兩樣本孟德爾隨機化研究應用于心血管疾病的教學與思考

汪漢 路克寧

(1.成都市第三人民醫(yī)院心內科,四川 成都 610031; 2.南京農業(yè)大學,江蘇 南京 210095)

孟德爾隨機化(Mendelian randomization,MR)正成為一種跨學科的因果推斷方法。它是一種利用與可改變的暴露相關的遺傳變異來評估其與被解釋變量的因果關系的方法[1]。在MR中,遺傳變體通常是單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP),這些SNP與潛在的暴露有密切聯系,但與傳統的觀察性研究中可能混雜的生活方式或社會經濟因素無關。MR可提供較高水平的循證醫(yī)學證據,雖然低于多中心、大樣本的隨機對照試驗和系統評價,但相較于后者更易實施且高效,另外,與傳統的觀察性研究相比,MR也不太可能受反向因果關系的影響,因此,MR對于判斷“暴露”和“結局”的因果關系意義重大[1-2]。

兩樣本MR在MR中最為常見,已廣泛應用于心血管疾病的研究中。大量研究通過MR重新定義了傳統心血管疾病和其他可能的危險因素[3]。然而,目前已發(fā)表的MR中方法學介紹不全,部分研究存在一些缺陷,這使MR的可信度受到懷疑。更重要的是,與其他分析方法一樣,MR的可信度取決于假設,因而評估這些假設的合理性尤為重要。

在目前的教學中,多數學生對MR的理解局限于跑程序,“程序為王”或“發(fā)文為王”的思想不在少數。如何深入理解MR,從而進一步轉化,在教學上值得深思熟慮?，F從MR的概念、基本要求與執(zhí)行、應用于心血管疾病的現況、在心血管疾病教學中的學習應用以及在教學中的困惑與思考方面進行闡述,以期為初入手MR的學生提供一定的參考。

1 MR的概念

MR是一種使用遺傳變異來估計“暴露”和“結局”之間因果關系的方法?！氨┞丁蓖ǔＶ溉魏慰赡苡绊懡Y果的危險因素,包括生物學指標、實驗室數據或群體特征,而“結局”一般是疾病,但往往不限于疾病。

MR的核心是利用孟德爾自由組合規(guī)律,這一過程類似于隨機對照試驗中的隨機分組[1]。它主要用于確定變量的因果關系。確定因果關系對于制定干預措施極其重要,然而,由于反向因果關系、雙向因果關系以及混雜因素的干擾,這種關系常難以肯定。與隨機對照試驗類似,MR將等位基因隨機分離,其中,暴露組分配等位基因而對照組則無,進一步比較兩組的結局。

MR的優(yōu)勢很多,首先,“暴露”一般與行為、社會、心理等因素相關,可能造成偏倚,但遺傳變異則不受混雜影響;其次,遺傳變異與其效應的測量誤差較小;最后,近年來全基因組關聯分析(genome wide association study,GWAS)相對容易獲取,這為判斷“暴露”和“結局”之間的因果關系提供了極大的便利。

2 MR的基本要求與執(zhí)行

MR在統計學上的本質是利用工具變量來研究因果關系。最常見的兩種統計學模型是兩階段最小二乘法以及兩樣本MR。后者可利用兩個獨立的GWAS 的匯總統計量來計算“暴露”和“結局”的關聯比值。在兩樣本MR中,需要遵守關聯性、排他性以及獨立性假設等3個原則,即:遺傳變異必須與“暴露”因素強相關;遺傳變異不能與“結局”直接相關;遺傳變異不能與任何可能的混淆因素相關。這3個原則是MR的基石,同時也反映在MR的執(zhí)行流程中[3]。

兩樣本MR的基本流程如下:選取匯總數據,確定工具變量,MR分析操作,進行敏感性和異質性分析。操作非常簡單,但規(guī)范更重要。為此,STROBE-MR工作組[4]制訂了一個包含20個條目的MR研究報告規(guī)范清單,旨在幫助作者撰寫MR研究報告、協助編輯和同行評審人決定該論文可否發(fā)表,以及協助讀者評價已發(fā)表的MR論文,全文發(fā)表在2021年的JAMA雜志上,隨后該工作組也在BMJ雜志上提出MR寫作的規(guī)范解讀[5]。該規(guī)范清單包括題目和摘要部分(標題和摘要)、引言部分(研究背景和目標)、方法部分(研究設計和數據來源、假設、統計學分析、假設的評估、敏感性分析和附加分析、軟件和預注冊)、結果部分(描述性分析、MR主要結果、對假設的評估、敏感性分析和附加分析)、討論部分(主要結果、局限性、解釋和普適性)、其他信息(資助、數據和數據共享、利益沖突)等六個部分。具體信息詳見網站(https://www.strobe-mr.org/)。

