基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討中藥復(fù)方干預(yù)血小板聚集抗動脈粥樣硬化的用藥規(guī)律及潛在機(jī)制

李志情, 孫文昊, 韋玉連, 聶莎, 唐耀平,4*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)瑞康臨床醫(yī)學(xué)院, 南寧 530200; 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院, 心血管內(nèi)科, 南寧 530011; 3.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院, 廣州 510315; 4.廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室, 南寧 530200)

隨著生活條件不斷改善,人類心血管危險事件發(fā)生率不斷升高,動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是心血管危險事件發(fā)生的病理基礎(chǔ),多侵犯于冠狀動脈、腦動脈、腎動脈、腸系膜動脈、下肢動脈等部位,可引起心絞痛、心肌梗死、腦梗死、腦出血、頑固性高血壓病、麻痹性腸梗阻、間歇性跛行等疾病[1-2]。AS的病因多與吸煙、嗜酒、重鹽重油飲食、高血壓病、糖尿病、高血脂癥等生活習(xí)慣和疾病相關(guān),其發(fā)病機(jī)制與炎性反應(yīng)、內(nèi)皮損傷、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)浸潤、細(xì)胞凋亡、血小板聚集等密切關(guān)聯(lián)[3-4]。AS由血管內(nèi)皮損傷來啟動,血小板進(jìn)一步促進(jìn)損傷,在AS的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[5-6]。目前臨床上治療多以西藥治療為主,常用他汀類、利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素受體拮抗劑(ARB)、雙胍類等藥物調(diào)節(jié)血脂水平、降低血壓、控制血糖,同時調(diào)整生活飲食習(xí)慣,加強(qiáng)運(yùn)動鍛煉等。但西醫(yī)治療雖有一定療效,但不良反應(yīng)多,難以長期堅持,出血風(fēng)險性高,停藥后容易病情反復(fù)[7-8]。

中醫(yī)以整體觀為指導(dǎo),多層次、多靶位的作用于AS,具有獨(dú)特優(yōu)勢[9]。由于AS斑塊涉及內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等,客觀上需要中醫(yī)在微觀施治方面進(jìn)行深入研究。文獻(xiàn)[10-12]表明,中醫(yī)復(fù)方可以通過抗血小板聚集發(fā)揮抗AS作用,但對其中發(fā)揮核心作用的藥對,尤其是角藥(三味藥的組合)未有深入探索。隨著信息科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)在中藥復(fù)方配伍分析的運(yùn)用越來越多,相關(guān)技術(shù)逐漸成熟[13-14]。

現(xiàn)通過數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方式評價干預(yù)血小板聚集抗AS的中藥復(fù)方,找出并分析核心角藥組合,闡明其與疾病相關(guān)的潛在靶位以及信息通道,為優(yōu)化組方和深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究資料

所用文獻(xiàn)主要源于中國知網(wǎng),以“動脈粥樣硬化、粥樣硬化、抗血小板聚集、血小板、凝血功能、凝血、中藥復(fù)方、方、湯”等為主題詞進(jìn)行檢索,檢索時限均為建庫起至2022年7月8日,初檢出269篇相關(guān)文獻(xiàn),從中整理出通過干預(yù)血小板聚集抗動脈粥樣硬化的方劑及其藥物組成,最后篩選出50個中藥復(fù)方,涉及109味中藥。

1.2 處方篩選

利用中醫(yī)傳承系統(tǒng) (V2.5)統(tǒng)計納入藥物性味歸經(jīng)分析。將其結(jié)果在 Excel 2010軟件中詳細(xì)列出。通過IBM SPSS Statistics 25及IBM SPSS Modeler18統(tǒng)計軟件對藥物數(shù)據(jù)進(jìn)行內(nèi)在聯(lián)系、規(guī)律以及群集分析。

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)中醫(yī)方劑或中西醫(yī)結(jié)合通過干預(yù)血小板聚集抗 AS 的相關(guān)文獻(xiàn)(文獻(xiàn)中有中藥方劑者)。

