羅世民 李中波

摘要：為探究非洲豬瘟病毒B646L基因序列的堿基組成特點，及預(yù)測該基因所編碼的p72蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與細胞抗原表位，利用PCR技術(shù)對非洲豬瘟病毒B646L基因ORF框的序列進行擴增、測序及堿基組成分析；運用軟件EXPASY、PRABI與SWISS-MODEL對p72蛋白質(zhì)進行理化性質(zhì)分析及二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；運用在線軟件ABCpred Prediction、Scratch、IEDB和NetCTL對p72蛋白在B、T細胞的抗原表位進行預(yù)測。結(jié)果表明，非洲豬瘟病毒B646L基因ORF框序列全長為1 941 bp，其中，堿基A含量為26.9%，T含量為28.9%，G含量為24.2%及C含量為20.0%，A+T的含量為55.8%，G+C的含量為44.2%，AT含量顯著高于GC含量；該序列共編碼646個氨基酸，p72蛋白大小為76 ku；在整個p72蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占19.35%，β-轉(zhuǎn)角占5.42%，無規(guī)卷曲占50.15%，擴展鏈為25.08%，以無規(guī)卷曲為主要結(jié)構(gòu)；該蛋白存在細胞質(zhì)的概率最大，其次是細胞核，存在于線粒體、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的概率較低；p72蛋白B淋巴細胞優(yōu)勢抗原表位分別為12～18 aa、27～37 aa、45～55 aa、77～88 aa、110～120 aa；T 淋巴細胞優(yōu)勢抗原表位分別為203～212 aa、298～307 aa、520～531 aa。說明非洲豬瘟病毒B646L基因ORF框序列呈明顯AT偏好性；p72蛋白為一親水性蛋白，其高級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)卷曲為主，且具有B、T淋巴細胞優(yōu)勢抗原表位，是檢測試劑和疫苗研發(fā)的理想靶標(biāo)。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒；B646L基因；p72蛋白；序列分析；結(jié)構(gòu)預(yù)測；抗原表位預(yù)測

中圖分類號：S852.65⁺1文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）16-0141-06

收稿日期：2022-09-04

基金項目：湖南省懷化市科學(xué)技術(shù)局項目（編號：2020R3107）；湖南省教育廳項目（編號：21C1443）；湖南省科技廳項目（編號：2022JJ50319）。

作者簡介：羅世民（1980—），男，湖南新化人，碩士，副教授，主要從事病原分子生物學(xué)診斷。E-mail：124328975@qq.com。

通信作者：李中波，男，湖南新寧人，碩士，實驗師，主要從事病原分子生物學(xué)診斷。E-mail：18390913065@163.com。

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒寄居于被感染豬的血液、組織液及內(nèi)臟器官內(nèi)所引起的且以高熱不退、全身出血、脾臟腫大及呼吸與神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為病理特征的一種急性、高傳染性、高致死性傳染病^［1-2］。1921年，該病首次于肯尼亞發(fā)現(xiàn)^［3］，隨后蔓延、擴散至非洲、歐洲及南美洲等多個國家和地區(qū)^［4］，現(xiàn)已呈世界性分布。目前，全球共有37個國家和地區(qū)的養(yǎng)豬業(yè)已受非洲豬瘟的影響^［5］。由于非洲豬瘟病毒在疾病擴散上具有高傳染性及在致病上具有高致死性等特點^［6-7］，故而自其被發(fā)現(xiàn)以來一直對生豬的健康生產(chǎn)產(chǎn)生嚴重威脅，極大地阻礙了全球畜牧業(yè)的發(fā)展?，F(xiàn)今，該病已被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為法定報告的動物疫病^［8］，在國內(nèi)也被認定為一類動物疫病^［9］。然而，迄今為止，市面上尚無該病的疫苗和治療特效藥^［10］。因此，對那些能編碼免疫原性蛋白的基因進行測序與分析，以及對具有疫原性蛋白進行結(jié)構(gòu)預(yù)測，已成為研制非洲豬瘟疫苗的關(guān)鍵。

