劉 元,謝婷婷,尹朗庭,劉 斌,趙君文,孫 卓,效 梅,安立龍

(廣東海洋大學(xué) 濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院 廣東省特色家禽生態(tài)健康養(yǎng)殖科技創(chuàng)新中心,廣東 湛江 524088)

小腸是家禽消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要器官之一,又是保持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的先天性屏障。營養(yǎng)物質(zhì)與小腸的接觸面積決定著吸收營養(yǎng)物質(zhì)量的多少,腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)顯示著腸道吸收功能的強弱。在全球日益暖化以及高密度養(yǎng)殖的趨勢下,加之廣東湛江地區(qū)高溫、高濕的氣候特點,熱應(yīng)激已經(jīng)成為影響湛江地區(qū)家禽腸道黏膜損傷的重要原因之一[1]。體溫調(diào)節(jié)是動物維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種方式,當動物自身產(chǎn)熱和散熱不平衡時,則會產(chǎn)生熱應(yīng)激[2]。家禽因其缺乏汗腺、被覆羽毛、代謝速率快和體溫偏高等生理特點,更容易受到熱應(yīng)激[3]。高溫環(huán)境下,家禽血液供應(yīng)減少和采食量減少,引起氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),最終導(dǎo)致腸道形態(tài)改變和黏膜損傷[4]。

熱應(yīng)激還會引發(fā)家禽的散熱系統(tǒng)失衡,機體自身溫度升高,產(chǎn)生大量自由基并且產(chǎn)生氧化還原反應(yīng),造成組織器官發(fā)生凋亡。致使家禽免疫功能遭到破壞,免疫力下降,從而影響家禽的產(chǎn)蛋率、采食量、體質(zhì)量和死亡率等[5]。谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是最重要的抗氧化酶;雞總抗氧化能力(total antioxidant capacity of chickens,T-AOC)則代表了機體總抗氧化水平;丙二醛(malondialdehyde,MDA)是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物,其含量水平可反映脂質(zhì)過氧化的程度。MORALES等[6]研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激可以降低豬絨毛高度、回腸中BOAT2的相對表達。歐陽經(jīng)鑫等[7]研究顯示熱應(yīng)激可以降低肉雞回腸黏膜CAT和SOD活性以及T-AOC。也有研究發(fā)現(xiàn)在高溫環(huán)境下雞腸道屏障和黏膜免疫系統(tǒng)受到損傷[8]。另外研究發(fā)現(xiàn),高溫環(huán)境導(dǎo)致豬腸道絨毛受損、絨毛高度降低、隱窩深度增加、上皮細胞凋亡脫落、腸道黏膜形態(tài)改變、結(jié)構(gòu)損傷嚴重[9]。

懷鄉(xiāng)雞具有(皮黃、腳黃、羽毛黃)特征,與惠州胡須雞、清遠麻雞并稱“廣東三大名雞”。其肌肉豐滿、肉質(zhì)嫩滑、色澤鮮亮、美觀、脂肪含量低,因此受到高級飯店和當?shù)厝说南矏踇10]。但是廣東省地處亞熱帶地區(qū),高溫、高濕的環(huán)境嚴重影響了家禽的生長性能和生產(chǎn)性能,導(dǎo)致養(yǎng)殖的經(jīng)濟效益下降。添加天然綠色的飼糧添加劑是緩解熱應(yīng)激對家禽造成影響的主要方法之一。

斑蝥黃是一種雙酮類胡蘿卜素,具有抗氧化能力。郭冠群[11]研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加斑蝥黃能提高蛋雞抗氧化酶活性,改善空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)。李俊等[12]研究發(fā)現(xiàn)斑蝥黃能提高海蘭褐蛋雞抗氧化能力。也有研究顯示飼糧中添加斑蝥黃可以顯著提高雛雞的抗氧化性能[13]。BONAMIGO等[14]研究發(fā)現(xiàn)在日糧中飼喂斑蝥黃可以使肉雞體質(zhì)量增加,胸肉產(chǎn)量更高,骨阻力增加。斑蝥黃作為一種新型抗氧化添加劑,能否在一定程度上改善懷鄉(xiāng)雞在熱應(yīng)激條件下小腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷,國內(nèi)尚未與相關(guān)報道。

