高通量測序法分析貯藏期甜瓜果實(shí)中真菌群落結(jié)構(gòu)組成及動(dòng)態(tài)變化

鄭賀云，朱麗霞，姚 軍，李 超，張翠環(huán)，汪志偉，耿新麗,*

（1.新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆 鄯善 838200；2.塔里木大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

甜瓜是世界上最受歡迎的水果之一，富含糖、維生素、抗壞血酸、胡蘿卜素、葉酸、鈣、磷、鉀等營養(yǎng)物質(zhì)[1]，備受廣大消費(fèi)者的青睞。甜瓜在我國栽培歷史悠久，隨著產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，其栽培面積不斷擴(kuò)大，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)庫（http://fao.org）顯示，2020年，我國甜瓜栽培面積和產(chǎn)量均居世界前列，種植面積為38.78萬 hm2，產(chǎn)量為138.65萬 t。甜瓜果實(shí)糖和水分含量較高，生理代謝旺盛，后熟衰老速度較快，采收、運(yùn)輸和貯藏期間水分散失和呼吸蒸騰作用會(huì)導(dǎo)致果實(shí)萎蔫、軟化等品質(zhì)劣變，而病原菌侵染致果實(shí)腐爛現(xiàn)象更為普遍，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

近年來，諸多研究已將采后甜瓜腐爛與真菌侵染緊密聯(lián)系起來，從采后甜瓜中鑒定出的致病菌主要包括鏈格孢、鐮刀菌、粉紅單端孢、青霉等[2]。然而，采后果實(shí)中微生物群落系統(tǒng)復(fù)雜，其相互作用直接影響果實(shí)的品質(zhì)和貯藏性能。內(nèi)生真菌通常不會(huì)引發(fā)植物病害，其可以通過與病原體直接相互作用或誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生激素促進(jìn)植物生長來提高寄主植物的抗性，但是其與寄主的共生平衡被打破后有可能轉(zhuǎn)變?yōu)椴≡餄摲谥参矬w內(nèi)，最終引起病害癥狀[3]。

傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)分離技術(shù)可以量化可培養(yǎng)的微生物，并能將它們鑒定到屬、種，但只有極少部分微生物能夠?qū)崿F(xiàn)分離與培養(yǎng)，絕大多數(shù)微生物不能獲得純培養(yǎng)物，而且其操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié)果會(huì)因操作誤差而產(chǎn)生偏差[4]。2006年，有研究者通過高通量測序技術(shù)對深海微生物群落進(jìn)行了分析[5]，目前該技術(shù)已被廣泛用于研究不同基質(zhì)微生物群落的動(dòng)態(tài)變化和多樣性。有研究者利用該技術(shù)分析不同時(shí)期柑橘果實(shí)中的真菌種類，發(fā)現(xiàn)不同生長階段的柑橘果皮和果肉組織中優(yōu)勢菌群差異顯著[6]；Qiu Wanwei等[7]評價(jià)冬菇冷藏過程中微生物多樣性變化，結(jié)果表明冷藏條件下蘑菇貯藏后期假單胞菌、綠桿菌和金桿菌豐度較高；Li Meng等[8]分析了板栗貯藏過程中真菌群落組成的變化，建立了真菌介導(dǎo)的腐爛與板栗貯藏期品質(zhì)之間的相互關(guān)系；Dai Kun等[9]通過高通量測序分析真菌群落的變化，從而監(jiān)測貯藏過程中楊梅的腐爛程度和果實(shí)品質(zhì)，為楊梅采后貯藏過程中腐爛和品質(zhì)變化的監(jiān)測提供了新的思路。目前，高通量測序技術(shù)已成功地應(yīng)用于黃瓜[10]、花生[11]、菠菜[12]、菜心菜[13]、番茄[14]等果蔬貯藏過程中微生物群落變化的解析。上述研究證實(shí)利用高通量測序技術(shù)可以對果蔬中微生物群落之間的相互關(guān)系進(jìn)行深入的解析。

