尤桂春,蔡錦玲,藍(lán)波妙,武競(jìng)超,林文忠,陳品品,劉燦洪,梁超凡

(泉州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,福建晉江,362212)

在食品工業(yè)中,為防止食品中病原微生物的生長(zhǎng),往往需要添加防腐劑。有研究發(fā)現(xiàn),植物精油的抗菌效果顯著,可做為天然防腐劑代替合成化學(xué)添加劑用于食品防腐,且更安全、無(wú)毒,人體很容易被耐受[1]。在柑桔中,檸檬類果實(shí)的加工比例較高[2]。檸檬精油是檸檬兩大加工產(chǎn)品之一[3],其附加值高,在食品、日用品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用[4-11]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)檸檬果皮精油[12-17]和葉片精油[18-20]的化學(xué)成分及生物活性展開了研究。柑桔植株在種植的過(guò)程中,往往會(huì)根據(jù)栽培需求,每年疏剪掉大量枝條和果,且被視為廢物而遺棄。檸檬類果樹北京檸檬(Citruslimon)原產(chǎn)于我國(guó),適應(yīng)性廣、耐濕熱和較耐寒等特點(diǎn),在我國(guó)有一定量的栽培,但關(guān)于北京檸檬精油的研究報(bào)道較少。本研究采用水蒸氣蒸餾法分別提取北京檸檬葉片、枝干和果皮的揮發(fā)油,利用GC-MS技術(shù)進(jìn)行化學(xué)成分分析和比較,并分別對(duì)3種食源性細(xì)菌進(jìn)行了抑菌活性研究,以期為北京檸檬的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)材料來(lái)源于福建省泉州市國(guó)家農(nóng)業(yè)科技園區(qū)果蔬園檸檬良種篩選圃內(nèi)長(zhǎng)勢(shì)良好的6年生北京檸檬植株。

丙酮:分析純,太倉(cāng)滬試試劑有限公司。無(wú)水乙醇:分析純,常熟市鴻盛精細(xì)化工有限公司。牛肉膏蛋白胨:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)型精油提取機(jī)組(JYT-20L):上海矩源機(jī)械設(shè)備有限公司。低溫冷卻液循環(huán)泵(DLSB-5/20):杭州庚雨儀器有限公司。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890B-5977B):安捷倫科技(中國(guó))有限公司。色譜柱:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。凈化工作臺(tái)(SW-CJ-2D):蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司。恒溫培養(yǎng)搖床(SPH-200B):上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。生化培養(yǎng)箱(SPX-150BE):邦西儀器科技(上海)有限公司?？茖W(xué)型超純水機(jī)(ELGA PURELAB Classic DI):威立雅環(huán)境集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 于2020年10月下旬,選取6年生北京檸檬植株3株采集樣品。葉片和枝干采集位置為植株?yáng)|、南、西、北、中五個(gè)方位,剪取1～2年生枝條,采集葉片和枝干。果實(shí)采集位置為樹冠外圍中部,選轉(zhuǎn)色后的正常果實(shí),削取果皮(含白色海綿層)。

1.3.2 精油提取 各樣品采用水蒸氣蒸餾法提取精油。取樣品1.0 kg(鮮質(zhì)量),設(shè)置蒸餾溫度105 ℃、鍋爐溫度110 ℃、蒸餾時(shí)間2.5 h,提取的精油避光保存。精油出油率(%)=(精油質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100。

1.3.3 GC-MS分析[21]GC條件:進(jìn)樣口溫度250 ℃,載氣為氦氣(99.999%),恒定流量0.8 mL/min,進(jìn)樣體積1.0 μL,分流比10∶1。升溫程序:初始溫度45 ℃保持2 min,以20 ℃/min升至280 ℃并保持3 min。

MS條件:4級(jí)桿溫度150 ℃,離子源溫度250 ℃,電離方式為EI電離,電子能量70 eV,掃描范圍50～600 m/z,溶劑延遲時(shí)間5 min;SCAN掃描采集。

根據(jù)得到的總離子流圖,利用計(jì)算機(jī)對(duì)各峰進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索和NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),并用峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)百分含量。

1.3.4 菌懸液制備 大腸埃希氏菌Escherichiacoli(ATCC25922)和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC6538)來(lái)自上海保藏生物技術(shù)中心,傷寒沙門氏菌Salmonellatyphi(FSCC215009)來(lái)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。細(xì)菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上活化培養(yǎng),用無(wú)菌水配制成(1～10)×106CFU/mL的菌懸液[22],備用。

