羅怡茜,李亞均,何凱鋒,張芝金,郭靈君,張德志,,李前勇,*

(1.西南大學 動物醫(yī)學院,重慶 榮昌 402460;2.重慶市獸醫(yī)科學工程研究中心,重慶 榮昌 402460)

酒糟是玉米、小麥、高粱等谷物釀造后的殘渣,是乙醇工業(yè)的一種副產(chǎn)物,營養(yǎng)價值十分豐富,蛋白質(zhì)、能量、磷和脂肪等物質(zhì)含量高[1-2],且因其產(chǎn)量巨大和價格低廉,無論在國內(nèi)還是國外,都廣泛被應用于各種動物養(yǎng)殖中[2-5]。用酒糟作為飼料添加物,常見添加量在10%～80%不等。研究表明,飼喂羔羊時,在日糧中添加DM 60%的干酒糟可溶物而不會影響干物質(zhì)采食量,且20%為最佳添加量[6]。MANTHEY等[7]的試驗表明,在限量飼喂日糧中加入50%的干酒糟代替草料可以保持小母牛的生長性能。多項研究表明,在飼草中加入適量的酒糟不影響甚至提高動物的生長性能[8-11]。一些養(yǎng)殖者飼喂牛、羊時,其酒糟在飼料中的比例經(jīng)常達到50%～70%,個別甚至超過80%,加之飼喂時間過長,牛、羊容易發(fā)生酒糟中毒。目前關于動物酒糟中毒的報道只有關于其病因、癥狀、病理變化、防治方法等方面,其酒糟中毒的機理尚不清楚。

腎臟是機體重要的代謝器官,研究表明,動物發(fā)生酒糟中毒時,其腎臟會腫脹變性、質(zhì)地變脆[12-13],因此,腎臟是鑒定動物酒糟中毒相關候選基因的重要器官。轉(zhuǎn)錄組測序是確定關鍵基因功能的重要手段。近期,轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)展迅速而且被廣泛應用于動物研究。本研究用榮昌本地山羊為模型動物,對照組按照《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T816-2004)推薦的山羊飼養(yǎng)標準飼喂,試驗組用酒糟代替日糧中75%蛋白質(zhì)和能量成分,試驗期為90 d。分別用生化法、ELISA法、轉(zhuǎn)錄組測序檢測山羊腎臟氧化指標、炎性指標、轉(zhuǎn)錄譜的變化,以探討高劑量酒糟飼喂對山羊腎損傷的機制,以期為動物酒糟中毒的預防和治療提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑RNAiso PlusAL61152A、TB Green?Premix Ex TaqTMⅠ IIAL92617A 、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA EraserAL21113A、RNAfreed-H2OAKG1198A 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;Goat 白細胞介素-1β(IL-1β)試劑盒BPE93040、Goat 白細胞介素-6(IL-6)試劑盒BPE93046、Goat 腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒BPE93092購自上海朗頓生物科技有限公司;谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒A005、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒A007-1、黃嘌呤氧化酶(XOD)測定試劑盒A002、總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒A001-1、總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒A015-2、總蛋白(TP)測定試劑盒A045-2-2購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗儀器Real-Time PCR擴增儀,購自美國Thermo SCIENTFIC公司;全自動雪花制冰機IMS-20,購自常熟市雪科電器有限公司;冷凍離心機,購自賽默飛世爾科技公司;Bio-RAD S1000TM96 PCR,購自美國Bio-RAD公司;恒溫培養(yǎng)箱 HPX-9082MBE,購自上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;Elixir/Rios純水儀,購自上海攬寶儀器設備有限公司;Infinite 200 Pro酶標儀,購自德國Tecan公司;分析天平AB104-N,購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗動物及樣品采集在重慶榮昌某山羊養(yǎng)殖場選取體質(zhì)量相近(14.16±1.30) kg、健康的本地山羊。隨機分為2組,每組3只。對照組按《肉羊飼養(yǎng)標準》(NY/T816-2004)推薦的山羊飼養(yǎng)標準飼喂;試驗組用酒糟代替日糧中75%蛋白質(zhì)和能量成分,試驗日糧組成見表1。90 d后,將羊頸動脈放血致死后取下腎臟,一部分用生理鹽水沖洗,另一部分用無水乙醇沖洗,分裝后放入液氮1 h后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平 %