為了解貯藏期甜瓜果實(shí)中真菌群落的變化，本研究利用Illumina MiSeq高通量測序平臺(tái)對‘西州密25號(hào)’甜瓜不同貯藏期的果皮和果肉中真菌群落進(jìn)行內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）測序，以期對貯藏期甜瓜果皮和果肉組織中真菌群落組成和動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行解析，為采后病害的發(fā)生規(guī)律及后續(xù)甜瓜保鮮、內(nèi)生生防菌的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘西州密25號(hào)’由新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所育成，于2021年4月18日播種在新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所甜瓜貯藏與運(yùn)輸課題試驗(yàn)基地，行距3 m，株距45 cm，施行膜下滴管栽培模式和田間常規(guī)管理。2021年7月9日采收，選擇大小及成熟度一致、無病蟲害、無機(jī)械損傷的果實(shí)置于溫度為（23.0±0.5）℃、相對濕度為70%～80%的環(huán)境下貯藏。

DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司；Scientz-48高通量組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司；DYY-11型電泳儀 北京市六一儀器廠；移液槍 德國Eppendorf公司；IE412-L電子天平 德國Sartorius公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；HYSW-10A超純水機(jī) 南京恒裕儀器設(shè)備制造有限公司；MLS-3750蒸汽滅菌鍋 日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

取樣時(shí)間分別為0 d（甜瓜果實(shí)采收的當(dāng)天，果實(shí)新鮮）、7 d（甜瓜果實(shí)果皮轉(zhuǎn)黃，步入衰老階段）、14 d（甜瓜果實(shí)表面開始出現(xiàn)輕微的腐爛）、21 d（甜瓜果實(shí)開始大面積腐爛）。每次隨機(jī)選取9 個(gè)果實(shí)，每3 個(gè)一組，進(jìn)行3 次重復(fù)，分別取果皮和果肉組織。果皮樣品由隨機(jī)選取3 個(gè)果實(shí)的全果皮混合而成，果肉樣品由距離果皮2.5 cm處一圈果肉混合而成，取樣后置于－80 ℃保存?zhèn)溆谩ＹA藏0 d果皮、果肉分別記為P4、R4，貯藏7 d果皮和果肉分別記為P5、R5；貯藏14 d果皮和果肉分別記為P6、R6；貯藏21 d的果皮和果肉分別記為P7、R7。

1.3.2 甜瓜樣品ITS序列測定

以樣品的基因組DNA為模板，文庫的建立和基于Illumina測序平臺(tái)對甜瓜樣品中真菌群落DNA片段進(jìn)行的雙端測序均由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。ITS測序引物為F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’；R：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’。

1.3.3 測序數(shù)據(jù)分析

利用QIIME2軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，首先調(diào)用qiime cutadapt trim-paired切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列；然后通過qiime dada2 denoise-paired調(diào)用DADA2進(jìn)行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體獲得擴(kuò)增子序列變體（amplicon sequence variants，ASVs）。序列長度分布統(tǒng)計(jì)使用R語言腳本，對全部樣本中所包含的高質(zhì)量序列長度分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用上海派森諾生物科技股份有限公司的生信云平臺(tái)（https://www.zcygov.cn/）對真菌群落組成、群落多樣性、種群差異等進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列有效性分析

貯藏期果肉和果皮組織共24 個(gè)樣品，通過Illumina MiSeq平臺(tái)測序，最終共計(jì)獲得1 937 667 對雙端序列，經(jīng)過質(zhì)控、去嵌合體后獲得1 638 150 條高質(zhì)量序列，序列長度范圍為155～369 bp，平均長度為230 bp。

2.2 不同貯藏期甜瓜真菌群落組成分析

2.2.1 甜瓜樣品中ASV分析和物種注釋

分類學(xué)分析結(jié)果表明，在貯藏期果皮和果肉組織24 個(gè)樣品中共鑒定出真菌3 個(gè)門、23 個(gè)綱、54 個(gè)目、106 個(gè)科、123 個(gè)屬。

