陳華蕊,何書強,李洪立,黨志國,朱 敏,馮振翠,楊子琴,陳業(yè)淵

(1 中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所,海口,571101;2 中國熱帶農業(yè)科學院三亞研究院,海南三亞,572025)

火龍果是仙人掌科(Cactaceae)量天尺屬(Hylocereusundatus)肉莖植物,是一種原產于哥倫比亞等中美洲的熱帶沙漠地區(qū)的熱帶水果,也是我國南方地區(qū)重要的特色精品水果之一,已被許多熱帶亞熱帶地區(qū)作為特色水果產業(yè)發(fā)展,同時取得顯著的經濟效益和社會效益[1-2]。我國海南、廣西、廣東、臺灣等地近十年來也對火龍果進行了廣泛商業(yè)化種植。火龍果果實營養(yǎng)豐富、功能獨特,含有豐富的維生素和水溶性膳食纖維,特別是紅皮紅肉型火龍果富含花青素、甜菜苷等天然色素,以及豐富的B族維生素、水溶性膳食纖維和植物白蛋白,具有防癌、抗氧化、增強免疫力等多種功效[3]。因此該類型的火龍果深受國內外種植者和消費者的歡迎。

“金都一號”火龍果是2015年中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所從臺灣引進的紅皮紅肉型品種,該品種外觀鮮艷、高糖低酸、品質優(yōu)良,深受消費者的喜愛。目前該品種在海南、廣東、廣西、云南、貴州等地大面積種植,種苗需求量大。

紅皮紅肉火龍果在生產上主要采用種子、扦插和嫁接等繁殖方式育苗[4-6],種子育苗發(fā)展速度較慢,且容易變異[1]。扦插育苗繁殖速度慢并且會影響母株的長勢,很難在短時間內滿足種苗生產需求。采用離體快繁技術繁殖種苗,能夠保證火龍果優(yōu)良性狀得到穩(wěn)定遺傳,縮短植株的繁殖周期且在短期內獲取大量的種苗數(shù)量。本研究以紅皮紅肉火龍果帶剌座的幼嫩莖段為外植體,探索火龍果組培快繁體系,為其高效栽培繁殖奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為金都一號紅皮紅肉火龍果,取自中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所火龍果種質圃。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體消毒 從生長健壯的火龍果的植株上切取幼嫩的莖段,用軟毛刷刷洗刺座周圍的細菌灰塵,用自來水沖洗干凈,再用濾紙吸干水分。用手術刀片沿著莖段棱緣縱切,切成寬為3 cm左右的棱片,再橫切成5～6 cm長的小段,每段保留2～3個刺座。在無菌操作臺上選用的消毒劑為75%酒精、2%次氯酸鈉和0.1%升汞。將3種消毒劑和消毒時間做如表1所示的組合。

表1 對外植體表面滅菌的不同消毒方法組合

在消毒過程中充分攪拌外植體,使其充分接觸消毒液,提高消毒效果。每種消毒劑滅菌后用無菌水沖洗3次,每次3 min,將滅菌后的莖段切成2～3 cm長的莖段,每個莖段攜帶1～2個刺座,接種在無生長調節(jié)劑添加的MS培養(yǎng)基上預培養(yǎng),每個處理接種15瓶,每瓶2個外植體,重復3次。觀察并統(tǒng)計莖段污染率和褐化率。培養(yǎng)條件:溫度(25±2) ℃,光強2 000～2 500 LX,光照時間12 h/d。

1.2.2 不定芽的誘導 將預培養(yǎng)后的無污染的火龍果莖段平放(保持刺座向上)接種于以MS為基本培養(yǎng)基,添加6-BA(1.0、3.0、5.0、7.0 mg/L)和NAA(0.1、0.2和0.5 mg/L)的不定芽誘導培養(yǎng)基上。每個處理接種30瓶,每瓶接種1個莖段,3次重復,接種培養(yǎng)40 d,統(tǒng)計不定芽萌發(fā)數(shù)和不定芽生長狀況,篩選出最適不定芽誘導的培養(yǎng)基。培養(yǎng)室溫度為(25±2)℃,每天光照12 h,光照強度為1 500～2 000 LX。