1.4 腎臟組織炎性因子的檢測將腎臟組織從冰箱取出后,按ELISA試劑盒說明書進行IL-6、IL-1β、TNF-α含量的檢測。

1.5 腎臟組織氧化指標的檢測將腎臟組織從冰箱取出后,按試劑盒說明書進行T-SOD、CAT、GSH-Px、XOD、T-AOC含量的檢測。

1.6 轉(zhuǎn)錄組測序

1.6.1測序 將腎臟組織放入預冷的研缽中研磨成粉末,總RNA采用TRIzol(北京天根生化有限公司)方法提取。在1%瓊脂糖凝膠上檢測RNA降解和污染。RNA用Agilent 2100 Bioanalyzer(美國安捷倫技術(shù)公司,CA,美國)定量,用NanoDrop分光光度計(美國IMPLEN公司,CA,美國)評估質(zhì)量和完整性。樣品檢測合格后,各取1.5 μg的 RNA用于建庫測序。測序庫的構(gòu)建采用Illumina公司(Illumina,San Diego,USA)配套試劑盒。利用Oligo(dT)磁珠富集mRNA,加入裂解緩沖液將mRNA裂解成短片段。利用隨機六聚體合成第一鏈cDNA,利用緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶I合成第二鏈cDNA。為了優(yōu)選200～250 bp長度的cDNA片段,用AMPure XP系統(tǒng)純化文庫片段。純化后,對雙鏈cDNA進行末端修復,加入A,加入連接器。采用PCR擴增技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫。利用Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)對文庫質(zhì)量進行評價。由北京Allwegene科技有限公司(北京,中國)在Illumina Hiseq 4000平臺上對文庫進行測序,生成配對端150 bp的reads。

1.6.2測序數(shù)據(jù)質(zhì)控 測序后,用內(nèi)部perl腳本和Trimmomatic(v0.33)處理原始數(shù)據(jù)。去除有測序接頭(adapter)的reads、不確定堿基含量比例大于10%的reads和低質(zhì)量堿基(Q≤20)含量大于50%的reads。將質(zhì)控后的clean reads用STAR映射到山羊(capra-hircus)的參考基因組,“mismatch”參數(shù)通常設置為2,其他參數(shù)默認設置。

1.6.3差異表達基因分析 使用DESeq對讀計數(shù)的深度進行了修改,用負二項分布法計算P值,采用Benjamini和Hochberg法控制FDR(錯誤發(fā)現(xiàn)率)。當1個基因P<0.05時為差異基因。在差異基因中,如果基因的log2 Foldchange>0,則認為該差異基因是上調(diào),反之,若log2 Foldchange<0,認為該差異基因是下調(diào)。

1.6.4差異表達基因富集分析 用GOseq R包分析DEGS的基因本體富集分析,使用KOBAS (v2.0)軟件檢測差異表達基因在統(tǒng)計學上的富集KEGG通路。

1.6.5熒光PCR驗證 為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,以β-actin基因為內(nèi)參基因,隨機選取了ATP6、ND4、ND6、COX2、CYTB這5個基因進行實時熒光定量 PCR反應,采用2-ΔΔCT方法計算基因mRNA在組織中的表達量。在NCBI網(wǎng)站上查找相關基因序列送至上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司設計并合成引物(表2)。

表2 RT-qPCR引物序列信息

2 結(jié)果

2.1 高劑量酒糟飼喂對山羊腎臟組織氧化指標的影響試驗組與對照組各氧化指標結(jié)果見圖1。與對照組相比,試驗組XOD水平顯著低于對照組(P<0.05),CAT和GSH-Px水平差異不顯著,T-SOD和T-AOC水平極顯著低于對照組(P<0.01)。