2.2.2 基于門水平貯藏期甜瓜真菌組成結(jié)構(gòu)分析

如圖1所示，在門水平上子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）是甜瓜貯藏期果皮和果肉24 個(gè)樣品中的優(yōu)勢菌群，相對豐度分別為69.65%和29.68%，毛霉門（Mucoromycota）的相對豐度為0.67%。貯藏期內(nèi)（0～21 d），果皮中子囊菌門的相對豐度呈先上升后下降的趨勢，且其在貯藏14 d時(shí)占絕對優(yōu)勢，相對豐度達(dá)99.06%，而擔(dān)子菌門的相對豐度呈先下降后上升的趨勢；果肉中子囊菌門的相對豐度呈先下降后上升的趨勢，而擔(dān)子菌門的相對豐度則呈先上升后下降的趨勢，并在貯藏14 d時(shí)占絕對優(yōu)勢，相對豐度高達(dá)66.46%。毛霉門只在貯藏0 d的果皮和和果肉組織中檢出，其相對豐度分別只有2.17%和3.14%。

圖1 基于門水平甜瓜樣品中真菌群落組成Fig. 1 Fungal community composition in melon samples at the phylum level

2.2.3 基于目水平貯藏期甜瓜果皮和果肉組織中真菌結(jié)構(gòu)分析

如圖2所示，甜瓜貯藏期果皮和果肉24 個(gè)樣品在目水平共注釋到10 個(gè)相對豐度大于1%的真菌微生物群落，分別是散囊菌目（Eurotiales）（相對豐度28.55%）、格孢腔菌目（Pleosporales）（相對豐度17.12%）、銀耳目（Tremellales）（相對豐度16.55%)、肉座菌目（Hypocreales）（相對豐度12.50%）、線黑粉菌目（Filobasidiales）（相對豐度3.42%）、酵母菌目（Saccharomycetales）（相對豐度2.60%）、馬拉色菌目（Malasseziales）（相對豐度2.48%）、小囊菌目（Microascales）（相對豐度2.02%）、煤炱目（Capnodiales）（相對豐度1.66%）和葉黑粉菌目（Entylomatales）（相對豐度1.41%）。

圖2 基于目水平甜瓜樣品中真菌群落組成Fig. 2 Fungal community composition in melon samples at the order level

整個(gè)貯藏期內(nèi)（0～21 d），果皮與果肉中優(yōu)勢菌群差異較為明顯，新鮮果實(shí)（0 d）的果皮中格孢腔菌目、銀耳目、肉座菌目占據(jù)優(yōu)勢，而果肉中優(yōu)勢菌群為格孢腔菌目、銀耳目和小囊菌目。隨著貯藏時(shí)間的延長，貯藏21 d時(shí)果皮中檢測到的優(yōu)勢菌群以散囊菌目為主，肉座菌目次之，貯藏14 d時(shí)散囊菌目占絕對優(yōu)勢，相對豐度高達(dá)87.36%；貯藏21 d時(shí)果肉中的優(yōu)勢菌群除格孢腔菌目、銀耳目和小囊菌目外，還包括為肉座菌目、酵母菌目和葉黑粉菌目。綜上，貯藏21 d時(shí)果皮中的優(yōu)勢菌群為散囊菌目和肉座菌目，而果肉中格孢腔菌目、銀耳目和肉座菌目占優(yōu)勢。

2.2.4 基于屬水平貯藏期甜瓜果皮和果肉組織中真菌結(jié)構(gòu)分析

如圖3所示，在屬水平上，甜瓜貯藏期果皮和果肉24 個(gè)樣品中相對豐度排名前10 位的優(yōu)勢菌群分別為曲霉屬（Aspergillus）、維什尼亞科齊馬菌屬（Vishniacozyma）、鏈格孢屬（Alternaria）、單端孢屬（Trichothecium）、Papiliotrema、青霉屬（Penicillium）、黑粉酵母屬（Filobasidium）、附球菌屬（Epicoccum）、綠僵菌屬（Metarhizium）、畢赤酵母屬（Pichia）。

圖3 基于屬水平甜瓜樣品中真菌群落組成Fig. 3 Fungal community composition in melon samples at the genus level