(2)完整說明方劑具體內(nèi)容。

(3)具有明確療效標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)研究。

(4)湯劑、丸劑、散劑、膠囊、注射液等劑型均可(文獻(xiàn)中有中藥具體組成)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)方中方藥組成不完整。

(2)重復(fù)的文獻(xiàn)及組方只納一次(兩方合用者除外)。

(3)臨床觀察研究。

(4)名家經(jīng)典醫(yī)案、經(jīng)驗探討等。

1.2.3 篩選結(jié)果

初檢得到269篇文獻(xiàn),按照納入以及排除標(biāo)準(zhǔn)最終選得60篇文獻(xiàn),刪除重復(fù)方劑,總結(jié)歸納出方劑50首。

1.3 中藥名稱規(guī)范

本次研究所運(yùn)用的中藥名稱均參考《中國藥典》[15]、《中藥學(xué)》[16]進(jìn)行規(guī)范處理,以避免系統(tǒng)對藥物分析產(chǎn)生誤差,其中將川牛膝、懷牛膝、姜半夏、法半夏、生甘草、炙甘草等藥物均分別統(tǒng)稱為牛膝、半夏、甘草。

1.4 核心角藥及疾病相關(guān)靶點(diǎn)的收集與篩選

將上述得出的核心藥對輸入 TCMSP 數(shù)據(jù)庫,找出其活性化合物以及藥物的作用靶位,導(dǎo)入 Excel 2010表進(jìn)行備用。運(yùn)用 UniProt數(shù)據(jù)庫,設(shè)置物種為人,同時根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)名稱校正靶點(diǎn)蛋白。采用 Venny軟件得出角藥與疾病的關(guān)鍵靶位。利用 Cytoscape 3.7.1 軟件獲取核心角藥與疾病交集靶位并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析與核心靶點(diǎn)篩選

運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 軟件構(gòu)建蛋白互作的網(wǎng)絡(luò)圖(protein-protein interaction,PPI),設(shè)置蛋白類型為“人”,獲得蛋白之間的關(guān)系。按度(degree)值大小最終篩選出核心靶位。其中degree 值通過節(jié)點(diǎn)大小體現(xiàn),綜合值(combined score)通過邊的粗細(xì)直觀表現(xiàn)。

1.6 GO KEGG功能富集分析

GO KEGG富集分析選擇在metascape數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行,為預(yù)測核心角藥干預(yù)血小板聚集抗動脈粥樣硬化的生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecularfunction,MF)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)、KEGG通路。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果

2.1.1 藥物性味歸經(jīng)分析

運(yùn)用中醫(yī)傳承輔助平臺(V2.5)得出藥物四氣為溫、熱性藥120次,寒、涼性96次,平性48次。五味以苦味藥150次,甘味120次,辛味90次。歸經(jīng)以入肝經(jīng)150次,入脾經(jīng)140次,入心經(jīng)136次(圖1～圖3)。

圖1 四氣統(tǒng)計雷達(dá)圖Fig.1 Statistical radar chart of four gases

圖3 歸經(jīng)統(tǒng)計雷達(dá)圖Fig.3 Warp statistic radar chart

2.1.2 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

利用IBM SPSS Modeler18.0軟件對藥物進(jìn)行內(nèi)在聯(lián)系、規(guī)律分析,將最低支持度和置信度設(shè)定為 20%和85%,最大前項數(shù)限定為 5,共得出32組核心角藥,去除藥對,最終得出核心角藥24組,依據(jù)置信度、支持度選出居前3位者為“川芎-桃仁-紅花、紅花-桃仁-川芎、紅花-桃仁-當(dāng)歸”(表 1)。進(jìn)一步用網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行展示,藥物之間連線的粗細(xì)和顏色的深淺說明兩者間密切程度。其結(jié)果顯示,當(dāng)歸、桃仁、紅花、丹參、連翹關(guān)聯(lián)程度最高,關(guān)系最為密切(圖4)。

表1 藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析Table 1 Analysis of drug association rules

圖4 藥物關(guān)聯(lián)度網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Drug association degree network diagram