2.2 75%酒糟飼喂對山羊腎臟組織炎癥因子的影響試驗組與對照組各炎癥因子結(jié)果見圖2。與對照組相比,試驗組各炎癥因子均表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05),其中試驗組IL-1β水平極顯著高于對照組(P<0.01),IL-6、TNF-α水平顯著高于對照組(P<0.05)。

A.GSH-Px、T-SOD表達水平;B.XOD、CAT表達水平;C.T-AOC表達水平。*.P<0.05;**.P<0.01。下同

A.IL-1β表達水平;B.IL-6、TNF-α表達水平

2.3 測序數(shù)據(jù)結(jié)果分析測序結(jié)果如表3所示,在對山羊腎臟的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測序和質(zhì)控后,得到了227 811 050條原始序列和215 653 142條有效序列。堿基平均錯誤率是0.03%,Q20、Q30分別超過97.00%,93.00%,GC含量所占比例為42.78%～48.14%。超過95.00%的有效序列被映射到山羊參考基因上,表明測序數(shù)據(jù)適合后續(xù)分析。

表3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測分析

2.4 差異表達基因(DEGs)篩選得到的差異基因結(jié)果如圖3所示,本次試驗中,共得到了546個差異基因,與對照組相比,試驗組共獲得385個上調(diào)基因和161個下調(diào)基因。圖4為差異基因聚類分析結(jié)果,表明試驗組(Shen-gjl)的整體基因表達譜與對照組(Shen-dz)相比差異較大。

圖3 差異表達基因分布趨勢的火山圖

圖4 差異基因的層次聚類的熱圖

2.5 GO 和 KEGG 通路富集GO數(shù)據(jù)庫總共有3大類,分別是生物學過程(biological process,BP)、細胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF),本試驗差異表達基因在3大類中的GO類別上均出現(xiàn)富集。前30條顯著富集到的GO條目如圖5所示,在生物過程中,富集的主要類別是電子傳遞鏈(electron transport chain)和呼吸電子傳遞鏈(respiratory electron transport chain);在分子功能中,主要類別是轉(zhuǎn)運活性(transporter activity)和跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性(transmembrane transporter activity);在細胞成分中,主要類別是膜的整體組成(integral component of membrane)和膜的固有成分(intrinsic component of membrane)。

圖5 差異表達基因富集分析中前30個GO條目

根據(jù)KEGG功能注釋,共確定了19條顯著富集的通路(P<0.05)(圖6),在試驗組和對照組的比較中,鑒定出的差異表達基因主要富集在生熱作用(thermogenesis)、帕金森病 (Parkinson disease)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)等通路中。

圖6 差異表達基因的KEGG富集分析

2.6 使用 qRT-PCR 驗證 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果準確性,挑選5個顯著表達的差異基因進行qRT-PCR驗證,結(jié)果如圖7所示,與對照組相比,試驗組所有基因表達均極顯著上調(diào)(P<0.01),這與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的趨勢一致,說明測序結(jié)果可靠。

A.ND6 mRNA相對表達量;B.ND4 mRNA相對表達量;C.ATP6、COX2、CYTB mRNA相對表達量

3 討論

作為一種常用的飼料添加物,酒糟在牛、羊養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展中起著至關重要的作用,據(jù)報道,2019年我國約生產(chǎn)各類酒糟總計2 518.85 t[14],酒糟中粗蛋白、粗脂肪、粗纖維和磷含量分別為27.9%,10.8%,7.4%和0.8%,其粗蛋白含量是玉米的2.68倍;粗脂肪是玉米的3.00倍,是豆粕的5.68倍,是菜粕的7.70倍;粗纖維是玉米的3.20倍,是豆粕的1.20倍[15]。但過量添加可以造成牛羊發(fā)生中毒,其致病和損傷的機制還不清楚。本研究為探索高劑量酒糟飼喂對山羊腎損傷的機制,用ELISA法、生化法檢測山羊腎臟氧化指標、炎性因子的變化,然后用轉(zhuǎn)錄組測序篩選與其相關的差異表達基因與通路,進而研究高劑量酒糟飼喂對山羊腎損傷的機制。