從圖3和表1可以看出，貯藏0 d時(shí)果實(shí)較新鮮，果皮中菌群相對均衡，優(yōu)勢菌為綠僵菌屬、維什尼亞科齊馬菌屬和鏈格孢屬，曲霉屬和Papiliotrema相對豐度較低；貯藏7～14 d時(shí)優(yōu)勢菌群轉(zhuǎn)變成曲霉屬，鏈格孢屬次之，在第14天時(shí)曲霉屬相對豐度達(dá)到峰值（84.06%），這個(gè)時(shí)期部分果實(shí)表面開始出現(xiàn)黑色斑塊，斑塊上出現(xiàn)黑色顆粒狀物，形成黑色霉斑，依據(jù)形態(tài)學(xué)分析鑒定為典型的黑曲霉[15]；貯藏21 d時(shí)曲霉屬、單端孢屬和Penicillium占主要地位，果實(shí)表面部分病斑布滿淺粉紅色霉層，邊緣霉層為白色，病斑周圍有水漬狀，而軟化腐爛為粉紅單端孢的典型特征[16]，還有部分病斑為青綠色，病斑上有青綠色霉?fàn)钗?，與青霉菌引起的癥狀相符[17]。貯藏0 d時(shí)，果肉中鏈格孢屬、Papiliotrema和附球菌屬的相對豐度較高，隨著貯藏時(shí)間的推移，維什尼亞科齊馬菌屬、鏈格孢屬和單端孢屬轉(zhuǎn)變成優(yōu)勢菌群。貯藏7～14 d果實(shí)進(jìn)入衰老期，但果實(shí)無腐爛癥狀，維什尼亞科齊馬菌屬占據(jù)絕對優(yōu)勢，相對豐度分別為30.29%（7 d）和42.83%（14 d）；貯藏后期（21 d）單端孢屬相對豐度較高（29.64%），維什尼亞科齊馬菌屬和畢赤酵母屬次之，相對豐度分別為11.87%和8.97%。綜上，甜瓜貯藏期果皮和果肉中的優(yōu)勢菌屬存在較大差異，貯藏21 d時(shí)果皮中曲霉屬、鏈格孢屬、單端孢屬為優(yōu)勢菌屬，而果肉中的優(yōu)勢菌屬則為單端孢屬、維什尼亞科齊馬菌屬和畢赤酵母屬。

表1 甜瓜果實(shí)組織中真菌ASVs優(yōu)勢菌群相對豐度分析Table 1 Relative abundance analysis of dominant groups of fungal ASVs in melon fruit tissues %

2.2.5 基于種水平貯藏期甜瓜果皮和果肉組織中真菌結(jié)構(gòu)分析

如圖4所示，甜瓜貯藏期果皮和果肉24 個(gè)樣品中在種水平上注釋到相對豐度排名前10 位的優(yōu)勢菌群分別Vishniacozyma tephrensis（相對豐度8.21%）、粉紅單端孢（Trichothecium roseum）（相對豐度6.94%）、卡恩斯維希尼克氏酵母（Vishniacozyma carnescens）（相對豐度3.42%）、Filobasidium magnum（相對豐度2.59%）、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）（相對豐度2.42%）、產(chǎn)黃青霉菌（Penicillium chrysogenum）（相對豐度2.29%）、淺黃隱球酵母菌（Papiliotrema flavescens）（相對豐度2.11%）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）（相對豐度1.85%）、雜色曲霉（Aspergillus versicolor）（相對豐度1.73%）、限制馬拉色菌（Malassezia restricta）（相對豐度1.46%）和其他（相對豐度66.98%）。

貯藏0 d時(shí)，果皮中主要優(yōu)勢菌種為M. anisopliae、V. tephrensis、P. flavescens，隨著貯藏時(shí)間的延長，這些具有生防效果的菌群相對豐度大幅下降，并在貯藏14 d時(shí)基本消失，導(dǎo)致貯藏后期（21 d）T. roseum、P. chrysogenum、A. versicolor等致病菌迅速生長繁殖，促使甜瓜產(chǎn)生嚴(yán)重的粉霉病。果肉中真菌群落組成隨著貯藏時(shí)間的延長差異明顯，V. tephrensis、V. carnescens、F. magnum和P. flavescens相對豐度先上升后下降，貯藏21 d時(shí)T. roseum占絕對優(yōu)勢，因此，T. roseum是甜瓜采后不可忽視的病菌。