1.3.5 抑菌活性測(cè)定 抑菌圈大小測(cè)定:采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈大小[23]。待培養(yǎng)皿中的固體培養(yǎng)基冷卻凝固后,吸取100 μL菌懸液,注于固體培養(yǎng)基表面,使用無(wú)菌三角涂布棒將菌懸液涂抹均勻,再用含有6 μL樣品精油、直徑約6 mm的無(wú)菌濾紙片輕輕貼于培養(yǎng)基表面,用不含樣品精油的濾紙片做對(duì)照,培養(yǎng)皿用封口膜密封后,以倒放的形式置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑,計(jì)算平均值。每處理重復(fù)3次。

最低抑菌濃度測(cè)定:用丙酮作為溶劑,配制所需梯度濃度的樣品精油溶液。待培養(yǎng)皿中固體培養(yǎng)基冷卻凝固后,吸取100 μL菌懸液均勻涂抹于固體培養(yǎng)基表面,平板分為4個(gè)區(qū)域,用直徑6 mm、厚度0.7 mm的無(wú)菌濾紙片分別蘸取濃度為0.725%、1.5%、3%、6%的樣品精油溶液,然后輕輕貼于培養(yǎng)基表面4個(gè)區(qū)域內(nèi),以濃度為9%、12%和25%的樣品精油溶液作為補(bǔ)充,用蘸取丙酮的濾紙片作為對(duì)照,培養(yǎng)皿用封口膜密封后,以倒放的形式置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,觀察抑菌現(xiàn)象。以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低精油濃度作為該菌種的最低抑菌濃度[23]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位精油的出油率

試驗(yàn)結(jié)果表明,利用水蒸氣蒸餾法提取,北京檸檬新鮮葉片、枝干和果皮的出油率分別為0.308%、0.076%和0.091%,相互間差異顯著(p<0.05);葉片精油出油率是枝干的4倍,是果皮的3倍多。

2.2 不同部位精油的成分

經(jīng)HP-5MS安捷倫色譜柱分離,MS檢測(cè),得出3個(gè)部位精油的總離子流色譜圖(見(jiàn)圖1)。結(jié)合計(jì)算機(jī)對(duì)各峰經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索和NIST 2014標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),3個(gè)部位提取的精油共鑒定出38種化學(xué)成分,其中,葉片23種,枝干21種,果皮29種。

圖1 北京檸檬3個(gè)部位精油的總離子流色譜圖

利用峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)百分含量,結(jié)果見(jiàn)表1和表2。從葉片、枝干和果皮精油中鑒定出的化合物分別占精油總量的98.80%、99.66%和99.99%。在3個(gè)部位提取的精油中,萜烯類化合物20種,醇類化合物8種,酯類化合物2種,醛類化合物3種,酮類化合物1種,烷烴類化合物1種,酚類化合物1種,其他化合物2種。葉片精油以萜烯類、醛類和醇類占主要部分,達(dá)到93.97%;還含有脂類(4.47%)和烷烴類(0.36%)。枝干精油以萜烯類、酯類和醛類為主,達(dá)到93.17%,還含有醇類(6.49%)。果皮精油以萜烯類、醇類和酚類為主,達(dá)到93.18%,還含有脂類(0.32%)、醛類(3.20%)、酮類(0.57%)和其他(2.72%)。不同部位精油成分類別由多到少為果皮>葉片>枝干。3個(gè)部位精油均以萜烯類化合物相對(duì)含量最高,為68.29%～72.91%。

表1 北京檸檬植株不同部位的精油成分及相對(duì)含量

表2 北京檸檬植株不同部位精油的成分類別相對(duì)含量 %

3個(gè)部位精油的共有成分15種:d-檸檬烯、香茅醛、3-蒈烯、芳樟醇、檸檬醛、(E)-3,7-二甲基八-2,6-二烯基碳酸乙酯、β-月桂烯、β-欖香烯、β-水芹烯、石竹烯、香茅醇、紫蘇醇、α-松油醇、γ-松油烯、4-萜烯醇。這15種成分的相對(duì)含量分別占葉片、枝干和果皮精油的93.05%、92.30%和78.82%。3個(gè)部位精油的各共有成分相對(duì)含量有差異。如:d-檸檬烯是精油中最主要的成分,在精油中的相對(duì)含量為51.23%～53.03%。香茅醛在葉片和枝干中含量較為豐富,分別為10.42%和8.41%;在果皮中含量較少,為0.64%。在3個(gè)部位精油中,(E)-3,7-二甲基八-2,6-二烯基碳酸乙酯和γ-松油烯的相對(duì)含量差異也較大,分別為7.53%(枝條)～0.32%(果皮)和7.60%(果皮)～0.51%(葉片)。

