崔小月，尚泓泉，呂中偉，婁玉穗，張 柯

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002）

鈣一般以Ca2+的形式存在，是植物生長發(fā)育過程中一種必需的營養(yǎng)元素。一方面，作為構(gòu)成植物細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu)的必需物質(zhì)，Ca2+具有穩(wěn)定細胞壁、細胞膜和膜結(jié)合蛋白的功能[1]；另一方面，Ca2+又可作為一種信號分子響應(yīng)激素和多種逆境脅迫[2-3]。Ca2+濃度過高或過低均會影響植物的正常生長，過高的Ca2+濃度引起Ca2+中毒和代謝紊亂，過低的Ca2+濃度則會阻礙植物生長，且極易引發(fā)因缺素而產(chǎn)生的并發(fā)癥，嚴重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)[4]。因此，細胞質(zhì)Ca2+濃度的穩(wěn)定對于維持細胞功能十分重要，而Ca2+的穩(wěn)定主要依賴于Ca2+通道、Ca2+-ATPase 和Ca2+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白（CAX）等組成的Ca2+轉(zhuǎn)運系統(tǒng)[5-6]。其中，CAX 與CCX（Cation/Ca2+exchanger）、NCX 和NCKX（依 賴K+的Na+/Ca2+exchanger）、YRBG（原 核 生 物 特 有 的Na+/Ca2+exchanger）共同組成CaCA（Ca2+/Cation antiporter）超家族[5，7]。CAX 是一個多基因家族，主要定位在液泡或液泡膜上[8-10]，擬南芥中有6個AtCAX基因[11]，蘋果8個[4]，水稻6個[12]，均分為ⅠA和ⅠB 2個亞家族[13]。

研究表明，除了反向轉(zhuǎn)運Ca2+，CAX還可以轉(zhuǎn)運其他金屬離子。如擬南芥AtCAX1基因可以轉(zhuǎn)運Cd2+[14]，AtCAX2基因可以轉(zhuǎn)運包括Cd2+、Zn2+、Ca2+和Mn2+在內(nèi)的多種二價陽離子[15]，AtCAX4基因可以轉(zhuǎn)運Mn2+、Na+和Ni2+[16]，水稻OsCAX1和OsCAX3基因可以轉(zhuǎn)運Mn2+[17]等。除具有離子轉(zhuǎn)運功能外，CAX 還能參與響應(yīng)多種生物和非生物脅迫。目前，對植物CAX 基因在抵抗非生物脅迫中功能的研究主要集中在耐寒、耐旱、耐鹽和耐滲透脅迫方面。例如，AtCAX1的表達受低溫誘導(dǎo)，受干旱抑制，cax1擬南芥突變體通過誘導(dǎo)CBF/DREB1的表達提高了植物的抗寒性[18]。蘋果MdCAX基因?qū)Σ煌柠}離子脅迫有不同的響應(yīng)[4]。脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）和PEG 脅迫誘導(dǎo)甘蔗ScCAX1基因的表達，茉莉酸甲酯（MeJA）和NaCl 處理下ScCAX1基因的表達量也會發(fā)生變化，推測ScCAX1的表達可能與甘蔗的耐鹽和滲透脅迫有關(guān)[19]。一些學(xué)者認為CAX 基因正向調(diào)控植物耐鹽性。在擬南芥中過表達萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CrCAX1和 大 豆GmCAX1均提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽脅迫的耐受性[20-21]。共表達AtCAX1和AtCAX3基因能夠提高酵母細胞在鹽脅迫下的生長速率，突變AtCAX1和AtCAX3基因的擬南芥雙突變體表現(xiàn)出對鹽脅迫更敏感[22]。然而，另一些學(xué)者持有不同的觀點，認為CAX 基因負向調(diào)控植物的耐鹽性。例如，過表達OsCAX4基因的酵母細胞對鹽脅迫的耐受性降低[23]。過表達堿蓬（Suaeda salsa）SsCAX1的轉(zhuǎn)基因擬南芥液泡膜透性、K+含量和V-H+-ATPase 水解酶活性都發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出比野生型更敏感的鹽脅迫耐受性[24]。蕪菁（Brassica rapa）BraA.cax1突變體能夠改善鹽脅迫下植物的光合性能[25]。此外，過表達AtCAX4基因可以在不影響植物生長的情況下，適當提高轉(zhuǎn)基因番茄的Ca2+含量，延長其貨架期[26]。