3 MR應用于心血管疾病的現況

心血管疾病相關的GWAS較多,因此,MR廣泛應用于心血管疾病領域。最近的研究[6]發(fā)現:MR研究已證實了主要的心血管疾病危險因素(飲酒、吸煙、肥胖、高血壓、2型糖尿病、高脂血癥和炎癥)對動脈粥樣硬化性心血管疾病的影響,這些研究的結果與現有的隊列研究結果基本相同,同時也被進一步的隨機對照試驗所證實。多數研究主要是探索心血管疾病的危險因素,因此可以采用兩樣本MR進行,進一步的分析可采用中介MR、多變量MR以及貝葉斯模型操作。當然,探討“暴露”與“結局”的遺傳多效性關聯還可以采用連鎖不平衡分數回歸、基因共定位、基于匯總數據的MR等方法[3]。

在心血管領域,開發(fā)靶向藥物是一個熱門話題。如何尋找有效的分子靶標是科學家們孜孜追求的重大問題。藥理學家們更喜歡通過研究作用機制,例如通過靶向受體或分子對接的方法來尋找藥物的靶蛋白。但常消耗了大量時間及金錢,卻只能找到一個無效的靶標。由此,用于藥物開發(fā)與效應預測的藥物MR應運而生。它基于靶蛋白下游產物的生物標志物,以靶蛋白編碼基因附近的對生物標志物有顯著效應的SNP(pQTL或eQTL)作為工具變量,以生物標志物濃度作為暴露,以疾病作為結局進行MR,以驗證蛋白靶點對所研究疾病的影響[7]。目前,針對心血管疾病的藥物MR才剛剛起步,有極大的應用前景。

總之,目前MR在心血管領域的應用主要表現為探索疾病的因果關系、開發(fā)藥物靶點。此外,MR也可進一步探討遺傳多效性,這些可為進一步研究多種疾病的機制奠定基礎。

4 MR在心血管疾病教學中的學習應用

部分學生在學習MR時,常會覺得既簡單又困難。簡單的是,MR只需在R軟件中不斷地點擊代碼,就可得出想要的數值和圖片,以此為基礎,似乎就可以出不錯的文章了,所謂“一鍵成文”。另一部分同學可能覺得困難,原因在于MR的應用軟件為R軟件,甚或使用Linux系統,而這些語言的學習難以一蹴而就。那么,該如何引導學生進行學習呢?大體上需要把握三個關鍵環(huán)節(jié):(1)熟悉GWAS的基本概念以及MR的基本原理,這些可為操作、解釋MR提供便利。(2)明確MR中的一些基本概念,例如工具變量,弱工具變量偏倚、F值、效應量,敏感性分析以及異質性分析。(3)基本會操作R語言。目前關于兩樣本MR的編程語言較多,但主要還是以R語言為主,其他的Linux以及Python在進階分析中有更多的作用。

以2022年筆者發(fā)表的一篇文章[8]為例,在這項研究中,筆者使用兩樣本MR來揭示三甲胺N-氧化物(trimethylamine N-oxide,TMAO)及其前體(膽堿、甜菜堿和肉堿)對收縮壓/舒張壓的因果效應。TMAO及其前體的匯總數據來自弗雷明漢心臟研究的2 076例歐洲參與者的人類代謝組匯總數據。血壓的數據來自于國際血壓全基因組協會研究聯盟。MR分析采用逆方差加權法、MR-Egger回歸、最大似然比、加權中位數、MR多效性殘差和異常值檢驗等方法。MR結果表明,TMAO增加1個單位與收縮壓增加相關(β=0.390,SE=0.720,P=0.201)。此外,筆者的研究結果還表明,肉堿增加1個單位與收縮壓增加相關(β=0.550,SE=0.750,P=0.390)。這一結果也得到了敏感性分析方法的證實。這項研究提供了TMAO及其前體與血壓因果關系的證據,表明介導TMAO的產生可能有利于降低血壓。