葉片精油特異成分為α-法呢烯、(3E,7E)-4,8,12-三甲基十三-1,3,7,11-四烯、2-亞甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯基-雙環(huán)[5.2.0]壬烷,共3種,相對(duì)含量達(dá)2.70%。

枝干精油特異成分為(+)-β-芹子烯、α-雪松烯、β-松油烯,共3種,相對(duì)含量達(dá)1.34%。

果皮精油特異成分為丁香烯環(huán)氧化物、順式-α-香檸檬烯、α-側(cè)柏烯、2-乙烯基-1,3,3-三甲基環(huán)己烯、萜品油烯、p-薄荷-1(7),8-二烯-2-醇、順式-對(duì)薄荷-2,8-二烯-1-醇、α,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-乙醛、(S)-3-甲基-6-(1-甲基乙烯基)-2-環(huán)己烯-1-酮、百里酚、1-烯丙基-2-甲苯、2-異丙基-1-甲氧基-4-甲基苯,共12種,相對(duì)含量占19.20%。果皮精油特異性成分?jǐn)?shù)量最多,且特異性成分相對(duì)含量最高。

以3個(gè)部位精油共有色譜峰的峰面積作相關(guān)分析,進(jìn)行3個(gè)部位精油相似度評(píng)價(jià),結(jié)果葉片和枝干精油的相關(guān)系數(shù)為0.993,葉片和果皮精油的相關(guān)系數(shù)為0.961,枝干和果皮精油的相關(guān)系數(shù)為0.962,即葉片和枝干精油的相似度較近。

2.3 精油抑菌活性

2.3.1 抑菌圈大小 通過(guò)測(cè)定3個(gè)部位精油對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌的抑菌圈直徑大小,比較3個(gè)部位精油分別對(duì)這3種細(xì)菌的抑菌效果,結(jié)果見(jiàn)表3。3個(gè)部位精油對(duì)3種細(xì)菌均有一定的抑制活性;對(duì)同一細(xì)菌而言,不同部位精油間的抑菌圈直徑差異顯著。在抗菌素抑菌圈試驗(yàn)中,抑菌圈直徑大于15 mm時(shí)為高度敏感,10～15 mm時(shí)為中度敏感,7～9 mm時(shí)為低度敏感,無(wú)抑菌圈者為不敏感[22]。由此可見(jiàn),葉片精油對(duì)3種細(xì)菌的抑菌圈直徑均大于15 mm,屬高度敏感;枝干精油對(duì)金黃色葡萄球菌屬高度敏感,對(duì)大腸埃希氏菌和傷寒沙門氏菌屬中度敏感;果皮精油對(duì)金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌屬高度敏感,對(duì)大腸埃希氏菌屬中度敏感。不同部位精油對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性為葉片精油>果皮精油>枝干精油,對(duì)傷寒沙門氏菌屬抑菌活性為果皮精油>葉片精油>枝干精油。

表3 北京檸檬植株不同部位精油對(duì)3種細(xì)菌的抑菌圈直徑 mm

2.3.2 最低抑菌濃度(MIC) 3個(gè)部位精油對(duì)大腸埃希氏菌最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。當(dāng)葉片精油濃度為1.50%時(shí),不產(chǎn)生抑菌圈;當(dāng)濃度為3%時(shí),濾紙片周圍產(chǎn)生抑菌圈。可見(jiàn),葉片精油對(duì)大腸埃希氏菌的最低抑菌濃度所處區(qū)間為1.50%～3%。相應(yīng)地,枝干精油對(duì)大腸埃希氏菌的最低抑菌濃度所處區(qū)間為6%～9%,果皮精油對(duì)大腸埃希氏菌的最低抑菌濃度所處區(qū)間為3%～6%。葉片精油對(duì)大腸埃希氏菌的最低抑菌濃度最小。

注:0:對(duì)照;1:精油濃度6%;2:精油濃度3%;3:精油濃度1.50%;4:精油濃度0.75%;5:精油濃度25%;6:精油濃度12%;7:精油濃度9%。圖3至圖4同。圖2 北京檸檬3個(gè)部位精油對(duì)大腸埃希氏菌的最低抑菌濃度測(cè)定