目前，關(guān)于植物中CAX 基因家族的研究主要包括擬南芥、水稻、蘋果和甘藍型油菜等[4，7，27]，在葡萄中尚未見相關(guān)報道。葡萄基因組的公布[28-29]使得對葡萄CAX 基因家族的鑒定和分析成為可能。本研究通過生物信息學(xué)分析方法鑒定歐洲葡萄CAX 基因家族的成員，進行包括理化性質(zhì)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、系統(tǒng)進化樹等分析，并預(yù)測了VvCAX基因的上游轉(zhuǎn)錄因子和啟動子中存在的順式作用元件。通過分析VvCAX基因在葡萄不同組織中和多種脅迫下的表達水平預(yù)測VvCAX基因的生物學(xué)功能，以期為進一步驗證VvCAX基因的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 歐洲葡萄CAX基因家族成員鑒定

歐洲葡萄全基因組序列、蛋白序列和注釋文件從Ensemble Plants（http://plants.ensembl.org/index.html）下載，CAX基因家族成員的鑒定基于隱馬爾可夫模型，通過搜索關(guān)鍵詞的方法在Pfam 網(wǎng)站（https：//pfam-legacy.xfam.org/）得到CAX家族的保守結(jié)構(gòu)域模型（PF01699）并下載其hmm 文件，E 值設(shè)置為＜e-6，通過軟件TBtools獲得潛在的VvCAX序列。經(jīng)CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）進行保守結(jié)構(gòu)域分析，得到含有CAX 蛋白保守結(jié)構(gòu)域的序列。將獲得的序列與擬南芥的6個CAX序列進行比對和進化樹分析，采用鄰接法（Neighbor-joining algorithm）、泊 松 模 型（Poisson model）、成對刪除（Pairwise deletion）、Bootstrap 重復(fù)1 000次，最終獲得VvCAX的全部成員。

1.2 歐洲葡萄CAX基因家族生物信息學(xué)分析

根據(jù)葡萄基因組序列，利用TBtools獲得葡萄各條染色體的長度，VvCAX家族基因的染色體定位通過MapGene2Chromosome v2（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）呈現(xiàn)，并根據(jù)各基因在染色體上的位置依次對其進行命名。利用ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）分析葡萄CAX 蛋白的氨基酸數(shù)目、分子質(zhì)量、等電點、脂溶指數(shù)、總平均疏水指數(shù)，TMHMM-2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）用于分析跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目。VvCAX基因家族成員的二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、亞細胞定位、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分別通過SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）、SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）、WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）、GSDS 2.0（Gene Structure Display Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）和MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）進行分析。

1.3 多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過ClustalX 2 對5 個VvCAX 的氨基酸序列進行比對分析。為了了解CAX 基因家族的進化關(guān)系，通過MEGA 6軟件，用鄰接法對已鑒定的歐洲葡萄、擬南芥、甘藍型油菜、水稻和蘋果的CAX 家族蛋白質(zhì)進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，Bootstrap 值設(shè)置為1 000。通過在線軟件EvolView（https://www.evolgenius.info//evolview/#login）將結(jié)果進行可視化。

1.4 共線性和進化選擇壓力分析

根據(jù)葡萄基因組序列、蛋白組序列和注釋文件，利用TBtools 比對葡萄蛋白組獲得CAX 基因在葡萄基因組中的重復(fù)序列，通過TBtools 的Advanced Circos功能將共線性結(jié)果進行可視化。此外，使用TBtools 的Simple Ka/Ks Calculator 功能計算進化速率，包括非同義突變率（Ka）、同義突變率（Ks）及其比值Ka/Ks。

1.5 啟動子順式作用元件預(yù)測

為了進一步探索VvCAX家族的功能，分析了家族各基因啟動子的順式作用元件。將家族每個基因起始密碼子上游2 000 bp 的序列提交至PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）用于啟動子分析，通過GSDS 2.0 將結(jié)果進行可視化。

1.6 VvCAX的互作蛋白分析

根據(jù)VvCAX 的氨基酸序列，在網(wǎng)站STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl? UserId=1vwOzleiKhas&sessionId=5lLmnN0J8SUO&input_page_active_form=single_sequence）預(yù) 測 其 互 作 蛋 白 ，利 用PlantRegMap 數(shù)據(jù)庫（http://plantregmap.gao-lab.org/network.php）鑒 定VvCAX1、VvCAX2、VvCAX3、VvCAX4和VvCAX5基因上游可能存在的轉(zhuǎn)錄因子，利用軟件Cytoscape將結(jié)果進行可視化。

