陳建閃,劉童通,孫子龍,牛瑞燕,劉 慈,王璟璐,馬海利,張 鼎

(山西農業(yè)大學 動物醫(yī)學學院,山西 太谷 030801)

鎘(Cd)是一種有毒的重金屬元素,通常與氧、氯和硫等元素結合形成無機化合物存在于自然界。Cd的高生物毒性、強生物富集性、難降解性等特性使Cd污染對農田生態(tài)系統(tǒng)的危害日漸嚴重[1-2]。Cd隨飲食的攝入而進入機體,在機體內的生物半衰期可達10～30年,這進一步造成肝臟、腎臟、肺臟、骨骼及腦等一系列重要器官的毒性損傷,同時引起消化、呼吸、神經、免疫和生殖等系統(tǒng)的功能破壞[3-4]。鋅是動物體生命活動的必需元素,可以促進動物體的生長發(fā)育、提高免疫功能和促進胃腸消化等。近年來,人們發(fā)現(xiàn)鋅可以對抗包括重金屬在內多種刺激引起的細胞毒性,發(fā)揮解毒作用[5]。N-乙酰半胱氨酸(NAC)為天然含硫氨基酸的衍生物,分子中具備含有活性的巰基基團,對各種內源性或外源性氧化損傷起到保護作用。近年的研究表明,NAC不但能夠消除自由基,提高機體的抗氧化應激能力,而且可以使趨化因子、炎性細胞因子以及黏附分子產生減少。此外,NAC還在機體的免疫狀態(tài)與細胞凋亡程序方面起到調節(jié)作用[6]。本研究以雞巨噬細胞為研究對象,采用體外試驗觀察Cd對雞巨噬細胞的毒性損傷和免疫功能的影響,并通過單獨或聯(lián)合添加Zn2+、NAC的方式探討其對Cd染毒巨噬細胞的保護作用及機制,為Cd中毒的預防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞肉雞巨噬細胞系(HD-11),由山西農業(yè)大學動物生理實驗室提供。

1.2 主要試劑及儀器流式細胞儀(BD,美國);熒光定量PCR儀(Bio-Rad,美國);共聚焦熒光顯微鏡(Olympus,德國)。FITC標記鬼筆環(huán)肽(40735ES75)購自翊圣生物科技有限公司;DAPI溶液(即用型)(C0065)購自索萊寶科技有限公司;qPCR試劑盒購自寶生物工程;Annexin V-EGFP/PI細胞凋亡檢測試劑盒(KGA101)、活性氧檢測試劑盒(KGT010-1)和細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(KGA603)均購自凱基生物;葡萄糖酸鋅、氯化Cd、NAC購自國藥集團。

1.3 方法

1.3.1細胞處理 用含10% FBS的DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)HD-11細胞于T25培養(yǎng)瓶,置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內。待細胞長滿培養(yǎng)瓶底部單層時,消化、傳代到6孔板或共聚焦專用玻底培養(yǎng)板中。待6孔板中的細胞長至80%、共聚焦專用玻底培養(yǎng)板中細胞長至50%時,棄去舊培養(yǎng)基,加入一定量新細胞生長液,再分別加入一定量CdCl2、Zn(C6H11O7)2、NAC存儲液組成不同的Cd2+、Zn2+、NAC組合,使終濃度Cd2+為20,50 μmol/L,Zn2+為20 μmol/L,NAC為500 μmol/L,置于細胞培養(yǎng)箱中孵育不同時間(6,12 h),收集細胞進行相關檢測。

收集用于共聚焦顯微鏡拍照觀察的細胞,共聚焦專用玻底培養(yǎng)板中不同濃度Cd2+、Zn2+、NAC組合處理細胞6 h后,棄掉舊的培養(yǎng)液,PBS洗滌細胞2次,備用;對用于流式檢測的細胞,6孔板中不同濃度Cd2+、Zn2+、NAC組合處理細胞6,12 h后,收集舊細胞培養(yǎng)液于5 mL EP管中,用無EDTA的胰蛋白酶消化并收集貼壁細胞,與舊培養(yǎng)液混合,2 000 r/min離心5 min,棄上清,用PBS懸浮細胞并轉移到新的1.5 mL EP管中,2 000 r/min洗細胞2次后離心5 min備用。

