丁倩倩 唐新茹 張昌浩▲ 黃曉光 王 雪 孫 雪 楊 慧

1.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林延吉 136200；2.吉林省博大偉業(yè)藥物研究有限公司，吉林長(zhǎng)春 130000

舒更葡糖鈉（sugammadex sodium）是一種改良的新型γ-環(huán)糊精，是首個(gè)可以在全身麻醉期間逆轉(zhuǎn)神經(jīng)肌肉阻滯的選擇性松弛結(jié)合劑，其作用機(jī)制是通過(guò)包裹羅庫(kù)溴銨的環(huán)戊烷過(guò)氫菲環(huán)使其失活，從而發(fā)揮神經(jīng)肌肉阻滯的逆轉(zhuǎn)作用[1-3]。2005年，荷蘭的Organon Biosciences公司首次報(bào)道了有關(guān)舒更葡糖鈉的臨床使用；2008年7月，由默沙東公司研發(fā)的舒更葡糖鈉注射液（商品名：Bridion）宣布在歐洲批準(zhǔn)上市，而中國(guó)也在2017年4月獲批準(zhǔn)上市，并在臨床開始應(yīng)用[4-5]。

二甲氨基甲酰氯是在合成舒更葡糖鈉的工藝中由所參與的主要原料氯化劑（如草酰氯、磷酰氯、亞硫酰氯）和N，N-二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）經(jīng)Vilsmeier反應(yīng)形成的一種基因毒性雜質(zhì)，屬于2A類致癌物[6]?；蚨拘噪s質(zhì)是一種可使DNA被直接或間接破壞導(dǎo)致突變、重組及染色體斷裂，最終致癌變及致突變性的物質(zhì)，具有較低的安全閾值，低濃度時(shí)便可產(chǎn)生嚴(yán)重的致癌風(fēng)險(xiǎn)[7-11]。因此，建立一種能對(duì)舒更葡糖鈉中的二甲氨基甲酰氯殘留量進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)的方法是必要的。根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（International Conference on Harmonization，ICH）M7指南[12]來(lái)確定二甲氨基甲酰氯的限度，得到二甲氨基甲酰氯的TD50數(shù)值為0.625 mg/（kg·d），而舒更葡糖鈉的最大日劑量（以舒更葡糖鈉活體計(jì)）為16 mg/（kg·d），經(jīng)計(jì)算后得到舒更葡糖鈉中遺傳毒性雜質(zhì)二甲氨基甲酰氯的限度為0.000 07%。根據(jù)其限度較低，對(duì)儀器的靈敏度要求更嚴(yán)格，常規(guī)的氣相色譜、液相色譜等難以準(zhǔn)確檢測(cè)，故本研究采用靈敏度高、定量分析準(zhǔn)確、檢測(cè)限較低、選擇性高的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）對(duì)舒更葡糖鈉中的二甲氨基甲酰氯進(jìn)行檢測(cè)，可以較好地達(dá)到基因毒性雜質(zhì)痕量分析的要求，以便降低生產(chǎn)成本及提高藥品的質(zhì)量[13-16]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

7010B-8890氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent公司）；VF-624ms毛細(xì)管色譜柱（Agilent公司）；BT-125D型電子天平（Sartorius公司）。

1.2 試劑

乙醚（色譜純，成都科隆化工公司）；二甲氨基甲酰氯（批號(hào)：16-Nov-LD17-1-06，Lovan Research chermical 公司）；舒更葡糖鈉（批號(hào)：2206001、2206002、2207001，吉林省博大偉業(yè)制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 GC-MS條件