1.7 VvCAX基因的表達模式分析

供試材料紅地球葡萄保存于河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地葡萄示范園，采集成熟葉、幼葉、卷須、花、果、莖用于組織特異性分析。ABA 處理下VvCAX基因在赤霞珠葡萄不同組織的表達變化分析基于微陣列數(shù)據(jù)（GSE78798）進行，機械損傷、紫外線照射和霜霉菌侵染時黑比諾葡萄VvCAX基因的表達變化基于微陣列數(shù)據(jù)（GSE37743）進行。長勢一致且生長健壯的紅地球葡萄葉片用于非生物脅迫處理，將采回的葉片葉柄用濕棉花包裹，置于放有濕濾紙的托盤上，分別對葉片進行4、40 ℃和10%PEG 6000 處理，并分別于處理的0、2、4、8、12、24 h取樣，每個處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

將樣品在液氮中研磨，使用E.Z.N.A.?植物總RNA 試劑盒（OMEGA，美國）按照說明書提取RNA。利用諾萊酶公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 的第一條鏈，稀釋到質(zhì)量濃度為100 ng/μL 后用作實時熒光定量PCR（qRT-PCR）的模板。使用Primer3（https://primer3.ut.ee/）設(shè)計基因的特異性qRT-PCR引物，內(nèi)參基因為VvActin7（Accession no.XM_002282480），各引物序列如表1 所示。qRT-PCR 的反應(yīng)體系和程序參照丁蘭等[30]的方法，每個處理設(shè)置3 個重復(fù)，基因相對表達量采用2-ΔΔCT法分析，誤差線代表3 次生物學(xué)重復(fù)的標準誤差（SE）。使用SPSS 23.0 采用圖基檢驗進行單因素方差分析（P＜0.05）。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 qRT-PCR primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 VvCAX基因家族的鑒定和特征分析

根據(jù)CAX家族的保守結(jié)構(gòu)域模型（PF01699）的hmm 文件，通過軟件TBtools 獲得26 條潛在的VvCAX 序列，符合E 值＜e-6且包含Na_Ca_ex 結(jié)構(gòu)域的序列有22 條。將這22 條序列與擬南芥的6 個CAX 進行系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，22 條序列中有5 個CAX 家族成員（圖1A），因此，歐洲葡萄中共存在5個CAX 基因。經(jīng)染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，5 個CAX基因分布在葡萄的5 條染色體上，每條染色體上分布1 個VvCAX基因（圖1B），根據(jù)它們在染色體上的位置，依次命名為VvCAX1—VvCAX5。理化性質(zhì)分析（表2）顯示，VvCAX家族基因編碼區(qū)長度為1 341～1 566 bp，編碼446～521 個氨基酸，等電點為5.38～7.25，其中，VvCAX3 為堿性蛋白，其余4 個為酸性蛋白。5 個VvCAX 蛋白均為較為穩(wěn)定（脂溶指數(shù)＜90）的疏水性（總平均疏水指數(shù)＜0）蛋白質(zhì)，且含有10～11 個跨膜結(jié)構(gòu)域。VvCAX 蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋和無規(guī)則卷曲，占比超過80%，主要定位在質(zhì)膜和液泡上（表3）。對VvCAX 進行三級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，所有VvCAX蛋白的三級結(jié)構(gòu)非常相似且均為單體（圖1C）。

圖1 VvCAX家族聚類（A）、染色體分布（B）及三級結(jié)構(gòu)（C）分析Fig.1 Cluster（A），chromosome distribution（B）and tertiary structure（C）analysis of VvCAX family

表2 VvCAX基因家族的理化性質(zhì)Tab.2 Physiochemical properties of VvCAX gene family

表3 VvCAX家族成員的二級結(jié)構(gòu)和亞細胞定位Tab.3 Secondary structure and subcellular localization prediction of VvCAX proteins

2.2 VvCAX家族的氨基酸序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，VvCAX 有10～11 個跨膜結(jié)構(gòu)域（TM）和4 個典型的功能域，分別是N 端自抑制區(qū)域（NRR）、Ca2+功能域（CaD）、C 功能域和D 功能域，且在TM3 與TM4、TM8 與TM9 之間包含與轉(zhuǎn)運特異性離子有關(guān)的保守氨基酸重復(fù)序列c-1 和c-2（圖2）。對歐洲葡萄VvCAX1—VvCAX5、擬南芥AtCAX1—AtCAX6、甘藍型油菜BnaCAX1-1—BnaCAX5-3、蘋果MdCAX1—MdCAX8 和水稻OsCAX1—OsCAX4共42 個CAX 家族蛋白進行系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，VvCAX 蛋白可分為2 個亞家族，分別為亞家族ⅠA和ⅠB。其中，亞家族ⅠA包含2個成員，即VvCAX1和VvCAX2，亞家族ⅠB包含3個成員，即VvCAX3—VvCAX5（圖3）。