1.3.2細胞骨架蛋白染色觀察 取收集到的共聚焦專用玻底培養(yǎng)板內的細胞,用4%甲醛溶液固定細胞10 min,PBS清洗細胞3次,每次10 min,0.5% Triton X-100溶液透化處理5 min,PBS清洗細胞3次,每次10 min,取200 μL Phalloidin-FITC工作液覆蓋住培養(yǎng)板底部的細胞,室溫避光孵育30 min,PBS清洗細胞3次,每次5 min,加入200 μL濃度為100 nmol/L的DAPI溶液對細胞核進行復染30 s,PBS洗細胞1次,于細胞表面加入1滴Fluoromount-GTM水溶性封片劑,覆蓋細胞,共聚焦顯微鏡下進行熒光拍照,疊加處理細胞核以及骨架的照片,觀察熒光的分布狀態(tài),分析Cd2+、Zn2+、NAC及其組合對細胞骨架蛋白的影響。

1.3.3細胞活性氧(ROS)含量的檢測 取從6孔板內收集到1.5 mL EP管中的細胞,按照活性氧檢測試劑盒(KGT010-1)的說明操作,處理細胞后進行流式細胞儀檢測平均熒光強度,分析不同濃度Cd2+、Zn2+、NAC及其組合對細胞內ROS含量的影響。

1.3.4細胞線粒體膜電位(MMP)水平的檢測 取從6孔板內收集到1.5 mL EP管中的細胞,按照細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(KGA603)的說明操作,處理細胞后進行流式細胞儀檢測MMP下降的細胞數(shù),分析不同濃度Cd2+、Zn2+、NAC及其組合對MMP的影響。

1.3.5細胞凋亡率檢測 取從6孔板內收集到1.5 mL EP管中的細胞,按照Annexin V-EGFP/PI細胞凋亡檢測試劑盒(KGA101)的說明操作,處理細胞后在1 h內進行流式細胞儀檢測早、中、晚凋亡細胞的數(shù)量,分析不同濃度Cd2+、Zn2+、NAC及其組合對細胞凋亡率的影響。

1.3.6Real-time PCR檢測 利用TRIzol法提取用不同濃度Cd2+、Zn2+、NAC及其組合分別處理6,12 h后HD-11細胞的RNA,并反轉錄成cDNA。依據(jù)NCBI基因庫查找所需目標基因的mRNA序列,利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)。采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa公司,RR820A)試劑盒進行Real-time PCR,反應體系:SYBR Premix Ex Taq (2×) 5.0 μL,ROX Reference Dye(50×)0.2 μL,cDNA 1.0 μL,Primer-S 0.2 μL,Primer-A 0.2 μL,RNase-Free Water 3.4 μL。反應條件:預變性為95℃ 3 min;變性為95℃ 30 s;退火為56℃ 30 s;延伸為72℃ 20 s;總共擴增40個循環(huán)。溶解曲線部分反應條件為95℃ 15 s;60℃ 1 min;95℃ 15 s。將對照組模板的基因表達量(拷貝數(shù))設成“1”,分析其他試驗組基因的相對表達量。

表1 引物設計

2 結果

2.1 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細胞結構損傷的抑制作用Cd2+(20 μmol/L)、Zn2+(20 μmol/L)、NAC-(500 μmol/L)不同組合處理細胞6 h后,用FITC標記的鬼筆環(huán)肽染色細胞骨架。共聚焦顯微鏡拍照觀察可見,細胞培養(yǎng)基中不加入Cd2+,單獨或聯(lián)合加入 Zn2+、NAC,細胞骨架蛋白的結構沒有被破壞,單獨加入20 μmol/L Cd2+引起細胞骨架蛋白降解,胞質和胞核出現(xiàn)萎縮。細胞培養(yǎng)基中加入Cd2+的情況下,單獨加入Zn2+或NAC,骨架蛋白的破壞程度減弱,聯(lián)合添加Zn2+和NAC,骨架蛋白的破壞程度進一步減弱(圖1)。