2.1.3 藥物聚類分析

采用IBM SPSS Statistics 25系統(tǒng)對前20個藥物進(jìn)行聚類分析分成4類(表2),聚類分析樹狀圖如圖5所示。

表2 聚類分析Table 2 Cluster analysis

圖5 聚類分析樹狀圖Fig.5 Dendrogram of cluster analysis

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.2.1 核心角藥與疾病相關(guān)靶點(diǎn)的篩選

選擇中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺,對生物利用度(oral bioavailability,OB)限定為≥30%,對類藥性(drug like,DL)限定為≥0.18,獲取核心角藥“川芎、紅花、桃仁”的藥物成分及潛在靶點(diǎn)的信息,將核心藥物的有效成分及靶點(diǎn)導(dǎo)入Excel 2010,去重整合后結(jié)果如下:川芎、紅花、桃仁分別包含6、13、19種成分; 42、436、139個靶位。運(yùn)用Genecards、OMIN、Drugbank、TTD等數(shù)據(jù)庫取得疾病靶位,分別輸入關(guān)鍵詞“atherosclerosis、platelet aggregation”,得到相應(yīng)靶點(diǎn)分別為“1 177、898”“134、132”“47、16”“0、2”個,其中 Genecards數(shù)據(jù)庫篩選 Score≥1.135的基因,將各數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)錄入Excel 2010表中,對靶點(diǎn)進(jìn)行整合,去除重復(fù)值后,最終得到疾病靶點(diǎn)390個。整合相關(guān)交集靶位后通過Venny軟件,生成“動脈粥樣硬化-血小板聚集、藥物-疾病”韋恩圖(圖 6、圖7),得出藥物與疾病共有80個交集靶位。

圖6 動脈粥樣硬化-血小板聚集韋恩圖Fig.6 Venn diagram of atherosclerosis and platelet aggregation

圖7 中藥-疾病韋恩圖Fig.7 Venn diagram of TCM-disease

2.2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

將藥物-疾病交集靶位數(shù)據(jù)錄入string數(shù)據(jù)庫中,同時設(shè)定物種為“人”,高置信值為 0.900,隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開的節(jié)點(diǎn),結(jié)果得出78個核心靶位并導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖,如圖8所示,共有節(jié)點(diǎn)78個,272條邊。應(yīng)用Network Analyzer 工具進(jìn)行拓?fù)鋽?shù)據(jù)分析,度值大小通過節(jié)點(diǎn)大小、顏色深淺體現(xiàn)。獲取JUN靶點(diǎn)相關(guān)節(jié)點(diǎn)第一層,圖中共有節(jié)點(diǎn)27個,110條邊(圖9),Degree值前十的靶位是JUN、AKT1、TNF、IL6、TP53、MAPK1、CTNNB1、MAPK14、FOS、CAV1(表3)。

表3 Degree值前10關(guān)鍵靶點(diǎn)Table 3 Top 10 key targets in degree value

圖8 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.8 PPI network diagram

圖9 JUN靶點(diǎn)相關(guān)節(jié)點(diǎn)第一層網(wǎng)絡(luò)圖Fig.9 First-layer network diagram of relevant nodes of Jun target

2.2.3 藥物成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

將藥物各活性成分及核心靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel 2010表格中建立相互對應(yīng)關(guān)系,運(yùn)用 Cytoscape 3.7.2軟件制作“藥物成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖(圖10)。共有593個節(jié)點(diǎn),1 007條邊,同時進(jìn)行拓?fù)浞治?。結(jié)果表明,各成分依據(jù)degree值高低排序,排名前 10 的成分為quercetin、kaempferol、luteolin、beta-sitosterol、baicalein、Stigmasterol、Myricanone、hederagenin、beta-carotene、6-Hydroxykaempferol,其中紅花中quercetin居首位,表明紅花中quercetin成分在干預(yù)血小板聚集抗動脈粥樣硬化中起主要作用。