2.3 果實(shí)組織間顯著差異性群落和種群分析

使用ASV豐度特征表制作的維恩圖可以用來統(tǒng)計(jì)樣本之間共有和獨(dú)有的物種數(shù)目，從而直觀地顯示樣本在ASV水平上組成的相似性及重疊性。如圖5所示，由維恩圖解析不同貯藏期甜瓜果皮和果肉樣品及不同時(shí)期果實(shí)中真菌群落的異同，發(fā)現(xiàn)果皮中的ASV有57 個(gè)，果肉中的ASV有47 個(gè)，兩者共有的ASV有11 個(gè)，占ASV總數(shù)的10.75%，貯藏期果皮中的ASV多于果肉，由此可知，貯藏期果皮的真菌群落豐富度高于果肉。從貯藏0、7、14、21 d果實(shí)組織中檢測到的ASV分別為42、35、24、27 個(gè)，其特有的ASV分別為33、20、8、11 個(gè)，這4 個(gè)時(shí)期檢測出共有的ASV為4 個(gè)，貯藏期內(nèi)ASV數(shù)量呈先下降后上升的趨勢（圖6）。綜上，可通過高通量測序技術(shù)獲得較多真菌群落種類和豐富度方面的信息，在本研究貯藏條件下，只有一部分真菌進(jìn)一步生長，進(jìn)而在一定條件下導(dǎo)致甜瓜果實(shí)腐爛。

圖5 貯藏期甜瓜果皮和果肉樣品ASVs分布維恩圖Fig. 5 Venn diagram of ASV distribution in melon peel and pulp during storage

圖6 不同貯藏時(shí)期果實(shí)中真菌群落ASVs分布花瓣圖Fig. 6 Petal diagram of ASVs distribution of fungal communities in melon fruit at different storage periods

根據(jù)屬水平ASV平均豐度排名前20 位的菌群數(shù)據(jù)繪制熱圖，將不同的ASV根據(jù)操作分類單元豐度分布或樣本間的相似度加以聚類，熱圖中不同顏色可反映出不同時(shí)期甜瓜果實(shí)組織中真菌群落的相似性、差異性及物種聚類關(guān)系。如圖7所示，貯藏0 d時(shí)，剛采摘成熟的果實(shí)較新鮮，營養(yǎng)較豐富，附球菌屬（Epicoccum）、Papiliotrema、被孢霉屬（Mortierella）、馬拉色氏霉菌屬（Malassezia）、光黑殼屬（Preussia）、綠僵菌屬（Metarhizium）、阿德利長西氏酵母屬（Naganishia）是果實(shí)中積累的特異性真菌群落。附球菌屬能夠抵御細(xì)菌，也能引起甜瓜病害，王郅媛等[18]在華萊士甜瓜上分離得到黑附球菌并確定其為甜瓜的病原菌；Papiliotrema為一種酵母屬真菌；被孢霉屬在生物技術(shù)和生物轉(zhuǎn)化應(yīng)用方面具有重要的價(jià)值，同時(shí)還可以引起動(dòng)植物病害[19]；馬拉色氏霉菌屬是一種致病菌；綠僵菌屬為昆蟲病原菌；光黑殼屬是一種植物內(nèi)生菌[20]。

貯藏期內(nèi)甜瓜果實(shí)中積累的特異性真菌包括單端孢菌屬（Trichothecium）、畢赤酵母屬（Pichia）、葉黑粉菌屬（Entyloma）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）、Gibellulopsis、維什尼亞科齊馬菌屬（Vishniacozyma）、線黑粉酵母屬（Filobasidium）、帚枝霉屬（Sarocladium）。單端孢屬、青霉屬、曲霉屬是甜瓜采后致腐的主要病原菌；葉黑粉菌屬、節(jié)擔(dān)菌屬、帚枝霉屬和Gibellulopsis都是植物病原菌。葉黑粉菌屬能夠引起向日葵黑粉病[21]，節(jié)擔(dān)菌屬為煤污病病原菌[22]，帚枝霉屬可引起水稻鞘腐病[23]；畢赤酵母屬、維什尼亞科齊馬菌屬、線黑粉酵母屬為生防菌。綜上，隨著甜瓜果實(shí)的衰老，果實(shí)中積累的致病菌種類增多，同時(shí)也積累了大量的生防酵母菌，這為拮抗菌的分離提供了理論依據(jù)。

