(yǎng)基將“2.8.2”項下上清液（即RSV）進行10倍遞次稀釋，按每孔100 μL將各稀釋度的病毒液接種至細胞中，即為病變組;同時設(shè)置細胞對照組（含完全培養(yǎng)基100 ?L但不含病毒）。每組設(shè)置4個復(fù)孔。細胞培養(yǎng)24 h后，每孔加MTT試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液;加入二甲基亞砜100 μL，同時設(shè)置空白組（僅含二甲基亞砜100 μL），使用酶標儀于492 nm波長處測定各孔光密度（OD）值，并計算細胞存活率（公式①）;根據(jù)Reed-Muench法（公式②③）[17]計算病毒半數(shù)感染濃度（TCID50），以確定后續(xù)研究的病毒液濃度。

細胞存活率（%）=（病變組平均OD值-空白組平均OD值）/（細胞對照組平均OD值-空白組平均OD值）×100%…①

TCID50=Antilg[高于50%細胞病變效應(yīng)（CPE）百分率病毒稀釋度+比距]…②

比距（%）=（高于50%存活率-50%）/（高于50%存活率-低于50%存活率）×100%…③

結(jié)果，RSV的TCID50值為10-2.13，故選取RSV的100倍TCID50值作為病毒液濃度。

2.8.4 多糖樣品細胞毒性測定 取Vero細胞適量，經(jīng)胰酶消化后，按1×104個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。依據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，將總多糖、80%醇沉多糖、50%醇沉多糖、20%醇沉多糖分別用RPMI 1640培養(yǎng)基從80? g/L起以2倍比連續(xù)稀釋共10個梯度后，按每孔100 ?L分別轉(zhuǎn)移至細胞中;同時設(shè)細胞對照組（含完全培養(yǎng)基100 ?L）和利巴韋林陽性對照組（用完全培養(yǎng)基稀釋的利巴韋林藥液100 ?L;依據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果，從250? ? ??g/mL起以2倍比連續(xù)稀釋共10個梯度）。每組設(shè)4個復(fù)孔。細胞培養(yǎng)24 h后，按“2.8.3”項下MTT法使用酶標儀于492 nm波長處測定各孔OD值，按公式①計算細胞存活率，并根據(jù)Reed-Muench法（公式④）[18]計算藥物對細胞的半數(shù)中毒濃度（TC50），結(jié)果見表5。由表5可見，4種多糖樣品的TC50值分別為11.67、11.29、12.04、12.83 g/L，因此確定多糖的最大無毒濃度為20 g/L[19]。

TC50=[Antilg（高于50%CPE百分率加藥組稀釋度+比距）×C…④

式中，C為第1孔藥物的終質(zhì)量濃度，即最高劑量。

2.8.5 體外抗病毒測定 取Vero細胞適量，經(jīng)胰酶消化后，按1×104個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h至細胞長成單層后，棄去培養(yǎng)基。用RPMI 1640培養(yǎng)基將多糖樣品從最大無毒濃度起依次以2倍比稀釋，制得20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04 g/L含藥培養(yǎng)基，依次吸取50 μL至96孔板中，各加病毒液50 μL;同時設(shè)細胞對照組（含完全培養(yǎng)基100 ?L）、模型組（含病毒液100 ?L）和利巴韋林組（含利巴韋林的完全培養(yǎng)基100 ?L;根據(jù)“2.8.4”項下結(jié)果，從60 ?g/mL起以2倍比連續(xù)稀釋共10個梯度）。每組設(shè)4個復(fù)孔。細胞培養(yǎng)至模型組病變至90%（根據(jù)細胞形態(tài)判斷）時，按“2.8.3”項下MTT法使用酶標儀于492 nm波長處檢測各孔OD值，按公式①計算細胞存活率，并根據(jù)Reed-Muench法（公式⑤⑥）[18]計算藥物的半數(shù)有效濃度（EC50）及治療指數(shù)（TI），結(jié)果見表6。

EC50=[Antilg（高于50%CPE百分率藥物稀釋度-比距）×C…⑤

TI=[TC50

EC50] …⑥

OD值在一定范圍內(nèi)與活細胞數(shù)量成正比，由MTT法測得細胞組OD值為0.740 5，RSV感染的模型組OD值為0.172 1，表明在RSV干預(yù)下，細胞的存活率有所降低，模型復(fù)制成功[20]。由表6可見，金銀花總多糖、80%醇沉多糖、50%醇沉多糖、20%醇沉多糖的TI值分別為15.36、18.51、11.69、4.22。一般認為當TI>4時，即為有效[21]。因此，上述4種金銀花多糖對RSV均具有一定的體外抑制活性，其中80%醇沉多糖活性最強，且TI值（18.51）與陽性對照（20.08）接近;總多糖活性次之。