圖1 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細胞骨架的影響

2.2 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細胞ROS產生的抑制作用流式細胞術檢測結果顯示,20,50 μmol/L Cd2+作用6 h,細胞中ROS含量迅速上升(P<0.01),且50 μmol/L Cd2+時ROS含量上升的較多,說明ROS含量與攻毒濃度成正相關(圖2A)。單獨或聯(lián)合加入Zn2+、NAC均可以顯著降低Cd染毒ROS含量(P<0.01),但聯(lián)合加入的作用比單獨加入更明顯(圖2A)。當作用細胞12 h時,20,50 μmol/L Cd2+染毒細胞中ROS含量均有所增加。細胞培養(yǎng)基中加入20 μmol/L Cd2+的情況下,單獨或聯(lián)合加入Zn2+、NAC均可以極顯著降低ROS含量(P<0.01),而且降低效果相近。細胞培養(yǎng)基中加入50 μmol/L Cd2+的情況下,單獨加入Zn2+顯著降低ROS含量(P<0.05),單獨加入NAC后ROS含量極顯著降低(P<0.01),聯(lián)合加入Zn2+和NAC后ROS進一步減少,均低于單獨使用Zn2+或NAC(圖2B)。

A．作用6 h細胞ROS含量;B．作用12 h細胞ROS含量。與對照組相比,#.P<0.05,##.P<0.01;*.P<0.05,**.P<0.01。下同

2.3 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細胞MMP水平的影響流式細胞術檢測結果顯示,20,50 μmol/L Cd2+作用6 h,細胞中MMP水平均降低,且50 μmol/L Cd2+時MMP降低的水平極顯著(P<0.01),說明Cd2+引起MMP降低的細胞數(shù)成濃度依賴性增加(圖3A)。單獨或聯(lián)合加入Zn2+、NAC,低濃度Cd染毒中MMP降低的細胞數(shù)顯著減少(P<0.05),而高濃度Cd染毒中MMP降低的細胞極顯著減少(P<0.01),且單獨加入NAC與聯(lián)合加入Zn2+和NAC的作用相近,均強于單獨加入Zn2+的作用(圖3A)。當作用細胞12 h,20 μmol/L Cd2+對MMP降低的細胞數(shù)變化不明顯,50 μmol/L Cd2+對MMP降低的細胞數(shù)極顯著增加(P<0.01)(圖3B)。單獨或聯(lián)合加入Zn2+、NAC可以顯著增加高濃度Cd染毒細胞的MMP水平(P<0.05),聯(lián)合添加Zn2+和NAC的效果比單獨添加其中的一種所產生的效果更明顯(圖3B)。

A．作用6 h細胞MMP水平;B．作用12 h細胞MMP水平

2.4 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細胞凋亡率的影響流式細胞術檢測結果顯示,細胞培養(yǎng)基中加入20,50 μmol/L Cd2+,細胞凋亡率隨Cd2+濃度增加和作用時間的延伸而升高。作用細胞6 h,單獨或聯(lián)合加入Zn2+、NAC時,低濃度Cd染毒細胞總的凋亡率顯著降低(P<0.05),且單獨加入NAC或聯(lián)合加入Zn2+和NAC對細胞凋亡率的效果相近。而高濃度Cd染毒細胞的凋亡率極顯著降低(P<0.01),聯(lián)合添加比單獨添加對Cd2+的抑制作用更明顯(圖4A)。當作用細胞12 h,單獨或聯(lián)合加入Zn2+、NAC時,低濃度Cd染毒細胞凋亡率均呈現(xiàn)極顯著的下降(P<0.01),且單獨加入NAC或聯(lián)合加入Zn2+和NAC時,細胞凋亡率相似,均高于單獨加入Zn2+的凋亡率。而高濃度Cd染毒細胞在單獨加入Zn2+或NAC時細胞凋亡率相似,聯(lián)合添加后細胞凋亡率進一步降低(圖4B)。