因此,本試驗以懷鄉(xiāng)雞為實驗動物,通過在飼糧中添加不同濃度的斑蝥黃后,檢測小腸組織抗氧化酶含量、抗氧化相關(guān)基因的表達情況、腸道黏膜形態(tài)變化以及組織細胞凋亡情況,評估飼糧中添加斑蝥黃對抗熱應(yīng)激的作用效果。為斑蝥黃作為抗熱應(yīng)激添加劑在家禽生產(chǎn)上的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計216只健康狀況良好的26周齡雌性懷鄉(xiāng)雞,購自廣州喜迎珍禽養(yǎng)殖有限公司,隨機分為3個處理組,每組設(shè)置6個重復(fù),每個重復(fù)6只雞。適應(yīng)性飼養(yǎng)至28周開始進行溫度控制,試驗期為4周。試驗分組如表1所示,常溫對照組(NC)飼養(yǎng)于正常溫度(25±1)℃,飼喂基礎(chǔ)日糧;高溫對照組(HC)飼養(yǎng)于高溫環(huán)境(32±1)℃,采用循環(huán)高溫(8 h/d),飼喂基礎(chǔ)日糧;4個高溫處理組HT1(基礎(chǔ)飼糧+4 mg/kg斑蝥黃)、 HT2(基礎(chǔ)飼糧+6 mg/kg斑蝥黃)、HT3(基礎(chǔ)飼糧+8 mg/kg斑蝥黃)、HT4(基礎(chǔ)飼糧+10 mg/kg斑蝥黃)飼養(yǎng)于高溫環(huán)境(32±1)℃,采用循環(huán)高溫(8 h/d)。本試驗雞舍相對濕度均控制在55%～70%之間,飼糧添加所用斑蝥黃有效含量為10%,購于法國帝斯曼維生素貿(mào)易(上海)有限公司。

表1 試驗分組

1.2 試驗試劑總RNA提取試劑盒(RC101)購于南京諾唯贊生物科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(11119ES60)和熒光定量試劑盒(11202ES08)購于上海翊圣生物科技有限公司;TUNEL試劑盒(P1086)購于上海碧云天生物科技有限公司;ELISA試劑盒(P1066)購于江蘇酶免生物科技有限公司。

1.3 樣品采集于31周齡日,提前禁食12 h,隨機從每個重復(fù)中選取1只雞進行安樂死,解剖后采集十二指腸、空腸和回腸中段約2 cm左右的腸管,用預(yù)冷1×PBS清洗內(nèi)容物,將采集的組織樣品分為3部分。第1部分:在4%多聚甲醛溶液中固定,用于組織切片的制作;第2部分在電鏡液中固定,用于組織電鏡制作;第3部分用液氮快速冷凍后移至-80℃保存,用于后續(xù)的試驗分析。

參照《中華人民共和國專業(yè)標準》黃羽肉雞種雞的飼養(yǎng)標準,制定試驗基礎(chǔ)飼糧配方(表2)。

表2 試驗基礎(chǔ)飼糧配方 %

1.4 測定指標與方法

1.4.1小腸抗氧化指標的測定 將采集的樣品進行低溫研磨制備組織勻漿,離心后提取上清。參照江蘇酶免生物科技有限公司ELISA試劑盒說明書,測定小腸組織中丙二醛(MDA)、CAT、SOD、T-AOC和GSH-Px的含量。

1.4.2實時熒光定量PCR 參考南京諾唯贊生物科技有限公司RNA提取試劑盒步驟,提取十二指腸、空腸、回腸組織的總RNA,微量紫外分光光度計(中國,MB530)檢測RNA 樣品的純度和濃度后,參考上海翊圣生物科技有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成 cDNA ,于-20℃保存?zhèn)溆谩崟r熒光定量PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性10 s;60℃退火延伸30 s,循環(huán)40次。目的基因及內(nèi)參基因的詳細引物序列見表3,反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μL)見表4,熒光定量PCR反應(yīng)體系見表5。

表3 引物序列

表4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20 μL)

表5 熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.4.3腸絨毛超微結(jié)構(gòu)觀察 將固定好的十二指腸、空腸、回腸組織樣品送至武漢博爾夫生物技術(shù)公司進行超薄電鏡切片的制作,電鏡(HITACHIU8010,日立)下觀察小腸絨毛超微結(jié)構(gòu)。

1.4.4小腸細胞凋亡的測定 將制做好的小腸白片通過TUNEL染色法進行脫蠟染色,并使用DAPI復(fù)染細胞核,于尼康熒光倒置電子顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 斑蝥黃對高溫環(huán)境中成年懷鄉(xiāng)雞小腸抗氧化性的影響