非洲豬瘟病毒為由媒介生物傳播的雙股線性DNA病毒。據(jù)資料顯示，非洲豬瘟病毒的基因組全長為170～193 kb，共含150～167 個開放閱讀框，編碼150～200 種結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白^［7，11］，其中，p12、p30、p35、p54、p72、pK205R與CD2v等蛋白具有較高的免疫源性^［12］，常用于非洲豬瘟的快速診斷和ELISA檢測試劑盒的制備^［13］。有研究表明，p72蛋白是由B646L基因所編碼^［14］，大小約為 72 ku^［15］，為非洲豬瘟病毒粒子的主要衣殼蛋白，占比33%^［7］，具有構(gòu)象中和表位且能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體^［16］，是檢測試劑及疫苗開發(fā)的重要靶標(biāo)^［17］。如，Phillips M E等就利用p72蛋白制備了抗該蛋白的單克隆抗體^［18］；張文燕等在體外表達了全長和截短的p72蛋白，分析并比較了兩者的免疫源性及反應(yīng)源性^［7］。由此可見，p72蛋白在非洲豬瘟的檢測及疫苗研制等方面占有重要的一席之地，對其遺傳信息及生物學(xué)功能研究已成為有效防控非洲豬瘟不可或缺的內(nèi)容。因此，本研究擴增了非洲豬瘟病毒的B646L基因序列全長，并對其所編碼p72蛋白的結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，以期為今后非洲豬瘟疫苗的研制提供一些有用的信息，為進一步研究p72蛋白生物學(xué)功能奠定堅實基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 樣品來源

病料取于懷化市中方縣某養(yǎng)豬場，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，該病原體為非洲豬瘟病毒。

1.2 主要試劑

動物組織基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；2×EasyTaq PCR Super（Mix）保真酶，購自寶生物工程（大連）有限公司；蛋白酶K和DL-2 000 Marker，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

試驗于2021年9月懷化職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科技系分子實驗室中進行，首先以ASFV中國分離株P(guān)ig/HLJ的B646L基因（登錄號為MK333180）序列為參照序列，運用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計1對引物，序列為B646L-F：5′-TTAGGTACTNTAACGCAGCACAG-3′，B646L-R：5′-CATCAGGAGGAGCTTTTTGTC-3′，以擴增ASFV的B646L基因。再將設(shè)計好的引物序列發(fā)送至生工生物工程（上海）股份有限公司以進行生物合成。

2 方法

2.1 非洲豬瘟病毒的DNA提取

按照DNA提取試劑盒說明書，逐步提取非洲豬瘟病毒總DNA。再將DNA提取液于1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測DNA的提取是否成功。將陽性DNA提取液于-20 ℃保存、備用。

2.2 B646L基因的PCR擴增

以提取好的DNA為模板，利用引物、2×EasyTaq PCR Super（Mix）保真酶對非洲豬瘟病毒的B646L基因進行PCR擴增。PCR擴增體系（總體積為50 μL）：2×EasyTaq PCR Super保真酶（Mix） 25 μL，ddH₂O 22 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72? ℃延伸2 min，共運行35個循環(huán)；最后，72 ℃再延伸5 min。吸取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖上進行電泳檢測。將陽性PCR反應(yīng)液發(fā)送至生工生物（上海）有限公司進行雙向測序（每個樣3個生物學(xué)重復(fù)）。

2.3 原始序列的校準、比對與分析

利用軟件Chromas查看所有原始序列的測序峰圖^［19］，去除峰圖較差的序列；再將原始序列在NCBI中進行BLAST比對，確認其為目的基因序列；利用軟件DNASTAR對所獲序列進行堿基組成分析^［20］。

2.4 B646L基因序列的翻譯

利用在線軟件EXPASY對B646L基因序列進行翻譯^［21-22］，統(tǒng)計氨基酸數(shù)目，計算p72蛋白的分子量大小。

2.5 p72蛋白理化性質(zhì)的分析

將上述所得的氨基酸序列于在線工具ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）進行分析^［23］，以獲得p72蛋白分子質(zhì)量、等電點、原子組成及穩(wěn)定疏水性等理化性質(zhì)。