2.2.4 GO、KEGG 富集分析

通過metascape數(shù)據(jù)庫對“川芎-桃仁-紅花”核心角藥干預(yù)血小板聚集抗AS的80個交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析,結(jié)果顯示共5 501條,得出BP 4 599條, CC 376條, MF 526條。在生物過程中主要有運(yùn)動的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞成分運(yùn)動的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞運(yùn)動的正向調(diào)節(jié)等;在細(xì)胞組分中主要參與了膜筏、膜微區(qū)、囊泡腔等細(xì)胞組分;在分子功能中主要信息受體調(diào)節(jié)劑活性、信息受體激活劑活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等,制作氣泡圖進(jìn)行可視化展示(圖11～圖13)。

利用metascape數(shù)據(jù)庫對作為核心角藥的“川芎-桃仁-紅花”干預(yù)血小板聚集抗 AS的共有靶位進(jìn)行KEGG富集研究,將80個靶點(diǎn)導(dǎo)入到數(shù)據(jù)庫中,結(jié)果顯示共234條,核心靶點(diǎn)主要富集在AGE-RAGE在糖尿病并發(fā)癥的信息通道、癌癥相關(guān)通道、血脂與AS相關(guān)通道、松弛素信息通道和HIF-1信息通道等(圖14)。

3 討論

AS是一種由多種原因引起的血管慢性病變,可引起冠心病、腦卒中及外周血管病等[17]。血小板在AS的發(fā)生發(fā)展起著重要的作用,通過調(diào)節(jié)血小板活化、激活內(nèi)皮細(xì)胞、觸發(fā)炎癥反應(yīng)、刺激血管平滑肌細(xì)胞增殖等機(jī)制影響AS的進(jìn)程[18-19]。故抗血小板聚集是防治AS的主要手段之一[20]。AS屬于中醫(yī)的“胸痹”“中風(fēng)”“厥心痛”等疾病范疇,與痰、濁、瘀、毒、虛等病理相關(guān)。以臟腑陰陽氣血不足為本,以痰飲、濕濁、血瘀、毒邪為標(biāo),病機(jī)為本虛標(biāo)實,治以補(bǔ)虛、化痰、解毒、活血為主。其中,“血瘀”是直接引起相關(guān)血流動力學(xué)障礙的關(guān)鍵因素,故活血化瘀法貫穿整個抗AS始終[21-23]。

本次研究通過數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)干預(yù)血小板抗 AS 的中藥以活血化瘀、行氣止痛為主,輔以補(bǔ)氣化痰散結(jié)。根據(jù)關(guān)聯(lián)規(guī)則分析以及藥物系統(tǒng)聚類分析,結(jié)合角藥的支持度以及置信度綜合對比,選出核心角藥“川芎-紅花-桃仁”。其中,紅花可以起到活血通經(jīng)、祛瘀止痛的作用,川芎可以起到活血祛風(fēng),行氣止痛的作用,桃仁可以起到活血祛瘀的作用,以上三藥性味多以甘、溫、苦為主,主要?dú)w心肝經(jīng),與干預(yù)血小板聚集治療AS的機(jī)制相吻合?，F(xiàn)代藥理研究顯示[24-27],紅花可以起到抗氧化、參與免疫調(diào)節(jié)、抗炎等功效。川芎可以起到抗血小板聚集、擴(kuò)張冠狀動脈、改善心肌缺血缺氧、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能等功效。桃仁可以起到改善血流速度、降低全血黏度、血漿黏度等功效,與干預(yù)血小板聚集治療AS的機(jī)制相吻合。

圖12 GO細(xì)胞組分通路富集氣泡圖Fig.12 GO cell component pathway enrichment bubble diagram

圖13 GO分子功能通路富集氣泡圖Fig.13 Bubble diagram of GO molecular functional pathway enrichment