2.1.1斑蝥黃對高溫環(huán)境中成年懷鄉(xiāng)雞小腸MDA含量的影響 由表6可知,高溫條件下,HC組中十二指腸、空腸、回腸黏膜MDA含量均顯著高于NC組(P<0.05);飼糧中添加斑蝥黃后,HT1、HT2、HT3、HT4組十二指腸、空腸、回腸黏膜中的MDA含量均顯著低于HC組(P<0.05);但是與NC組相比,HT1、HT2、HT3、HT4組MDA含量均未恢復(fù)到常溫水平。

表6 斑蝥黃對高溫環(huán)境中懷鄉(xiāng)雞小腸MDA含量的影響 nmol/g

2.1.2斑蝥黃對高溫環(huán)境中成年懷鄉(xiāng)雞小腸GSH-Px活性的影響 由表7可知,高溫條件下,HC組中十二指腸、空腸、回腸中的GSH-Px活性均顯著低于NC組(P<0.05);飼糧中添加斑蝥黃后,HT1、HT2、HT3、HT4組空腸、回腸中的GSH-Px活性均顯著高于HC組(P<0.05);但是與NC組相比,HT1、HT2、HT3、HT4組GSH-Px活性均未恢復(fù)到常溫水平。

表7 斑蝥黃對高溫環(huán)境中懷鄉(xiāng)雞小腸GSH-Px活性的影響 U/g

2.1.3斑蝥黃對高溫環(huán)境中成年懷鄉(xiāng)雞小腸T-AOC活性的影響 由表8可知,高溫條件下,HC組十二指腸、空腸、回腸中的T-AOC活性均顯著低于NC組(P<0.05);飼糧中添加斑蝥黃后,HT1組的十二指腸中的T-AOC活性顯著高于HC組(P<0.05),但是空腸和回腸中T-AOC活性與HC組相比,差異不顯著(P>0.05);而HT2、HT3、HT4組中十二指腸、空腸、回腸中的T-AOC活性均顯著高于HC組(P<0.05);但是與NC組相比,HT1、HT2、HT3、HT4組均未恢復(fù)到常溫水平。

表8 斑蝥黃對高溫環(huán)境中懷鄉(xiāng)雞小腸T-AOC活性的影響 U/g

2.1.4斑蝥黃對高溫環(huán)境中成年懷鄉(xiāng)雞小腸T-SOD活性的影響 由表9可知,高溫條件下,HC組十二指腸、空腸、回腸中的T-SOD活性均顯著低于NC組(P<0.05);飼糧中添加斑蝥黃后,HT1、HT2、HT3、HT4組十二指腸、空腸、回腸中的T-SOD活性顯著高于HC組(P<0.05);但是與NC組相比,HT1、HT2、HT3、HT4組均未恢復(fù)到常溫水平。

表9 斑蝥黃對高溫環(huán)境中懷鄉(xiāng)雞小腸T-SOD活性的影響 U/g

2.2 斑蝥黃對高溫環(huán)境中成年懷鄉(xiāng)雞小腸相關(guān)抗氧化基因表達的影響由圖1可知,與NC組相比,高溫環(huán)境下, HSP90AA1、CAT、GPX1和NFE2L2在十二指腸、空腸和回腸中表達也呈下調(diào)趨勢(P>0.05),但只有HSP90AA1在十二指腸中呈差異顯著下調(diào)(P<0.05);SOSTM1在十二指腸和空腸中差異顯著上調(diào)表達(P<0.05),在回腸中的表達呈上調(diào)趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。與HC組相比,飼糧中添加10 mg/kg斑蝥黃后,HSP90AA1、CAT、GPX1和NFE2L2在十二指腸、空腸和回腸中表達也呈上調(diào)趨勢,但差異不顯著(P>0.05);SOSTM1在十二指腸和空腸中差異顯著下調(diào)表達(P<0.05),在回腸中的表達呈下調(diào)趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。

A.HSP90AA1 mRNA表達量;B.CAT mRNA表達量;C.GPX1 mRNA表達量;D.NFE2L2 mRNA表達量;E.SOSTM1 mRNA表達量。*.P<0.05

2.3 小腸絨毛形態(tài)特征根據(jù)2.1的研究結(jié)果表明,飼糧中添加8～10 mg/kg斑蝥黃有效改善小腸的抗氧化能力。為了評估飼糧中添加斑蝥黃對腸道組織抗熱應(yīng)激的作用效果,通過掃描電鏡觀察小腸絨毛微結(jié)構(gòu)。