2.6 p72蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件SOMPA分析、計算p72蛋白所含的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲及擴展鏈的數(shù)目與百分比^［23］；利用在線軟件PRABI與SWISS-MODEL對p72蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測^［21］。

2.7 p72蛋白的定位分析

基于SVM算法和PSI-BLAST數(shù)據(jù)庫對p72蛋白的定位進行預(yù)測和分析^［21］。

2.8 p72蛋白B、T淋巴細胞抗原表位預(yù)測

利用在線工具ABCpred Prediction（http：//crdd.osdd.net/raghava/abcpred/ABC_ submission. html）、Scratch（http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu/）、IEDB （http：//www.Iedb.org/）對其優(yōu)勢 B淋巴細胞表位進行預(yù)測^［23］；利用在線軟件IEDB、NetCTL Server（www.cbs.dtu.dk/services/NetCTL/）預(yù)測優(yōu)勢 T 淋巴細胞表位^［23］。

3 結(jié)果與分析

3.1 B646L基因的PCR擴增

由圖1可知，所擴增的PCR產(chǎn)物為陽性，泳道內(nèi)僅含1個條帶，清晰，無拖尾或含其他雜帶，大小約為1 950 bp，與預(yù)期目的條帶大小相一致。測序所得序列為1 941 bp。

3.2 目的基因序列的校準、比對與提交

所獲原始序列經(jīng)校準后，其長度為1 941 bp；再于NCBI中進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)所獲序列與已公布B646L基因序列的相似度為99%～100%，確認該序列為目的基因序列。最后，將該基因序列提交到GenBank，獲得其基因登錄號為MK333180。

3.3 B646L基因序列堿基組成分析

對非洲豬瘟病毒B646L基因序列的堿基組成進行分析，結(jié)果顯示，在非洲豬瘟病毒的B646L基因序列中，A、T、G、C等4種堿基含量分別為26.9%、28.9%、24.2%和20.0%；A+T含量為55.8%，G+C含量為44.2%?？梢姺侵挢i瘟病毒的B646L基因序列的A+T含量高于G+C含量。

3.4 B646L基因序列的翻譯

由圖2可知，非洲豬瘟病毒B646L基因共編碼646個氨基酸。

根據(jù)所獲氨基酸序列，統(tǒng)計各種氨基酸在此氨基酸鏈的數(shù)目，并計算出其百分比。由表1可知，異亮氨酸占整個氨基酸鏈的百分比最高，其比例為7.7%，其后依次為亮氨酸和脯氨酸、天冬酰胺氨基酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸、賴氨酸、丙氨酸和組氨酸、精氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺、谷氨酸、色氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸。

3.5 p72蛋白的理化性質(zhì)分析

非洲豬瘟病毒p72蛋白的分子式為C_{3 303}H_{5 036}N₉₀₄O₉₄₈S₁₈，大小為76 ku，共含646個氨基酸，其中，強堿性氨基酸個數(shù)為60，強酸性氨基酸個數(shù)為59，脂肪族氨基酸指數(shù)為79.97，等電點為7.71，平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.392，不穩(wěn)定系數(shù)為38.3。

3.6 p72蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件SOMPA對p72蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果顯示，α-螺旋數(shù)目為125個，占19.35%；β-轉(zhuǎn)角數(shù)目為35個，占5.42%，無規(guī)卷曲數(shù)目為324個，占50.15%，擴展鏈數(shù)目為162個，占25.08%。同時，也對p72蛋白的氨基酸位點進行了分析，由圖3可知，p72蛋白所含的無規(guī)卷曲數(shù)目最多，其二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲為主。

此外，利用在線分析工具Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/）對p72蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。由圖4可知，非洲豬瘟病毒p72蛋白的三級結(jié)構(gòu)含有無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-折疊及 β-轉(zhuǎn)角等二級結(jié)構(gòu)，其中以無規(guī)卷曲的數(shù)目最多，占比最高；p72蛋白三級結(jié)構(gòu)的N端為一β-折疊結(jié)構(gòu)，而其C端為一α-螺旋，其GMQE為0.82，QMEAN4為0.76±0.05。與模型c612tB、c6ku9B相比，其覆蓋率均為100%，相似度卻分別為98%和100%。