氧化應激是由于氧化劑生成異常增加導致內(nèi)源性抗氧化劑相對不足而引起的消耗性代謝失調(diào),最終導致重要細胞成分發(fā)生氧化損傷[16]。據(jù)文獻報道,氧化應激能導致腎臟發(fā)生多種疾病,如糖尿病、慢性腎衰竭、腎癌等[17-19]。機體自身的抗氧化防御體系,能切斷脂質(zhì)鏈式反應,避免自由基產(chǎn)生過剩,維持機體氧化穩(wěn)定,減少細胞氧化損傷。SOD、CAT、GSH-Px、銅藍蛋白、維生素和尿酸等都是機體抗氧化防御體系的組成部分[20-21]。XOD是體內(nèi)核酸代謝中的重要酶,它可以催化體內(nèi)嘌呤化合物的氧化,最后形成尿酸,從而產(chǎn)生大量的自由基,導致細胞結(jié)構(gòu)破壞和功能障礙[22-23];SOD將超氧化物陰離子轉(zhuǎn)化為相對穩(wěn)定的H2O2;CAT將H2O2還原為H2O;GSH-Px 通過防止過氧化氫氧化而起到防止細胞氧化損傷的重要作用[24],三者能有效清除體內(nèi)過多的自由基[25-26];T-AOC是衡量機體抗氧化能力綜合指標,其反映了非酶抗氧化防御系統(tǒng)的活性和抗氧化酶的水平[27]。KONG等[28]的研究表明草魚(Ctenopharyngodonidellus) 肝臟T-SOD隨干酒糟可溶物的添加量的增加呈下降趨勢(P<0.05)。研究發(fā)現(xiàn),連續(xù)給大鼠灌胃8周乙醇,大鼠睪丸中黃嘌呤氧化酶(XO)活性降低[29]。李華磊等[30]研究表明在肉雞飼糧中添加15%玉米干酒糟及其可溶物會降低肉雞血清中T-AOC活性,本試驗結(jié)果與其一致,也與本試驗轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致,說明飼喂75%酒糟會使山羊腎臟抗氧化系統(tǒng)失調(diào),產(chǎn)生氧化應激。

炎癥是機體對有害刺激物的防御反應,與機體營養(yǎng)健康之間有著密切的聯(lián)系,這種反應可以減輕感染、清除損傷細胞、啟動組織修復。炎癥與許多疾病有關,包括感染性和自身免疫性疾病,各臟器和腫瘤疾病[31-32]。慢性炎癥中巨噬細胞激活因子激活巨噬細胞長期且低量的分泌TNF-α、IL-1β等細胞因子以維持炎癥的發(fā)展[33]。TNF-α是炎癥早期產(chǎn)生的促炎因子,可以導致發(fā)熱,刺激內(nèi)皮細胞釋放大量炎性因子和促進中性粒細胞黏附到上皮細胞,進而導致機體產(chǎn)生局部炎性反應[34-35]。IL-1β是一種由大腦中的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞、星型膠質(zhì)細胞和外周多種免疫細胞產(chǎn)生和釋放的重要的促炎細胞因子,可誘導炎癥,促進黏附分子的分泌和多種炎癥因子產(chǎn)生,是體內(nèi)誘導作用最強的炎癥介質(zhì)之一[35-36]。IL-6由T淋巴細胞在IL-1和TNF-α的誘導下分泌的免疫調(diào)節(jié)因子,其參與炎癥反應及造血過程等,在機體的抗感染免疫中起重要作用[36-38]。TNF-α、IL-1β、IL-6均屬于機體的促炎因子,可反映出機體的炎性程度,因此,通過檢測三者含量可反映機體的基本炎癥狀況。李華磊等[30]研究表明在肉雞飼糧中添加15%玉米干酒糟及其可溶物肉雞血清中IL-6含量顯著上升;CHEN等[39]的研究表明保育豬飼喂 30%玉米酒糟及其可溶物的日糧3周會增加結(jié)腸組織中TNF-α的水平;WEBER等[40]給斷奶豬飼喂含有7.5%干酒糟可溶物的日糧,發(fā)現(xiàn)在日糧中添加7.5%干酒糟可溶物會增加回腸組織中IL-6和IL-1β mRNA的相對豐度。本研究結(jié)果與其趨勢相似。表明用75%酒糟飼喂山羊會使山羊腎臟免疫系統(tǒng)受到刺激,從而出現(xiàn)炎癥反應。