圖14 KEGG通路富集圖譜Fig.14 Enrichment map of KEGG pathway

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對“川芎-紅花-桃仁”核心角藥進(jìn)行分析,得出核心角藥與疾病前十位靶點(diǎn)分別是JUN、AKT1、TNF、IL6、TP53、MAPK1、CTNNB1、MAPK14、FOS、CAV1;干預(yù)血小板聚集抗AS中主要靶點(diǎn)是JUN,文獻(xiàn)[28]表明Jun原癌基因與血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、細(xì)胞炎癥因子等促凋亡因子的表達(dá)有密切關(guān)聯(lián),可影響血管形成。AKT1屬于AMP/GMP 激酶的總類之一,AKT1參與細(xì)胞生長和增值、細(xì)胞存活和凋亡、血管生成和舒張、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收或細(xì)胞葡萄糖和脂質(zhì)代謝等過程[29]。TNF屬于促炎細(xì)胞因子,可以改善血管內(nèi)皮功能、凝血功能、胰島素功能以及脂質(zhì)代謝過程,從而達(dá)到抗AS的作用[30-31]。說明通過調(diào)節(jié)JUN、AKT1、TNF靶點(diǎn)蛋白,可以有效的抗AS。

核心角藥干預(yù)血小板聚集抗AS起主要作用前三位活性成分quercetin、kaempferol、luteolin。文獻(xiàn)[32-33]表明,槲皮素可以明顯改善血流減慢,通過影響血小板顆粒的胞外分泌、血小板的膠原和纖維素靜態(tài)黏附功能,從而有效改善動脈粥樣硬化病變。山奈酚屬于天然類黃酮,具有抗炎、抗凋亡和抗癌作用。有研究表明山奈酚通過干預(yù) GPER調(diào)節(jié) PI3K/AKT/Nrf2 信號通道抑制氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡,進(jìn)而防止AS[34]。木犀草素具有抗炎、抗癌、抗氧化等功效[35]。文獻(xiàn)[36]表明木犀草素可影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移,主要通過調(diào)節(jié)AKT和Src,并通過與 mRNA 穩(wěn)定性和 NOX4/ROS-NF-κB 通路相關(guān)的 TTP 激活來減少炎癥和氧化損傷,以預(yù)防AS形成。 所以“川芎-紅花-桃仁”核心角藥干預(yù)血小板聚集抗AS的主要活性成分可能是槲皮素、山柰酚、木犀草素等活性成分,其具有重要研究價值。

本研究發(fā)現(xiàn)核心角藥的靶位主要集中在AGE-RAGE信息通道在糖尿病并發(fā)癥中的作用、癌癥相關(guān)信息通道、脂質(zhì)和AS信息通道、松弛素信息通道、HIF-1等信息通道。文獻(xiàn)[37-38]表明,松弛素信息通道可促進(jìn)血小板衍生生長因子大量表達(dá),使其促進(jìn)血小板的極性移動凝聚到血管壁損傷部位促進(jìn) AS發(fā)展。

綜上所述,本研究運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘,基于關(guān)聯(lián)規(guī)則及聚類分析,找出了核心角藥“川芎-紅花-桃仁”,并利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對核心角藥進(jìn)行相關(guān)靶點(diǎn)、信號通路研究,初步揭示其具有調(diào)節(jié)JUN、AKT1、TNF靶點(diǎn)蛋白以及脂質(zhì)和AS相關(guān)信息通道、癌癥相關(guān)信息通道、松弛素信息通道以及HIF-1信息通道作用。為中醫(yī)防治AS找到有效的藥物組合,初步揭示了中醫(yī)靶向防治 AS 血小板聚集的可能機(jī)制,為深入進(jìn)行中醫(yī)的微觀靶向研究提供了參考。

4 結(jié)論

通過數(shù)據(jù)挖掘與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,從整體上分析中藥復(fù)方通過干預(yù)血小板聚集抗AS的用藥規(guī)律,結(jié)果得出其干預(yù)血小板聚集抗AS的方劑多以活血化瘀、行氣止痛為主,輔以補(bǔ)氣化痰散結(jié),槲皮素、山柰酚、木犀草素為干預(yù)血小板聚集抗AS的重要有效成分,最后得出關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號通路,闡明核心角藥的作用機(jī)制,同時,后期還可運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)、分子對接技術(shù)等進(jìn)一步佐證,為今后優(yōu)化組方提供一個新的處方思路以及為中醫(yī)藥治療AS的臨床研究提供重要基礎(chǔ)價值。