3.7 p72蛋白的定位分析

基于SVM算法中的LOCSVMPSI預(yù)測方法及PSI-BLAST數(shù)據(jù)庫的HSLpred預(yù)測方法對p72蛋白的定位進行了預(yù)測，結(jié)果顯示，p72蛋白位于線粒體的可能性為4.3%，位于高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及分泌系統(tǒng)囊泡的概率均為4.3%，位于真核細胞核內(nèi)的概率為39.1%，位于真核細胞質(zhì)內(nèi)的概率為43.5%。

3.8 p72蛋白在B、T淋巴細胞抗原表位預(yù)測

運用軟件ABCpred Prediction、Scratch及IEDB對p72蛋白B淋巴細胞抗原表位進行預(yù)測（表2）。

運用在線預(yù)測工具NetCTL、IEDB對p72蛋白T淋巴細胞抗原表位進行預(yù)測（表3）。

4 討論

目前，關(guān)于ASFV的研究主要集中于2個方面，一是制備ASFV的抗體并將其應(yīng)用于該病毒的檢測中，以達到建立快速、精準檢測方法的目的；二是研究ASFV抗體的保護性及抗體對病毒粒子復(fù)制的影響和作用機制^［24］。一些研究結(jié)果表明，痊愈后和恢復(fù)期的病豬血清可保護健康豬，使其免受高毒力的ASFV攻擊^［25-26］，這為研發(fā)非洲豬瘟疫苗提供了思路和線索。眾所周知，非洲豬瘟病毒為一正二十面體粒子，其結(jié)構(gòu)主要由DNA核心、衣殼及囊膜組成^［27］，含150～200 種結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白^{［7，11］}，結(jié)構(gòu)蛋白A104R、A151R、EP153R、B602L、K78R、p30、p54 和 p72的功能已被鑒定出^［28］，其中由p30、p54 和 p72等蛋白所制備的抗體可抑制病毒的復(fù)制^［29］。此外，p72蛋白是ASFV衣殼的主要組成部分，并在病毒識別、結(jié)合及侵染宿主細胞等過程中起到十分關(guān)鍵的作用^［30］。再者，也有研究表明p72蛋白在不同ASFV株之間高度保守^［31-32］，并具有良好的抗原性和免疫源性，不僅是ASFV 在宿主細胞內(nèi)復(fù)制的指示器^［7］，也是檢測試劑及疫苗開發(fā)的重要靶標(biāo)。因此，本研究對ASFV的B646L基因序列進行分析，并預(yù)測其所編碼p72蛋白的結(jié)構(gòu)，以期為今后非洲豬瘟疫苗的研制提供一些有用的信息，為進一步研究p72蛋白生物學(xué)功能奠定堅實的基礎(chǔ)。

從非洲豬瘟病毒B646L基因序列的堿基組成來看，AT含量（55.8%）顯著高于GC含量（44.2%），與侯景等^［21］、申超超等^［33］研究的結(jié)果相一致，表明非洲豬瘟病毒B646L基因序列具有明顯的AT偏好性。

從p72蛋白的氨基酸組成及理化性質(zhì)來看，可知p72蛋白共含646個氨基酸，其中異亮氨酸（7.7%）、亮氨酸（7.3%）和脯氨酸（7.3%）為主要的氨基酸，其中強堿性氨基酸的數(shù)目為60個，所占百分比為9.29%，強酸性氨基酸數(shù)目為59個，所占百分比為9.13%。兩者數(shù)目及所占比例幾乎相等，故而推斷該蛋白呈中性，與它的等電點為7.71相一致。此外，根據(jù)該蛋白的平均親水系數(shù)為 -0.392，及不穩(wěn)定系數(shù)為38.3（<40），可以推斷非洲豬瘟病毒p72蛋白為一結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的親水性蛋白。