由圖3可知,對(duì)金黃色葡萄球菌,葉片精油濃度≤1.50%時(shí)不能產(chǎn)生抑菌圈,當(dāng)濃度達(dá)到3%時(shí)出現(xiàn)抑菌圈,葉片精油的最低抑菌濃度所處區(qū)間為1.50%～3%;枝干和果皮精油的最低抑菌濃度所處區(qū)間均為3%～6%。葉片精油對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度最小。

圖3 北京檸檬3個(gè)部位精油對(duì)金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度測(cè)定

由圖4可知,對(duì)傷寒沙門氏菌,葉片和枝干精油的最低抑菌濃度所處區(qū)間均為3%～6%,果皮精油的最低抑菌濃度所處區(qū)間為0.75%～1.50%。果皮精油對(duì)傷寒沙門氏菌的最低抑菌濃度最小。

圖4 北京檸檬3個(gè)部位精油對(duì)傷寒沙門氏菌的最低抑菌濃度測(cè)定

3 小結(jié)與討論

對(duì)北京檸檬葉片、枝干和果皮3個(gè)部位精油出油率進(jìn)行比較的結(jié)果顯示,出油率由大到小為葉片>果皮>枝干。通過(guò)GC-MS分析,3個(gè)部位精油共鑒定出38種成分,葉片精油成分有23種,枝干精油成分有21種,果皮精油成分有29種;3個(gè)部位精油共有成分為15種,特異性成分分別為3種、3種和12種,3個(gè)部位精油成分差異明顯;對(duì)3個(gè)部位精油共有成分進(jìn)行相關(guān)性分析,相似度為0.993～0.961,葉片和枝干精油的相似度較近。以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和傷寒沙門氏菌3種食源性細(xì)菌為對(duì)象,測(cè)定3個(gè)部位精油的抑菌圈大小和最低抑菌濃度。結(jié)果表明3個(gè)部位精油均有一定的抑菌活性,其中,葉片精油對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性最強(qiáng),抑菌圈直徑最大,最低抑菌濃度最小(1.50%～3%);果皮精油對(duì)傷寒沙門氏菌的抑菌活性最強(qiáng),抑菌圈直徑最大,最低抑菌濃度最小(0.75%～1.50%)。

北京檸檬葉片、枝干和果皮3個(gè)部位精油最主要的成分均為d-檸檬烯,相對(duì)含量分別為52.85%、53.03%和51.23%。d-檸檬烯具有令人愉快的檸檬香氣,具有抗炎、抗腫瘤和鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用,以及具有殺蟲、殺螨、殺菌和消炎止痛等多種生物活性,對(duì)人、畜安全無(wú)害,近年來(lái)在醫(yī)藥工業(yè)和農(nóng)藥領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[24-26]。3個(gè)部位精油均含有具有殺蟲驅(qū)避、抑菌抗菌、抗氧化、治療心血管疾病和抗白血病等功效的檸檬醛[27-28],均含有具強(qiáng)效的抗炎活性,在醫(yī)藥上開始應(yīng)用的β-月桂烯[29-30]。香茅醛為葉片和枝干精油的主要成分(相對(duì)含量分別為10.42%和8.41%),其具有檸檬香氣,以及殺蟲、抑菌活性,常用來(lái)制作香精、驅(qū)蟲劑和防腐劑[31-33]。3-蒈烯為葉片和枝干精油的重要成分(相對(duì)含量5.39%),其可作為食品用香料,也作為合成香料、藥物和農(nóng)藥或相應(yīng)中間體的原料[34-35]。百里酚為果皮精油的主要成分(相對(duì)含量12.81%),其具有抗氧化、抗炎、局部麻醉和殺菌等活性,對(duì)多種食源性致病菌有很強(qiáng)抑制作用,也用于驅(qū)蚊的商業(yè)配方中[36-37]。γ-松油烯也為果皮精油的主要成分(相對(duì)含量7.60%),其具有抗氧化、抑菌和抗肝癌細(xì)胞活性的作用[38-39]。可見(jiàn),北京檸檬葉片、枝干和果皮精油在香料、醫(yī)藥和防治農(nóng)業(yè)害蟲等方面具有廣闊的開發(fā)前景;不同部位精油活性成分含量差異較大,在對(duì)其開發(fā)利用時(shí),應(yīng)考慮各自優(yōu)勢(shì),合理利用。