2.3.1十二指腸絨毛超微結(jié)構(gòu) 結(jié)果如圖2所示,常溫條件下,NC組十二指腸微絨毛排列相對緊密有序、微絨毛無斷裂。與NC組相比,HC組十二指腸微絨毛排列松疏間隙增大,并且伴有微絨毛斷裂;飼糧中添加斑蝥黃后,與HC組相比,腸絨毛斷裂程度有所改善;但與NC組相比,2個HT組十二指腸仍出現(xiàn)部分絨毛斷裂和萎縮,但由此可見,飼糧中添加8～10 mg/kg濃度斑蝥黃可以有效改善高溫造成的十二指腸結(jié)構(gòu)損傷,其中以8 mg/kg的濃度效果最佳。

圖2 十二指腸微絨毛電鏡圖

2.3.2空腸絨毛超微結(jié)構(gòu) 結(jié)果如圖3所示,常溫條件下,NC組空腸微絨毛排列相對緊密有序、無間隙、有少許脫落;與NC組相比,HC組空腸微絨毛疏松,間隙明顯增大,多數(shù)微絨毛斷裂且脫落。飼糧中添加斑蝥黃后,與NC組相比,2個HT組空腸仍出現(xiàn)部分微絨毛脫落和萎縮,但與HC組相比,微絨毛間隙減小,排列緊密,脫落面積減少。由此可見,飼糧中添加8～10 mg/kg斑蝥黃可以有效改善高溫造成的空腸結(jié)構(gòu)損傷,其中以10 mg/kg的濃度效果最佳,但無法恢復(fù)到正常狀態(tài)。

2.3.3回腸絨毛超微結(jié)構(gòu) 結(jié)果如圖4所示,常溫條件下,NC組回腸微絨毛之間排列緊密無斷裂,間隙較小,幾乎無脫落。與NC組相比,HC組回腸微絨毛排列松疏,間隙顯著增大,并且伴有微絨毛斷裂,較多微絨毛發(fā)生脫落;飼糧中添加斑蝥黃后,與NC組相比,2個HT組回腸仍出現(xiàn)部分絨毛斷裂和脫落,但與HC組相比,腸絨毛斷裂程度有所改善。由此可見,飼糧中添加8～10 mg/kg斑蝥黃可以有效改善高溫造成的回腸結(jié)構(gòu)損傷,其中以10 mg/kg的濃度效果最佳,但無法恢復(fù)到正常狀態(tài)。

2.4 TUNEL檢測懷鄉(xiāng)雞小腸組織細胞凋亡情況為了進一步驗證,斑蝥黃對小腸組織的損傷修復(fù)功能,通過TUNEL法檢測飼糧中添加8～10 mg/kg斑蝥黃后小腸組織的凋亡情況。

2.4.1十二指腸組織細胞凋亡情況 結(jié)果如圖5所示,與NC組相比,HC組十二指腸組織綠色熒光細胞數(shù)量最多;飼糧添加斑蝥黃后,與HC組相比,HT3、HT4組凋亡細胞數(shù)量明顯減少,尤其是10 mg/kg斑蝥黃添加組。

2.4.2空腸組織細胞凋亡情況 結(jié)果如圖6所示,與NC組相比,HC組空腸組織綠色熒光細胞數(shù)量最多,分布面積更大,綠色熒光區(qū)域更加集中;飼糧添加斑蝥黃后,與HC組相比,HT3、HT4組凋亡細胞數(shù)量明顯減少,10 mg/kg斑蝥黃添加組更為明顯。

圖6 空腸組織凋亡

2.4.3回腸組織細胞凋亡情況 結(jié)果如圖7所示,與NC組相比,HC組回腸組織綠色熒光細胞數(shù)量更多,熒光區(qū)域比較集中;飼糧添加斑蝥黃后,與HC組相比,HT3細胞凋亡數(shù)無明顯變化,分布面積較大,HT4組綠色熒光細胞數(shù)量明顯減少,10 mg/kg斑蝥黃添加組效果最佳。

3 討論

3.1 斑蝥黃對高溫環(huán)境下成年懷鄉(xiāng)雞小腸抗氧化性能的影響氧化應(yīng)激是動物體內(nèi)存在的過氧化物和自由基等活性氧和超過了其抗氧化緩沖能力而造成的[15]。家禽的氧化抗氧化系統(tǒng)相互作用,維持機體的氧化平衡,當家禽處于高溫條件下時,可以通過 SOD、GSH-Px、T-AOC 活性和 MDA 含量的變化評估機體氧化應(yīng)激的程度;在細胞中,MDA通過細胞脂質(zhì)過氧化破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能,引起蛋酶的活性進而被破壞,促使組織細胞凋亡[16]。GSH-Px廣泛存在于機體中,其作用是分解過氧化物,清除細胞產(chǎn)生的過氧化物和自由基,抑制組織器官的氧化應(yīng)激[17]。CAT是過氧化物酶的標志酶,在過氧化物酶體酶總量中占比最大,其抗氧化機理是催化過氧化氫分解成氧和水。高溫環(huán)境下,CAT的活性下降,抗氧化系統(tǒng)被破壞,無法及時清除大量自由基,打破了機體的氧化平衡,從而引起氧化應(yīng)激[18]。T-SOD是生物體系中抗氧化酶系的重要組成成員,它通過催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫,在機體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用[19]。張茜等[20]研究發(fā)現(xiàn)對成年羅曼蛋雞進行32～38℃的熱應(yīng)激后,高溫對照組的SOD、T-AOC和GSH-Px均低于常溫組,MDA高于常溫組。