1.2.3 不定芽的增殖與分化 待誘導的不定芽生長至2～3 cm時,從芽基部約3 mm處切下,切除多余的愈傷組織,轉接于分化增殖培養(yǎng)基上,以MS為基本培養(yǎng)基,瓊脂為8.5 g/L,蔗糖30 g/L,添加不同濃度的6-BA、NAA的增殖培養(yǎng)基上,pH值為5.8。6-BA濃度為2.0、4.0、6.0、8.0 mg/L共4個水平,NAA濃度為0.1、0.2、0.3 mg/L共3個水平,合計12個處理。每個處理接種15瓶,每瓶接種2株不定芽,每個處理設3個重復。接種20 d后統(tǒng)計不定芽增殖數(shù),統(tǒng)計分析增殖系數(shù)。增殖系數(shù)=不定芽萌生數(shù)/接種不定芽數(shù)[2]。

1.2.4 生根培養(yǎng)基的篩選 當增殖芽長至3～4 cm左右時,轉入生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng),以MS為基本培養(yǎng)基,附加蔗糖30 g/L,瓊脂8.5 g/L,IBA濃度為0.2、0.4、0.6 mg/L3個水平,NAA濃度為0.1、0.2、0.3 mg/L3個水平,每個處理接種10瓶,每瓶接種3株,3次重復。接種20天后開始定期觀察記錄生根情況,40 d后統(tǒng)計生根率(生根芽苗數(shù)/接種芽苗數(shù)×100%)、平均生根數(shù),并觀察生根苗長勢。

1.2.5 組培苗的移栽 當生根苗高6～8 cm、根長至4～6條時,將其進行煉苗移栽。具體方法為:先將組培瓶的瓶蓋打開,置于(25±2) ℃條件的溫室大棚中進行煉苗,4 d后洗凈苗根上殘留的培養(yǎng)基,將其移植于經過多菌靈消毒的珍珠巖、蛭石、有機土、紅土、河砂等混合基質中。設計5個處理組合:K1,珍珠巖∶有機土=1∶1;K2,河砂∶有機土=1∶1;K3,紅土∶蛭石∶有機土=1∶1∶2;K4,河砂∶蛭石∶有機土=1∶1∶2;K5,珍珠巖∶蛭石∶有機土=1∶1∶2,每種處理組合種植20株苗,重復3次,置于自然環(huán)境條件下培養(yǎng)。移栽30 d后統(tǒng)計組培苗成活率及其生長狀況。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用SPSS 18.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同組合消毒方法對外植體的影響

不同組合消毒方法對外植體的影響結果見表2,各處理的污染率為10%～62.22%,差異較大,差異達到極顯著水平(p<0.01),其中組合B5、B6、B9污染率都在10%以下,顯著低于其他組合,三者之間差異不顯著,污染率較高的是組合B1、B4和B7,分別為62.20%、55.56%和50%,滅菌效果較差。褐死率方面,組合B3、B6和B9褐死率顯著高于其他組合,褐死率達到36.67%、35.56%、38.89%,組合B2和B5成活率最高,分別為62.22%、73.33%,經方差分析成活率顯著高于其他組合,組合B1的存活率最低,僅為27.78%。

表2 不同組合消毒方法對火龍果消毒效果的影響

本研究結果表明,0.1%升汞浸泡5 min均不能達到較理想的滅菌效果,但0.1%升汞消毒15 min莖段褐死增多,因此應選擇3種消毒劑的合理搭配才能達到最佳的滅菌效果。

綜合考慮污染率較低且成活率高的組合B5作為金都1號火龍果莖段消毒的最適宜的方法:75%酒精消毒20 s+2%次氯酸鈉5 min+0.1%升汞10 min。

2.2 不同生長調節(jié)劑組合對不定芽誘導的影響

將初代培養(yǎng)后獲得的無菌火龍果莖段接種于細胞分裂素和生長素組合的MS培養(yǎng)基中,接種15天后,外植體膨大,部分切口處會長出少量白色的愈傷組織,刺座周圍芽生長點開始膨大芽萌動,這時如基部誘導出愈傷組織過多,應及時切除多余的愈傷組織并轉瓶。培養(yǎng)40 d后不定芽發(fā)芽情況如表3所示。