2.1.1 色譜條件 毛細(xì)管柱為VF-624ms（30 m×0.25 mm，1.4 μm），載氣為氦氣，柱流量為1.5 ml/min；進(jìn)樣口溫度200℃，進(jìn)樣體積為1 μl；初始柱溫為40℃，維持2 min；以20℃/min升至250℃，維持8 min。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用電離源EI，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃，四級(jí)桿溫度150℃，電離電壓70 ev，碰撞器為氮?dú)?，溶劑延遲 5 min，采集模式為SIM模式，二甲氨基甲酰氯的采集離子為107。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取二甲氨基甲酰氯20 mg，用乙醚稀釋成每1 ml中含二甲氨基甲酰氯約0.2 mg的溶液，搖勻后即可得到二甲氨基甲酰氯對(duì)照品母液。量取母液40 μl置100 ml容量瓶中，用乙醚稀釋至刻度，搖勻后即可得到80 ng/ml的二甲氨基甲酰氯對(duì)照品儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液適量，用乙醚稀釋成每1 ml中含二甲氨基甲酰氯40 ng的溶液即為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取舒更葡糖鈉575 mg于10 ml量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，振搖并用玻璃離心管離心，作為供試品溶液。

2.2.3 混標(biāo)溶液的制備 精密稱取舒更葡糖鈉575 mg于10 ml量瓶中，加入二甲氨基甲酰氯對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用乙醚稀釋成每毫升中含二甲氨基甲酰氯40 ng的混合溶液，振搖并用玻璃離心管離心即可。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性考察 分別精密量取配制好的供試品溶液、二甲氨基甲酰氯的對(duì)照品溶液、混標(biāo)溶液及乙醚各1 μl進(jìn)樣測(cè)定，得到色譜圖（圖1～4）。結(jié)果表明，采用上述色譜條件測(cè)得的二甲氨基甲酰氯，其保留時(shí)間為7.636 min，分離度好，相鄰雜質(zhì)峰不對(duì)其干擾，且空白溶劑、舒更葡糖鈉不干擾二甲氨基甲酰氯的檢測(cè)，故方法的專屬性較好。

圖1 空白溶劑乙醚的GC-MS色譜圖

圖2 二甲氨基甲酰氯對(duì)照品溶液的GC-MS色譜圖

圖3 供試品溶液的GC-MS色譜圖

圖4 混標(biāo)溶液的GC-MS色譜圖

2.3.2 檢測(cè)限和定量限試驗(yàn) 取二甲氨基甲酰氯對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用乙醚稀釋成合適的濃度，按規(guī)定的色譜條件測(cè)定，當(dāng)主成分信噪比約為10∶1的進(jìn)樣濃度為定量限，信噪比約為3∶1時(shí)的進(jìn)樣濃度為檢測(cè)限，測(cè)定結(jié)果表明二甲氨基甲酰氯的檢測(cè)限為4.04 ng/ml，定量限為8.08 ng/ml。

2.3.3 線性關(guān)系考察 取對(duì)照品儲(chǔ)備液，精密量取1.0、2.5、4.0、5.0、6.0和7.5 ml各置于10 ml量瓶中加乙醚稀釋至刻度，再分別精密量取稀釋后的溶液及對(duì)照品儲(chǔ)備液各1 μl進(jìn)樣測(cè)定，得到色譜圖，橫坐標(biāo)為二甲氨基甲酰氯的濃度，縱坐標(biāo)為其峰面積，進(jìn)行線性回歸，得到二甲氨基甲酰氯的線性回歸方程為：Y=49 368X-41 838，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。所得結(jié)果表明當(dāng)進(jìn)樣量為1 μl時(shí)，二甲氨基甲酰氯在8.08～80.80 ng/ml的范圍內(nèi)，其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液，按照設(shè)定的色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜圖，測(cè)得二甲氨基甲酰氯峰面積的RSD值為3.30%（n=6）。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取舒更葡糖鈉約575 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加乙醚稀釋至刻度，振搖后用玻璃離心管離心，配置6份為供試品溶液；另取對(duì)照品溶液，分別精密量取1 μl進(jìn)樣測(cè)定，記錄譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算舒更葡糖鈉中二甲氨基甲酰氯的殘留量，結(jié)果顯示，經(jīng)6次測(cè)定均未檢出二甲氨基甲酰氯。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 取舒更葡糖鈉約575 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5、5.0、7.5 ml，用乙醚稀釋至刻度，振搖后用玻璃離心管離心，各制備3份，作為低、中、高三種濃度的溶液（分別為限量濃度的50%、100%、150%），另按上述方法制備對(duì)照品溶液，各1 μl進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。測(cè)定結(jié)果見表1，結(jié)果表明，通過(guò)9份樣品測(cè)定所得二甲氨基甲酰氯的平均回收率為100.91%（RSD=2.92%），故回收率符合要求。