3 討論

中藥指紋圖譜是目前能夠被國內(nèi)外學(xué)者普遍接受的一種中藥質(zhì)量評價方法，其可直接將療效相關(guān)的有效成分作為考察指標，突出中藥成分的完整面貌，可滿足中醫(yī)藥傳統(tǒng)理論整體性研究的需要?；诖?，本研究通過GC法建立金銀花多糖指紋圖譜，對不同產(chǎn)地的12批金銀花藥材進行質(zhì)量對比分析，旨在為金銀花藥材的質(zhì)量控制提供參考。

當樣品制備方法不同時，其所獲得的色譜指紋圖譜差異很大，分析結(jié)果也完全不同[22]。因此，在指紋圖譜分析中，必須重視樣品的制備方法。在前期研究中，筆者對提取方法（傳統(tǒng)熱水提取法、超聲輔助熱水提取法）、醇沉次數(shù)（一次醇沉、二次醇沉）等因素進行了考察。在綜合考慮GC色譜峰峰形、對稱性及分離度等因素的影響后，發(fā)現(xiàn)兩種提取方法所得的色譜峰峰形相似，但采用傳統(tǒng)熱水提取法時，所得色譜峰尖銳、對稱，多糖得率高;與一次醇沉相比，二次醇沉后所得多糖的分離效果較好。因此，最終確定采用傳統(tǒng)熱水提取法并進行二次醇沉制備多糖。

由方法學(xué)考察結(jié)果可以看出，本研究所建立的金銀花多糖指紋圖譜分析方法準確、可靠。共指認7個共有峰，且各批金銀花藥材多糖樣品的相似度≥0.994，表明市售藥材樣品化學(xué)成分相對穩(wěn)定，藥材成分具有較好的一致性。

聚類分析可在事物分類面貌尚不明確的情況下討論事物的分類情況，是“無師可尋”的統(tǒng)計分類方法[23]。聚類分析結(jié)果顯示，主產(chǎn)于東北地區(qū)的藥材（S1、S7、S10、S11）聚為一類，主產(chǎn)于山東、河南兩地的藥材（S2、S4、S5、S8、S9、S12）聚為一類。主成分和因子分析結(jié)果顯示，主產(chǎn)于山東的S12品質(zhì)最好，主產(chǎn)于河南的S5品質(zhì)次之，主產(chǎn)于吉林的S11最末，提示由于氣候環(huán)境的不同，不同產(chǎn)地的金銀花藥材在質(zhì)量上存在差異。

金銀花是臨床上治療呼吸道感染的要藥[24]。研究表明，RSV是引起呼吸道病毒感染的主要病原之一，但由于缺乏疫苗且化學(xué)藥致不良反應(yīng)較多，RSV所致感染的臨床治療方案一直存有爭議[25-26]。利巴韋林作為廣譜抗病毒藥物，抗病毒活性強，但毒性較大，易造成可逆性溶血性貧血，故其臨床應(yīng)用受限[27]。因此，開發(fā)金銀花等抗RSV中藥具有一定的價值。本研究從多糖最大無毒濃度開始連續(xù)2倍比稀釋，以排除藥物本身的毒性作用，且安全范圍相對較寬，符合臨床用藥標準[28];所選用的TI值可反映藥物對病毒的抑制作用，當TI>4時，即可認為藥物有效，且該值越大則表明藥物對病毒的抑制作用越強[21，29]。本研究結(jié)果顯示，不同多糖樣品抑制RSV的TI值均大于4，可認為其均具有體外抗病毒的作用，且活性由高到低依次為80%醇沉多糖、總多糖、50%醇沉多糖、20%醇沉多糖。分析其原因，筆者認為可能與醇沉效果有關(guān)：80%醇沉多糖的糖含量相對較高;而當乙醇濃度較低時，所得醇沉樣品中的多糖分子量大，且在醇沉過程中，大分子蛋白等雜質(zhì)也會隨之析出，從而影響多糖的抗病毒效果[10，15]。此外，本研究結(jié)果表明，金銀花80%醇沉多糖的TI值和利巴韋林相近，且EC50值在各種多糖成分中最低，提示80%醇沉多糖可能為金銀花抗病毒的活性部位。

綜上所述，本研究所建立的指紋圖譜可為金銀花藥材的質(zhì)量評價提供參考，并發(fā)現(xiàn)金銀花多糖具有一定的體外抗RSV活性。本研究為金銀花抗病毒活性評價奠定了基礎(chǔ)，同時也為中藥抗RSV提供了新的研究方向。但由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜，有部分色譜峰未被指認，故筆者下一步將確定其他未知共有峰所代表的化合物，并深入挖掘金銀花多糖抗病毒的作用機制。

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（收稿日期：2019-09-07 修回日期：2020-02-20）

（編輯：張元媛）