表3 不同生長調節(jié)劑組合對火龍果不定芽誘導的影響

不同生長調節(jié)劑組合均能誘導不定芽的產生并存在顯著差異(p<0.05),當6-BA濃度為1.0 mg/L與NAA組合時,外植體不定芽的誘導率較低,誘導率在30%以下;當6-BA濃度為3.0、5.0、7.0 mg/L與NAA組合時,外植體不定芽的誘導率較高,可達到51.11%～83.33%。在合適的濃度范圍內,6-BA濃度相同,NAA濃度降低,或者當NAA濃度相同的情況下,隨著6-BA濃度的增加,不定芽誘導率都呈增加的趨勢。綜上所述,不同濃度6-BA和NAA生長調節(jié)劑組合對不定芽誘導的影響不同,其中以MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L的培養(yǎng)基不定芽誘導效果最好,不定芽誘導率可達83.33%。

2.3 不同生長調節(jié)劑組合對不定芽的增殖與分化的影響

不同生長調節(jié)劑組合對不定芽的增殖與分化的影響見表4,接種20 d后,所有組合均能誘導不定芽增殖。芽的繁殖系數(shù)隨6-BA質量濃度的增加而增加,當6-BA質量濃度為8 mg/L時,不定芽的繁殖系數(shù)達到6.5,顯著高于其他組合(p<0.05),但不定芽長勢弱、細小、黃綠色,有褐化苗出現(xiàn)。當6-BA質量濃度相同,NAA質量濃度提高時,不定芽繁殖系數(shù)則下降,氣生根增多。當6-BA質量濃度為2 mg/L,NAA質量濃度為0.1～0.3 mg/L時,不定芽的增殖系數(shù)偏低,芽分枝少,芽壯,長勢好。6-BA質量濃度為4～6 mol/L時苗分枝多,增殖系數(shù)顯著大于其他組合。因此在繼代培養(yǎng)中,可根據(jù)生產的需求在MS+6-BA 6.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L中快速增殖,再轉入MS+6-BA2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L進行壯苗,這樣可以實現(xiàn)短時間內快速繁殖健壯芽苗又能減少褐化苗的目的。

表4 不同生長調節(jié)劑組合對火龍果芽增殖與生長的影響

2.4 不同生長調節(jié)劑組合對不定芽生根的影響

不同生長調節(jié)劑組合對不定芽生根的影響見表5,火龍果再生不定芽接種20天后有根系的生成,不同組合間生根率和平均生根數(shù)均存在極顯著差異(p<0.01)。生根率和平均生根數(shù)隨著IBA濃度的增加而增加,不定芽苗在以上培養(yǎng)基中均能誘導出根,隨著IBA質量濃度的升高,苗生根率、平均生根數(shù)極顯著地提高,從41.11%上升至100%,平均生根數(shù)從2.75條根增加為6.83條,不定芽和根的長勢明顯提高。生根率和平均生根數(shù)隨著NAA質量濃度的升高而增加。綜合生根率、生根苗長勢等方面,IBA 0.6 mg/L+NAA 0.2 mg/L誘導火龍果生根的效果最好,是生根誘導的最佳生長調節(jié)劑組合。

表5 不同生長調節(jié)劑組合對火龍果不定芽生根的影響

2.5 不同基質配比對組培苗移栽成活的影響

將生長良好的試管苗煉苗4天后,轉移至溫室大棚內種植,在不同組合的基質上定植,定期澆水,移栽40 d后試管苗成活率及其生長狀況見表6。不同基質配比對試管苗成活率和根系生長差異較大(p<0.05),其中,K4處理和K5處理的成活率最高,達到100%,試管苗生長健壯,根系粗,須根多,而K2處理成活率較低,僅為80%。