2.4 果實(shí)組織中真菌多樣性分析

Alpha多樣性是評價(jià)微生物群落豐度和多樣性的重要指標(biāo)，包括Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)。Chao1指數(shù)反映樣品中菌群的豐富度，其數(shù)值越大表明樣品中菌群越豐富。Shannon指數(shù)反映樣品中菌群的多樣性，其數(shù)值越大表明樣品中菌群的多樣性越高[24]。

由圖8可知，貯藏0～21 d的甜瓜樣品果皮Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均在貯藏7 d時(shí)升高，14 d時(shí)下降，貯藏21 d時(shí)再次升高；而果肉中Chao1指數(shù)呈上升趨勢，Shannon指數(shù)呈先上升后下降的趨勢。由此可知，貯藏期甜瓜果皮和果肉中真菌群落的豐度和多樣性存在差異，且果皮中的真菌群落豐度和多樣性都高于果肉。

圖8 甜瓜不同貯藏期果實(shí)組織中真菌Alpha多樣性Fig. 8 Fungal alpha diversity in melon fruit tissues at different storage periods

3 討 論

本研究以不同貯藏期的甜瓜為對象，利用高通量測序技術(shù)探究了甜瓜貯藏期果皮和果肉中真菌的群落結(jié)構(gòu)組成和相對豐度的變化趨勢，測序數(shù)據(jù)經(jīng)過去噪、質(zhì)控處理后，24 個(gè)樣品共得到1 638 150 條高質(zhì)量序列片段，平均長度為230 bp，同時(shí)共得到570 個(gè)ASV，共鑒定出真菌3 個(gè)門、23 個(gè)綱、54 個(gè)目、106 個(gè)科、123 個(gè)屬。ASV注釋結(jié)果表明，甜瓜貯藏期果皮和果肉24 個(gè)樣品中，子囊菌門和擔(dān)子菌門是門水平的優(yōu)勢菌群；在目水平，果皮中優(yōu)勢菌群為散囊菌目，而果肉中格孢腔菌目和銀耳目占優(yōu)勢；在屬水平，果皮中優(yōu)勢菌群從維什尼亞科齊馬菌屬、Papiliotrema和綠僵菌屬（貯藏0 d）變?yōu)榍箤?、單端孢屬和青霉屬（貯藏21 d），果肉中的優(yōu)勢菌群也隨著貯藏期的延長而改變，貯藏21 d時(shí)優(yōu)勢菌群為維什尼亞科齊馬菌屬、單端孢屬和畢赤酵母屬。由此可知，貯藏期甜瓜果實(shí)組織中真菌群落的豐度和多樣性存在差異，引起貯藏期甜瓜品質(zhì)劣變的真菌包括曲霉屬、單端孢屬、青霉屬、鏈格孢菌屬、鐮刀菌屬等，本研究結(jié)果與使用傳統(tǒng)方法對甜瓜果實(shí)進(jìn)行研究的結(jié)果相似，如利用純培養(yǎng)方法也得到了相同的純培養(yǎng)物[25-26]。

甜瓜目前面臨的主要保鮮問題仍是衰老引起的果實(shí)品質(zhì)劣變和微生物大量滋生繁殖導(dǎo)致的腐敗。隨著貯藏期的延長，甜瓜果實(shí)衰老逐漸加重，導(dǎo)致果實(shí)生理失調(diào)嚴(yán)重、抗性降低，同時(shí)也對果實(shí)中微生物群落的變化和動(dòng)態(tài)平衡產(chǎn)生極大的影響。本研究選取不同貯藏期甜瓜果皮和果肉組織，通過高通量測序分析其真菌群落結(jié)構(gòu)的變化，研究發(fā)現(xiàn)從新鮮甜瓜果皮中檢測出的優(yōu)勢菌群有維什尼亞科齊馬菌屬、鏈格孢屬、綠僵菌屬，此外還檢測到曲霉屬和單端孢菌屬，但相對豐度較低；而果肉中則以鏈格孢屬、Papiliotrema和附球菌屬為主。鏈格孢菌屬、曲霉屬和單端孢菌屬是甜瓜采后常見致病菌，由此推斷，病原菌在甜瓜果實(shí)生長發(fā)育過程中已潛伏侵染，這與馬文平等[27]的研究結(jié)果一致，即在甜瓜生長發(fā)育過程中，從開花至成熟期均可受到鏈格孢的侵染，且侵染率較高，粉紅單端孢主要侵染成熟的甜瓜果實(shí)。這一結(jié)果提示甜瓜采后黑斑病和粉霉病的發(fā)生也有可能源于生長期間即在果實(shí)中潛伏的鏈格孢屬和單端孢屬，因此生產(chǎn)中在采前進(jìn)行對采后病菌的防治可能會(huì)得到較好的效果，并有效保持采后果實(shí)品質(zhì)。