本次研究發(fā)現(xiàn),高溫造成懷鄉(xiāng)雞十二指腸組織發(fā)生氧化應(yīng)激,MDA活性顯著升高,GSH-Px、CAT、T-SOD和T-AOC活性顯著降低;飼糧中添加斑蝥黃后,MDA含量顯著降低,而GSH-Px、CAT、T-SOD和T-AOC活性顯著升高,其中以添加10 mg/kg斑蝥黃效果最為明顯。同時,在飼糧中添加10 mg/kg斑蝥黃后,抗氧化相關(guān)基因SOS-TM1在十二指腸和空腸中差異顯著下調(diào)表達。由此證明高溫條件下斑蝥黃可以提高小腸的抗氧化性能?？梢?高溫打破了家禽氧化抗氧化平衡,降低了抗氧化酶活性,提高了脂質(zhì)過氧化物含量,本試驗研究結(jié)果與已發(fā)表論文研究結(jié)果一致,熱應(yīng)激會導(dǎo)致懷鄉(xiāng)雞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)降低抗氧化能力。

3.2 斑蝥黃對高溫環(huán)境下成年懷鄉(xiāng)雞小腸結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響小腸是消化食物和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所[21]。在本試驗中,電鏡結(jié)果顯示HC組十二指腸、空腸絨毛的長度不一,粗細不均勻,微絨毛斷裂較多,有不同程度的脫落,上皮細胞之間疏松有大小不一的間隙,添加斑蝥黃可以緩解高溫對其造成的損傷。高溫會導(dǎo)致家禽小腸屏障完整性喪失(或腸屏障功能障礙)導(dǎo)致腸通透性增加,發(fā)生腸漏,引起局部甚至全身的炎癥反應(yīng)[22]。有研究發(fā)現(xiàn)肉雞腸道受到高溫破壞時,會縮短絨毛和加深隱窩[23],這與本試驗研究結(jié)果一致。在高溫環(huán)境下,熱應(yīng)激會導(dǎo)致腸道氧化應(yīng)激和炎癥進而引起腸道形態(tài)改變和損傷。有研究發(fā)現(xiàn),熱應(yīng)激會使雌性仔雞空腸的絨毛高度和絨毛表面積均顯著降低[24]。SONG等[25]研究發(fā)現(xiàn)將肉雞每天處于10 h的33℃高溫環(huán)境中,連續(xù)20 d后,肉雞的空腸絨毛高度降低;本試驗前期的研究也發(fā)現(xiàn),高溫會破壞懷鄉(xiāng)雞小腸黏膜結(jié)構(gòu),使得小腸絨毛高度增加,隱窩深度加深。

3.3 斑蝥黃對高溫環(huán)境下成年懷鄉(xiāng)雞小腸組織細胞凋亡的影響有研究發(fā)現(xiàn)高溫環(huán)境可以增加小腸細胞凋亡從而阻礙消化器官的發(fā)育,影響腸道消化酶的活性,損害腸上皮細胞,從而破壞腸道的形態(tài)[26]。另外,高溫環(huán)境會加劇線粒體ETC的反應(yīng),導(dǎo)致ROS過量產(chǎn)生,從而引發(fā)氧化應(yīng)激,包括誘導(dǎo)的線粒體蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化和DNA損傷,最終促使細胞凋亡[27-29]。本試驗結(jié)果表明高溫環(huán)境促進懷鄉(xiāng)雞小腸組織細胞的凋亡。也有研究表明在飼糧中添加類胡蘿卜素可以減少仔雞十二指腸和空腸凋亡相關(guān)基因的表達[30]。本研究通過添加斑蝥黃緩解高溫環(huán)境下小腸組織細胞的凋亡。這些研究表明,高溫是導(dǎo)致小腸組織絨毛脫落、斷裂以及發(fā)生組織細胞凋亡的主要原因,并且組織細胞凋亡與機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激呈正相關(guān)[31]。