分析顯著富集到的3條信號通路發(fā)現(xiàn)共富集到21個相同的差異基因,這21個基因在NCBI中有注釋的主要可以分為3類:NADH脫氫酶、細胞色素c氧化酶、ATP合酶。同時分析GO富集中的差異基因,發(fā)現(xiàn)生物過程中差異基因主要富集在電子傳遞鏈和呼吸電子傳遞鏈。氧化磷酸化是在細胞中產(chǎn)生的一系列氧化還原反應,是有氧呼吸的標志,其分解糖、脂、氨基酸等的最終產(chǎn)物是ATP[41]。線粒體電子傳遞鏈在一系列電子傳遞反應下通過氧化磷酸化產(chǎn)生細胞ATP,其提供細胞生存所需約95%的能量[42-43],如圖8所示,真核生物電子傳遞鏈中的氧化磷酸化系統(tǒng)由5種酶組成:NADH-泛醌氧化還原酶(復合物I)、琥珀酸-泛醌氧化還原酶(復合物Ⅱ)、泛醇-細胞色素c氧化還原酶(復合物Ⅲ,或細胞色素bc1復合物)、細胞色素c氧化酶(復合物Ⅳ)和ATP合酶(復合物Ⅴ)[44-45]。NADH脫氫酶是電子傳遞鏈的“入口酶”,催化電子從NADH轉(zhuǎn)移到電子鏈,是電子傳遞鏈的第一步,在能量代謝中起著至關重要的作用[46-48]。細胞色素C氧化酶是線粒體呼吸鏈末端的限速酶[49],通過其催化核心中存在的4種氧化還原活性金屬輔因子催化電子從細胞鐵色素c轉(zhuǎn)移到分子氧,是呼吸鏈中唯一能夠直接與氧作用,將氧還原成水的復合物[50-51],對有氧能量的產(chǎn)生有關鍵作用[52]。ATP合酶是多個蛋白亞單位組成的蘑菇狀結(jié)構(gòu)寡聚復合物,由F1水溶性部分和Fo組成,是細胞生物能量機制的關鍵參與者。其F1部分承擔ATP合酶的催化活性,Fo部分嵌在線粒體內(nèi)膜中形成跨膜離子通道。F1γ亞基轉(zhuǎn)動時依次接觸3組αβ單元中的β亞基,使β亞基的構(gòu)象進行規(guī)律性、循環(huán)變化,γ亞基每旋轉(zhuǎn)360度就合成3個分子的ATP 。ATP合酶逆向轉(zhuǎn)動時,ATP被水解成ADP和Pi[53-55]。研究表明酒精通過多種機制使腎臟產(chǎn)生自由基并導致腎臟氧化應激[56]。本研究通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)腎臟的氧化磷酸化系統(tǒng)中的NADH 脫氫酶、細胞色素c氧化酶、ATP 合酶表達量明顯差異,這說明飼喂75%酒糟會使山羊腎臟發(fā)生氧化應激,這與ABOUEL等[57]、李華磊等[30]的研究結(jié)果一致。此外,轉(zhuǎn)錄組測序也發(fā)現(xiàn)差異基因富集于NF-κB信號通路、JAK-STAT信號通路、MAPK信號通路等炎癥通路中。這與本研究前面的研究結(jié)果一致,表明75%酒糟飼喂山羊會使山羊腎臟免疫系統(tǒng)受到刺激。

圖8 氧化磷酸化反應