圖2 歐洲葡萄CAX蛋白的氨基酸序列比對分析Fig.2 Amino acid sequence alignment analysis of VvCAX proteins

圖3 歐洲葡萄、擬南芥、甘藍型油菜、蘋果和水稻CAX蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of CAX proteins in Vitis vinifera，Arabidopsis thaliana，Brassica napus，Malus domestica and Oryza sativa

2.3 VvCAX家族保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

利用在線工具MEME 通過氨基酸序列預(yù)測VvCAX 家族的保守基序，保守基序個數(shù)設(shè)置為10，其他參數(shù)設(shè)置為默認。由圖4A 可知，所有VvCAX家 族 成 員 均 含 有motif1、motif2、motif3、motif4、motif5、motif6、motif7 和motif9。此外，亞家族ⅠA 還包含motif10，亞家族ⅠB還包含motif8。經(jīng)PFAM 檢測，motif1—motif6 均包含Na_Ca_ex 保守結(jié)構(gòu)域，除此之外，motif2 中還含有一個功能未知的DUF3935結(jié)構(gòu)域，motif4 中還含有一個抗溴氰菊酯的結(jié)構(gòu)域和一個未知的DUF423結(jié)構(gòu)域，motif6中還含有一個糖基水解酶結(jié)構(gòu)域。通過對VvCAX基因家族進行基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，所有VvCAX基因都含有9～11個內(nèi)含子（圖4B）。

圖4 VvCAX家族的保守基序（A）和基因結(jié)構(gòu)（B）Fig.4 The conserved motifs of VvCAX proteins（A）and the exon-intron structure of VvCAX genes（B）

2.4 VvCAX基因復(fù)制事件分析

結(jié)合VvCAX基因在染色體的位置，共發(fā)現(xiàn)了7對VvCAX基因位于歐洲葡萄基因組的重復(fù)位置，即歐洲葡萄共經(jīng)歷了7 次與CAX 家族有關(guān)的基因復(fù)制事件，且7 次均為片段重復(fù)事件（圖5）。通過進化選擇壓力分析發(fā)現(xiàn)，6 對片段復(fù)制的VvCAX基因的Ka/Ks 值小于1（表4），為純化選擇作用。VvCAX2與VvCAX5的序列分歧度太大，進化距離很遠，表明這2 個基因在進化過程中發(fā)生了較大程度的非同義突變。

表4 發(fā)生基因復(fù)制的VvCAX成員的進化選擇壓力分析Tab.4 Analysis of evolutionary selection pressure of VvCAX members with gene replication

2.5 VvCAX的互作蛋白分析

根據(jù)VvCAX 的氨基酸序列預(yù)測得到的候選互作蛋白如圖6 所示，多數(shù)與離子轉(zhuǎn)運和鈣相關(guān)。其中 SLC6、CaCA、TPC1、PEI12、Ion_trans、ATPsynt_ab 和nramp6 分別和至少2 個VvCAX 蛋白互作。SLC6和CaCA 均屬于鈣離子轉(zhuǎn)運蛋白，TPC1是一個鈣離子通道蛋白，PEI12 編碼一個果膠酯酶抑制劑，Ion_trans、ATP-synt_ab 和nramp6 均參與離子轉(zhuǎn)運。VvCAX3 和VvCAX5 的互作蛋白大都相同，VvCAX4 與其他VvCAX 蛋白的互作蛋白完全不同。由 圖7 可 知，VvCAX1、VvCAX2、VvCAX3、VvCAX4、VvCAX5基因的上游分別存在17、14、12、3、14 個轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子包括MYB、ERF、C2H2、MADS、AP2等。

圖6 VvCAX蛋白與其候選互作蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Fig.6 The network relationships between VvCAX proteins and their candidate interacting proteins