根據(jù)p72蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白含3種二級結(jié)構(gòu)，其中所含無規(guī)卷曲的數(shù)目最多（324，50.15%），其次為α-螺旋（125，19.35%），再次為β-轉(zhuǎn)角（35，5.42%），與高瞻等研究非洲豬瘟病毒p72蛋白二級結(jié)構(gòu)的結(jié)果^［23］相一致，暗示該蛋白以無規(guī)卷曲為主要結(jié)構(gòu)。然而，根據(jù)p72蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白三級結(jié)構(gòu)含4種（α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊及無規(guī)卷曲）二級結(jié)構(gòu)，但以無規(guī)卷曲為主要結(jié)構(gòu)，α-螺旋、β-折疊及β-轉(zhuǎn)角的數(shù)目及占比較低，與高瞻等所預(yù)測非洲豬瘟病毒p72蛋白三級結(jié)構(gòu)的結(jié)果^［23］相符。此外，由圖4可知，p72蛋白的三級結(jié)構(gòu)比較緊密，與上述推斷其為結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的結(jié)果相符合。

基于p72蛋白定位分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該蛋白存在細胞質(zhì)的概率最大（43.5%），其次是細胞核（39.1%），這主要因為病毒的衣殼合成及病毒粒子的組裝均在細胞質(zhì)中進行，故而該蛋白存在細胞質(zhì)的概率最高。然而，有學(xué)者推測非洲豬瘟病毒粒子的一些蛋白（包括p72蛋白）可能參與細胞核對核內(nèi)IFN-β或NF-κB的抑制作用，從而導(dǎo)致宿主的天然免疫系統(tǒng)不能抵抗病毒^［34］，所以p72蛋白存在細胞核的概率為39.1%。

目前，市面上尚無用于防治非洲豬瘟的商品化疫苗和藥物，但針對該病防控的核心是疫苗，而中和性抗原表位的研究卻又是疫苗研制的基礎(chǔ)^［15］。抗原表位，俗稱抗原決定簇，是病毒粒子結(jié)合淋巴細胞表面抗原受體的特定區(qū)段^［23］，能引發(fā)細胞、體液免疫反應(yīng)。在細胞免疫反應(yīng)過程中，T淋巴細胞受體（TCR）可在抗原的任何位置上識別線性表位，B淋巴細胞受體（BCR）能識別構(gòu)象表位（多肽、多糖、脂多糖）和線性表位，且識別位置通常處于抗原分子的表面。一般而言，蛋白質(zhì)的C 端因具有很好的親水性、柔性和表面可及性等特點，往往是良好的優(yōu)勢表位區(qū)域，然而本試驗所獲得的p72蛋白的C 端為一α-螺旋結(jié)構(gòu)（不易變形，且難以與抗體結(jié)合），很難形成表位。因此，p72蛋白C 端不作為抗原表位。然而，再根據(jù)p72蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)無規(guī)卷曲為該蛋白的主體結(jié)構(gòu)，在其中所占比例最高（50.15%），且該蛋白含有一定量的β轉(zhuǎn)角（5.42%），兩者均位于p72蛋白的表面，結(jié)構(gòu)突出、可及性強、易與抗體結(jié)合，成為抗原表位概率大，篩選出5個p72蛋白B 淋巴細胞優(yōu)勢抗原表位，它們分別為12～18 aa、27～37 aa、45～55 aa、77～88 aa及110～120 aa；篩選出3個p72蛋白T 淋巴細胞優(yōu)勢抗原表位，即分別為203～212 aa、298～307 aa、520～531 aa，與高瞻等所篩選出B、T 淋巴細胞優(yōu)勢抗原表位^［23］相同。

5 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，非洲豬瘟病毒B646L基因序列呈明顯的AT偏好特征，其所編碼的p72蛋白以無規(guī)卷曲為主要結(jié)構(gòu)，并具有B、T淋巴細胞優(yōu)勢抗原表位，是檢測試劑和疫苗研發(fā)的理想靶標(biāo)，不僅為非洲豬瘟病毒的感染機制研究提供了有用的信息，也為進一步研究p72基因生物學(xué)功能及疫苗的研制奠定堅實的基礎(chǔ)。

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