該研究手稿提交后,同時有7個審稿人參與審稿。在提出的問題中,最關鍵的一點是選題的創(chuàng)新性和臨床的實用性,其余的大部分問題集中在方法學部分,主要表現在以下方面:(1)研究數據的基本特征。該部分常會被忽略,這要求研究者窮盡全文,回溯追查。(2)假設的評估。作者是否使用了足夠的MR統計學方法?比值比以及95%可信區(qū)間過大或過小如何解釋?弱工具變量偏倚如何處理?(3)基因的多效性如何解決?作者是否使用了最新的一些統計學方法解決基因多效性問題?(4)如何看待本文的局限性,包括但不限于數據的局限性、統計學的誤差。(5)對該數據進行驗證也是需要著重強調的問題。(6)其他的問題還表現在引文的準確、圖表的精美以及書寫的邏輯完整等方面。

5 MR在教學中的困惑與思考

MR對于解構疾病、開發(fā)藥物靶點有益,目前發(fā)文方興未艾。據統計,2022年已發(fā)表MR相關論文2 000余篇。然而,對臨床有指導意義的MR論文好像并不多見,推動臨床進展的研究更是少之又少,這似乎陷入了幾年前如火如荼的生物信息學分析的類似怪圈。

因此,客觀上,選擇一個好的題目尤為重要。很多學生都存在兩個誤導性的觀點:(1)無人做過的MR肯定可以發(fā)表;(2)陽性結果的MR肯定可以發(fā)表。然而,在實際中,文獻沒有認真查閱而直接重復別人做過的MR不在少數;另外,已有大量高質量隨機對照試驗證實的結論也不宜重復進行MR研究。

此外,普通的教學形式可能難以滿足當前的學習情況,大數據的實際場景操作可能更適合目前的教學形式。實際上,進行eQTL、基于匯總數據的MR方法或基因共定位等操作時,對電腦的要求會更高一些,普通配置的電腦可能難以滿足計算的要求,因此,云服務器可能是一個比較好的選擇。

在描述MR的局限性時常會陳述以下幾個方面:人群缺陷、樣本缺陷以及無法獲得原始數據從而進一步分析。盡管如此,以下幾個方面必須注意:(1)必須嚴格執(zhí)行MR研究的假設。MR中關聯性、排他性以及獨立性假設條件的執(zhí)行需嚴格而謹慎。在這個環(huán)節(jié)中,為了盡可能刪除回文SNP,避免混雜,需在Catalog和PhenoScanner中詳細查詢SNP位點。(2)樣本重疊似乎是一個難以解決的問題。部分學者認為樣本量小的因素與樣本量大的因素的比值即是可能的最大樣本重疊率。也有人認為樣本的來源、國別不同就說明兩樣本之間不存在樣本重疊率。然而,實際上,根據MR lap包計算兩樣本重疊率也是一個可行的方法[9]。(3)在MR中,結果往往較之于觀察性研究結果更好,因此對MR結果的解釋需更謹慎,因和果并不是一成不變的,隨著年齡、環(huán)境以及伴隨疾病的出現,因和果的聯系也可能增強或者減弱[3]。另外,在觀察性研究中有意義的關聯也可能在MR中無意義,這與人群、樣本量、伴隨疾病以及基因多效性相關。此外,由于遺傳變異僅解釋了暴露變量方差的一小部分,因而可能無法從MR研究中推斷出臨床應用的結果[2]。由于無法真正驗證所有的假設,MR研究可用于判斷因果關系,但不能用于效應量的外推。最后,MR作為檢驗“暴露”和“結局”是否有因果關系具有相當大的優(yōu)勢,然而,當使用MR反駁因果關系時,統計效能較低,可能需非常大的樣本量估計基因型-表型效應的精確性。(4)在實際操作中,還有一個重要問題值得注意,即基因的遺傳多效性[10]。大牌雜志常會強調這個問題。常規(guī)的兩樣本MR一般依據常規(guī)的數學檢驗統計,然而,潛在的遺傳多效性位點常不可避免。目前有多個新的統計學方法對遺傳多效性進行檢測,如CAUSE(Causal Analysis Using Summary Effect estimates)等,然而,CAUSE卻經常得出陰性結果。另外一個方法是剔除“暴露”和“結局”可能共享的遺傳多效性位點,然后再進行兩樣本MR計算,但后者在實際操作中也存在諸多問題。

總之,兩樣本MR在心血管領域的用途越來越廣,在教學中的疑難點也頗多。只有立足于對基礎知識的理解、基本操作的練習以及基本環(huán)節(jié)的剖析,才會熟練掌握這門強大的武器。