表1 二甲氨基甲酰氯回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.3.7 穩(wěn)定性考察 取供試品溶液置于室溫下，分別放置0、2、4、6、8 h后，精密量取1 μl測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算供試品溶液中二甲氨基甲酰氯的含量。結(jié)果表明，經(jīng)8 h的測(cè)定二甲氨基甲酰氯均呈未檢出的狀態(tài)，故溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.8 耐用性試驗(yàn) 變動(dòng)色譜條件各參數(shù)[初始溫度（40±2）℃、柱流速（1.5±0.1）ml/min]，分別精密量取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1 μl測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品溶液在各參數(shù)條件下均未檢出二甲氨基甲酰氯，故色譜參數(shù)的微小變化對(duì)二甲氨基甲酰氯的檢出不影響，耐用性良好。

2.3.9 樣品測(cè)定 取3批舒更葡糖鈉，配成供試品溶液，按規(guī)定的色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見表2，表明3批舒更葡糖鈉中均未檢出二甲氨基甲酰氯，符合二甲氨基甲酰氯限度不超過(guò)0.000 07%的要求。

表2 3批樣品二甲氨基甲酰氯測(cè)定結(jié)果

3 討論

在摸索色譜條件時(shí)，發(fā)現(xiàn)采用預(yù)設(shè)的5∶1的分流比進(jìn)樣，色譜峰的響應(yīng)值達(dá)不到要求，而不分流進(jìn)樣時(shí)其質(zhì)譜峰的響應(yīng)值高，故本研究最終不采取分流進(jìn)樣。此外本研究還考察了不同的毛細(xì)管柱（VF-624ms、VF-WAXms）對(duì)二甲氨基甲酰氯檢測(cè)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VF-WAXms毛細(xì)管柱檢測(cè)出的二甲氨基甲酰氯峰型不好，響應(yīng)值也較低，而VF-624ms型毛細(xì)管柱檢測(cè)出的峰型對(duì)稱且分離度好，故最終采用該毛細(xì)管柱。

實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中，本研究發(fā)現(xiàn)塑料制品（塑料滴管、塑料離心管）的使用會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)色譜圖的主峰附近出現(xiàn)雜峰且分離度不符合要求，從而干擾檢測(cè)結(jié)果，故實(shí)驗(yàn)全程使用玻璃制品（玻璃滴管、玻璃離心管）以避免干擾。

溶劑的確定，預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)篩選了舒更葡糖鈉與二甲氨基甲酰氯都能溶解的水溶劑，但其結(jié)構(gòu)中的酰氯鍵（-COCl）遇水不穩(wěn)定易斷裂，又考察了乙醚、乙腈、醇類等有機(jī)溶液，結(jié)果表明二甲氨基甲酰氯在乙醚中的溶解度較好且穩(wěn)定性最佳，同時(shí)由于采用的GC-MS較靈敏，故優(yōu)先選擇色譜純的乙醚。

本研究采用GC-MS建立了有效測(cè)定舒更葡糖鈉中基因毒性雜質(zhì)二甲氨基甲酰氯的方法，并經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，相較于單一的氣相色譜，靈敏度得到提高、專屬性和耐用性更好以及檢測(cè)時(shí)無(wú)干擾，可以較好地達(dá)到基因毒性雜質(zhì)痕量分析的要求，可為舒更葡糖鈉中有關(guān)基因毒性雜質(zhì)及其他藥物中二甲氨基甲酰氯的測(cè)定提供借鑒。但由于GC-MS儀器較貴，無(wú)法在藥廠車間普及，且對(duì)儀器使用人員的要求較高，故存在一定的局限性。