表6 不同基質配比對火龍果組培苗移栽成活率及生長的影響

3 結果與討論

外植體的消毒是組織培養(yǎng)能否成功的關鍵環(huán)節(jié),組培污染、褐化嚴重均會影響到組培的成功率?；瘕埞奈廴局饕霈F(xiàn)在刺座周圍,由于刺座部位有小刺和絨毛的存在,容易滋生較多的細菌,雖然用毛刷刷洗,但很難徹底清洗干凈,消毒劑也較難滲入,因此容易因消毒不徹底而造成污染[7-8]。本實驗發(fā)現(xiàn)在利用75%酒精、2%次氯酸鈉、0.1%升汞組合消毒過程中發(fā)現(xiàn)莖段的褐化率隨著消毒時間的增加而增加,而污染率則隨著消毒時間增加而顯著下降。本實驗的污染主要集中在刺座部位,刺座部位有叢生的葉刺和小絨毛的存在,不容易消毒,本實驗曾嘗試切掉刺座,減少污染率,但是發(fā)現(xiàn)去除刺座雖然能降低污染率,但是容易使裸露的芽點受到消毒液的傷害,導致莖段不能快速直接誘導成芽,因此認為保留莖段上的刺座更有利于火龍果不定芽的誘導,提高組織培養(yǎng)的效率。這與前人的研究結果相一致[17]。本實驗中采用的消毒方式為:75%酒精消毒20 s+無菌水沖洗3次+再用2%次氯酸鈉消毒5 min+無菌水沖洗3次,最后0.1%升汞消毒10 min,無菌水沖洗3次,污染率為11%,成活率為73%,消毒效果比較好。

在火龍果組培快繁的過程中,不定芽的誘導增殖分化及生根培養(yǎng)中,植物生長調節(jié)劑的種類和濃度是關鍵因素。不合理的植物生長調節(jié)劑的種類及配比濃度都得不到預期的繁殖系數(shù),甚至會導致組培苗畸形、褐化等,甚至還會起到抑制作用[2,9]。本研究開展的火龍果不定芽誘導和增殖培養(yǎng)過程中,發(fā)現(xiàn)不同濃度的細胞分裂素和生長素的配比對芽的誘導和增殖的效果差異顯著。6-BA 1～7 mg/L和NAA 0.1～0.5 mg/L合理的配比均能誘導出不定芽,這與國內許多學者的研究觀點相一致[10-11]。但也有研究認為利用其他類型的植物生長調節(jié)劑對不同品種或者同一品種不同類型的外植體的不定芽的誘導,也能達到較好的誘導效果。如彭綠春等[12]選用TDZ、NAA的組合配比誘導不定芽,誘導率達到80%;彭思維[13]等利用MS+2,4-D 1.0 mg/L+TDZ 0.4 mg/L+NAA 0.5 mg/L能誘導火龍果分化出不定芽。劉洪章等[14]認為在MS培養(yǎng)基中添加6-BA、IAA能成功誘導出不定芽,也有研究認為ZT和IBA的合理組合對不定芽的誘導有顯著的效果[15]。楊紅超[16]等研究發(fā)現(xiàn)添加2,4-D誘導火龍果叢生芽效果最好。因此,不同的品種、外植體的類型、取材時間等都需要通過具體的實驗來篩選最合適的植物生長調節(jié)劑種類和配比。研究還發(fā)現(xiàn)在繼代培養(yǎng)中,不同的6-BA和NAA的濃度配比對芽苗萌發(fā)和壯苗有顯著的效果,可根據(jù)生產的需求合理添加6-BA和NAA的濃度配比,這樣可以實現(xiàn)短時間內快速繁殖健壯芽苗又能減少褐化苗。

本試驗獲得的組培苗生根效果較好,生根率達到100%,但要注意組培苗移栽后必須保持土質疏松透氣,排水良好,過多的水分容易造成爛根。采用珍珠巖∶蛭石∶有機土體積比1∶1∶2的配比作為組培苗的移栽基質,移栽成活率達到100%。

火龍果是我國新型的水果品種,對其開展組織快繁技術研究具有非常重要的意義。組培快繁的技術關鍵是培養(yǎng)基配方,在本試驗中通過對火龍果的不定芽的誘導、增殖分化及生根培養(yǎng)基的篩選,獲得了適于其組培快繁的培養(yǎng)基配方。本試驗結果顯示,火龍果快繁最佳誘導培養(yǎng)基分別為:MS+6-BA3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;增殖分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 6.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L;壯苗培養(yǎng)基為:MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L,生根培養(yǎng)基MS+IBA 0.6 mg/L+NAA 0.2 mg/L。