A．作用6 h細胞凋亡率;B．作用12 h細胞凋亡率

2.5 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細胞細胞因子基因表達的影響熒光定量PCR結果顯示,20,50 μmol/L Cd2+作用細胞6(圖5A)、12 h(圖5B)后,IL-1β基因的表達量均下降,其中作用相同時間,50 μmol/L Cd2+時IL-1β基因表達量進一步下降,而相同濃度的Cd2+,12 h時IL-1β基因表達量進一步下降,這說明Cd2+能夠引起IL-1β基因濃度—時間依賴性表達量下降。在培養(yǎng)基中加入Cd2+的情況下,單獨添加Zn2+或NAC,IL-1β基因表達量明顯增加。與Zn2+和NAC的單獨作用相比,兩者聯(lián)合添加后IL-1β基因表達量進一步增加,說明聯(lián)合加入Zn2+和NAC可以極顯著地提升IL-1β基因的表達水平(P<0.01)。50 μmol/L Cd2+作用細胞6 h,IL-8基因表達量顯著減少(P<0.01),單獨加入Zn2+或NAC能夠顯著提高Cd染毒細胞IL-8表達(P<0.05),聯(lián)合加入Zn2+和NAC后,IL-8基因表達量進一步上升(P<0.001)(圖5C)。50 μmol/L Cd2+作用細胞12 h后,單獨加入Zn2+,IL-8基因的表達量變化不明顯,單獨加入NAC,IL-8基因的表達量顯著上升(P<0.01),聯(lián)合加入Zn2+和NAC后,IL-8基因的表達量進一步上升,說明聯(lián)合添加Zn2+和NAC比單獨添加其中的一種對Cd2+的抑制作用明顯(圖5D)。20,50 μmol/L Cd2+作用細胞6 h(圖5E)和12 h(圖5F)后,IL-10基因的表達量下降。Cd2+作用細胞6 h時,單獨加入Zn2+能夠顯著提高IL-10表達(P<0.01),單獨加入NAC對IL-10基因的表達效果不明顯,聯(lián)合加入NAC和Zn2+后IL-10基因表達量進一步上升,且50 μmol/L Cd2+中基因表達量增加幅度比20 μmol/L的高,這說明NAC可以增強Zn2+對IL-10基因的調控作用(圖5E)。Cd2+作用細胞12 h時,單獨加入Zn2+后IL-10基因的表達量顯著上升(P<0.05),單獨加入NAC時50 μmol/L Cd2+中IL-10基因表達量極顯著上升(P<0.001),聯(lián)合加入Zn2+和NAC后IL-10基因表達量進一步上升(圖5F)。

A、C、E.作用6 h 相關細胞因子基因表達水平;B、D、F.作用12 h 相關細胞因子基因表達水平。與對照組相比,###.P<0.001,***.P<0.001。下同

2.6 Zn2+、NAC對Cd染毒巨噬細胞MT-1、MTF-1基因表達的影響熒光定量PCR結果顯示,細胞培養(yǎng)基中單獨加入Cd2+或Zn2+,作用細胞6(圖6A、C)和12 h(圖6B、D)后均可以引起MT-1和MTF-1基因表達量增加,而單獨加入NAC對MT-1和MTF-1基因表達量沒有明顯的促進作用。加入Cd2+的情況下,單獨加入Zn2+,2種基因的表達量進一步提高(6 hP<0.01,12 hP<0.05),單獨加入NAC,2種基因的表達量變化不明顯。與單獨添加Zn2+或NAC的促進作用相比,聯(lián)合添加Zn2+和NAC,MT-1、MTF-1基因的表達量極顯著增加,6 h時這種促進作用最明顯。