隨著貯藏時(shí)間的延長，果皮和果肉組織中的優(yōu)勢菌群都發(fā)生了顯著變化，貯藏中后期（14～21 d）果皮中維什尼亞科齊馬菌屬、畢赤酵母屬和Papiliotrema的相對豐度為0，說明該物種幾乎消失；而果肉中維什尼亞科齊馬菌屬的相對豐度在貯藏期先升高后降低，與其在菜心切口處的變化趨勢一致[13]，說明貯藏時(shí)間可影響其生長繁殖。果實(shí)組織中主要致病菌鏈格孢屬、單端孢屬、青霉屬、曲霉屬的相對豐度隨酵母菌相對豐度的變化呈先下降后升高的趨勢，最終大量生長繁殖并占據(jù)優(yōu)勢，導(dǎo)致果實(shí)腐爛。通常認(rèn)為維什尼亞科齊馬菌屬、Papiliotrema和畢赤酵母屬均為有益菌，研究表明維什尼亞科齊馬菌屬能夠有效抑制貯藏期擴(kuò)展青霉、Botrytis cinerea和枝孢霉對有機(jī)梨的侵染[28-29]；P. flavescen對小麥苗期莖基腐病有一定防治效果[30]；畢赤酵母可以有效延緩櫻桃番茄黑斑病的發(fā)展[31]。由貯藏期果實(shí)組織中優(yōu)勢菌群的改變可以推斷，酵母菌在貯藏前期可能通過營養(yǎng)競爭抑制了鏈格孢和單端孢屬等致病菌的生長，而后期由于大量消亡其競爭能力減弱，由于缺少了拮抗菌的防御，最終致使致病菌迅速生長繁殖并占據(jù)優(yōu)勢，從而致使果實(shí)腐爛嚴(yán)重。

本研究貯藏后期果實(shí)組織中真菌豐度整體下降，這與獼猴桃軟腐病發(fā)病過程中內(nèi)生真菌多樣性的研究結(jié)果[32]一致。出現(xiàn)這一結(jié)果可能是由于隨著貯藏時(shí)間的延長果實(shí)成熟衰老嚴(yán)重，果實(shí)中的營養(yǎng)流失較多，無法滿足微生物的正常營養(yǎng)代謝需求，導(dǎo)致大量微生物死亡，且病原微生物侵染果實(shí)后進(jìn)行代謝，釋放出有毒的代謝產(chǎn)物，使得微生物不能正常生長繁殖；同時(shí)，果實(shí)在受到病原物侵染后釋放出抑制微生物生長的揮發(fā)性物質(zhì)，最終使得果實(shí)在貯藏后期真菌群落不斷減少。

隨著貯藏時(shí)間的延長及果實(shí)的成熟與衰老，甜瓜采后病害逐漸加重，其生理變化導(dǎo)致營養(yǎng)流失，同時(shí)對果實(shí)中微生物群落的種類及動(dòng)態(tài)平衡均有很大影響，促使果實(shí)抗性降低，導(dǎo)致病害發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)研究果實(shí)內(nèi)微生物群落的動(dòng)態(tài)變化和相互關(guān)系，可為甜瓜采后病害的發(fā)生規(guī)律、病害防治以及拮抗菌的篩選提供理論依據(jù)。