A、C.作用6 h MT-1、MTF-1基因表達水平;B、D.作用12 h MT-1、MTF-1基因表達水平

3 討論

3.1 Cd對雞巨噬細胞的毒性損傷Cd對多種細胞的生長和存活具有抑制作用,損傷機理涉及較多方面[7]。張鼎[8]用含有終濃度為10 μmol/L CdCl2的培養(yǎng)基處理牛腎臟上皮細胞,作用6 h后,ROS含量上升、MMP下降的細胞數(shù)均增多,細胞的凋亡率顯著升高。本研究參考之前的報道,前期預試驗分別用含有終濃度為10,20,50和100 μmol/L CdCl2的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HD-11細胞,在6,12 h時觀察細胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)作用細胞6 h后20 μmol/L CdCl2引起細胞形態(tài)損傷比較明顯,而50 μmol/L CdCl2對細胞形態(tài)造成顯著的損傷,故本研究分別選擇含有20,50 μmol/L CdCl2的細胞培養(yǎng)基建立雞巨噬細胞輕度和重度Cd中毒模型,在不同時間段(6,12 h)分別從細胞骨架、ROS含量、MMP水平、細胞凋亡率以及細胞IL-1β、IL-8、IL-10基因的轉錄水平這5個方面的影響進行檢測,探討Cd對雞巨噬細胞毒性損傷和免疫調控的機理。

Cd處理細胞6 h后,細胞骨架中纖維狀肌動蛋白(F-actin)結構破壞,蛋白斷裂、降解、模糊不清,使細胞核暴露,且損傷程度呈現(xiàn)濃度依賴性。說明F-actin結構的破壞是Cd引起細胞損傷的機制之一。本試驗從定量角度分析Cd對ROS含量的影響,結果顯示ROS含量隨著Cd濃度的增加而持續(xù)升高,引起細胞氧化損傷。原因是Cd離子不僅能直接促進ROS產生,還能通過降低還原性蛋白與抗氧化酶的活性間接調控ROS含量。首先,Cd破壞了線粒體呼吸鏈的正常運作,抑制線粒體的呼吸,導致ROS大量產生[9];其次,侵入機體的Cd與金屬硫蛋白(MT)、谷胱甘肽(GSH)等結合使蛋白失去還原性,間接促進ROS含量,使其在細胞內過量聚集[10-11]。同時抑制超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等的活性,提升丙二醛(MDA)的活性,細胞自由基代謝失衡,導致ROS在細胞內聚積[12]。如此,Cd通過這些方面增加了活性氧的含量,刺激細胞的氧化損傷,介導細胞凋亡。

線粒體是ROS產生的主要場所,據(jù)報道,微摩爾水平的Cd就能夠影響ROS含量,促進ROS產生,進而破壞線粒體,誘導細胞凋亡[13-14]。當Cd損傷了線粒體之后,ROS大量產生,反過來攻擊線粒體,兩者之間相互影響。而本研究選取MMP的變化來分析Cd的毒性作用。20,50 μmol/L的Cd處理雞巨噬細胞后用流式細胞儀檢測Cd引起MMP降低的細胞數(shù)量,發(fā)現(xiàn)隨著Cd濃度的增加,MMP降低的細胞數(shù)量也增多。結合該試驗結果可以說明Cd能夠通過損傷線粒體的途徑來加重對細胞的損傷程度。

據(jù)大量研究表明,Cd能夠誘導犬腎臟近端小管、小鼠胸腺細胞等眾多細胞發(fā)生凋亡[15]。LI等[16]報道,用5 μmol/L的Cd處理大鼠原代肝臟細胞,培養(yǎng)12 h后便可造成細胞核皺縮和破碎,嚴重時出現(xiàn)調亡小體。本研究檢測細胞的早凋和中、晚凋過程,以及總的凋亡率,顯示Cd主要影響細胞的中凋和晚凋過程,隨著Cd濃度與攻毒時間的延伸,細胞凋亡中期和晚期的凋亡率持續(xù)上升,且總的凋亡率也增加。Cd對細胞凋亡的作用機制涉及較多方面,比如本試驗中Cd對細胞骨架、ROS含量、線粒體的損傷以及巨噬細胞分泌白介素IL-1β、IL-8和IL-10能力的損傷均能夠促進細胞的凋亡,各個方面相互作用,開啟細胞的凋亡程序。

3.2 鋅對Cd毒性的拮抗作用添加適當濃度的鋅可以對細胞產生重要的保護作用,與鋅顯著的抗氧化作用有關[17],其中鋅可以抑制ROS過量產生以及MMP下降,這也是鋅抑制Cd毒性的機制之一[18-19]。本研究在HD-11細胞的培養(yǎng)基中單獨添加Cd或鋅孕育6,12 h,結果Cd、鋅均可以促進MT-1基因表達,與之前的報道相符。研究顯示,重金屬誘導MT-1產生其實是機體對外界應激源的刺激作出的回應,是自身的防御機制,通過增加MT-1的含量來抑制氧化損傷,同時拮抗應激源所產生的毒性[20]。而在Cd組中加入鋅之后,MT-1基因的表達量會明顯提升,這說明鋅可以提升細胞清除ROS的能力,避免線粒體損傷,抵抗Cd的毒性。同時,本研究結果還顯示細胞中單獨或聯(lián)合加入Cd和鋅,MTF-1基因表達水平的變化趨勢與MT-1基因相似,這說明巨噬細胞中MTF-1基因的表達可能會促進MT-1基因的表達。張鼎[8]研究證明Cd和鋅單獨或聯(lián)合處理牛腎臟上皮細胞能夠引起細胞MTF-1、MT-1基因不同程度的上調表達[8]。本研究結論中鋅對Cd毒性的拮抗機理與之前的報道相符。

研究表明,Cd染毒可降低巨噬細胞的吞噬能力、抗原提呈能力和細胞因子分泌能力,最終抑制機體對病原體的免疫應答[21-22],而適量濃度的鋅補充可以有效改善Cd對巨噬細胞的免疫損傷[23]。本研究也證實,Zn2+添加可以緩解細胞IL-1β、IL-8和IL-10基因表達量下降的趨勢,促進免疫調控。

3.3 NAC對Cd毒性的拮抗作用在相關的研究中,NAC作為一種抗氧化劑可以顯著降低 ROS水平,并保護細胞免受死亡[24-25]。本研究也證實在Cd攻毒巨噬細胞中添加500 μmol/L NAC可以抑制Cd對線粒體的損傷、減少ROS含量,進而阻止細胞發(fā)生過氧化反應,降低細胞的凋亡率。這可能與NAC的抗氧化性、增加抗氧化酶活性、以及直接結合Cd離子等有關。首先,直接抗氧化是NAC憑借自身的巰基氧化還原生物大分子中的二硫鍵,消除體內氧自由基,如羥自由基、次氯酸(HOCl)和H2O2等物質來保護生物大分子活性[26]。間接抗氧化是小分子的NAC進入細胞后脫去乙?；蔀楹铣蒅SH的前體,促使細胞合成GSH,清除能透過細胞膜并與DNA、氨基酸、蛋白質等多種細胞成分發(fā)生反應、損傷機體的過量氧自由基,調整氧化應激水平,降低ROS含量,抑制線粒體損傷。其次,NAC能增加CAT、GSH-Px、SOD等抗氧化酶的活性[27-28],阻止MDA的生成量增加,抑制ROS生成。同時,GSH能結合Cd離子,使有毒的Cd離子轉化為無毒的化合態(tài)Cd,抑制Cd的毒性,保護細胞自身完整性[29]。本研究結果顯示,NAC在一定條件下還能夠提高細胞中IL-1β、IL-8和IL-10基因的表達量,恢復巨噬細胞的免疫功能。此外,NAC與Zn2+聯(lián)合使用能夠促進Zn2+對MT-1和MTF-1基因的調控,具體機理需要進一步研究。