圖7 VvCAX基因的上游調(diào)控因子Fig.7 Upstream regulatory factors of VvCAX genes

2.6 VvCAX基因啟動子順式作用元件分析

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，除了CAAT、TATA 和光響應(yīng)元件外，VvCAX基因家族啟動子中出現(xiàn)頻率最高的作用元件是Dof（90個），其次是激素（赤霉素、乙烯、水楊酸、茉莉酸甲酯、脫落酸和生長素）響應(yīng)元件（40個），MYB 和MYC 結(jié)合元件緊隨其后（圖8），表明VvCAX基因可能參與調(diào)控激素響應(yīng)。VvCAX1和VvCAX2的啟動子具有最豐富的MYB 結(jié)合元件；VvCAX4和VvCAX5的啟動子具有最豐富的赤霉素響應(yīng)元件；VvCAX5的啟動子具有最豐富的乙烯響應(yīng)元件；VvCAX4的啟動子具有最豐富的水楊酸響應(yīng)元件；僅VvCAX2和VvCAX5的啟動子具有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件；僅VvCAX2和VvCAX4的啟動子具有脫落酸響應(yīng)元件；僅VvCAX5的啟動子具有生長素響應(yīng)元件。此外，一些VvCAX基因的啟動子中還含有響應(yīng)機械損傷、低溫、防御和脅迫反應(yīng)的順式作用元件（圖8）。

圖8 VvCAX基因家族啟動子順式作用元件分析Fig.8 Analysis of cis-acting elements of VvCAX gene promoters

2.7 VvCAX基因的表達模式分析

分析了4個VvCAX基因在歐洲葡萄品種紅地球不同組織中的相對表達量發(fā)現(xiàn)，ⅠA 亞家族的VvCAX1和VvCAX2基因在花中的表達量最高；ⅠB亞家族的VvCAX3和VvCAX5基因主要在葡萄成熟葉和卷須中表達（圖9）。對赤霞珠葡萄的漿果、枝條、葉片、根和懸浮細胞進行10 μmol/L ABA 處理2 h 后發(fā)現(xiàn)，與對照（含有0.05%免疫佐劑和0.002%乙醇的蒸餾水處理）相比，ABA 能夠提高VvCAX1和VvCAX2基因在葉片中的表達量，降低VvCAX3、VvCAX4和VvCAX5基因在葉片中的表達量（圖10A）。對黑比諾葡萄進行創(chuàng)傷和霜霉菌侵染發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷和霜霉菌處理后，VvCAX1表達水平降低，VvCAX2基因表達水平升高，ⅠB 亞家族的VvCAX基因變化不明顯；紫外線處理后，ⅠA 亞家族的VvCAX基因表達下調(diào)，ⅠB 亞家族的VvCAX基因表達上調(diào)（圖10B）。對紅地球葡萄葉片進行4 ℃低溫處理發(fā)現(xiàn)，短時間（2 h）的低溫抑制VvCAX基因的轉(zhuǎn)錄，所有VvCAX基因的轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)出“下降—升高—下降”的趨勢，其中VvCAX1基因?qū)Φ蜏孛{迫最敏感，在處理8 h 時轉(zhuǎn)錄水平達到最大值，約為處理前的3 倍（圖11A）。4 個VvCAX基因?qū)Ω邷兀?0 ℃）均有響應(yīng)，其中VvCAX1和VvCAX5響應(yīng)最為明顯（圖11B）。ⅠA 亞家族的VvCAX基因比ⅠB 亞家族的VvCAX3和VvCAX5基因?qū)EG 6000 模擬的干旱脅迫更敏感（圖11C）。以上結(jié)果表明，位于同一亞家族的VvCAX基因具有相似的表達模式，可能具有相似的生物學(xué)功能，所有VvCAX基因均響應(yīng)ABA，ⅠA亞家族的VvCAX基因可能與創(chuàng)傷、霜霉菌、干旱和低溫相關(guān)，ⅠB 亞家族的VvCAX基因則可能與高溫有關(guān)。

圖9 紅地球葡萄不同組織中VvCAX基因的表達水平Fig.9 Expression levels of VvCAX genes in different tissues of Red Globe grape

圖10 不同處理后VvCAX基因的表達模式熱圖Fig.10 The expression pattern heat map of VvCAX genes under different treatments

圖11 不同處理后VvCAX基因的表達水平Fig.11 The expression levels of VvCAX genes under different treatments

3 結(jié)論與討論

CAX 是一類廣泛存在于自然界中的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白[5]。目前，CAX 家族基因已在擬南芥[11]、蘋果[4]、丹參[31]、甘藍型油菜[27]、森林草莓[32]、水稻[12]和楊樹[33]等物種中被鑒定。但是，迄今為止還未見到關(guān)于葡萄CAX 基因家族的系統(tǒng)研究。本研究從歐洲葡萄基因組中鑒定出5 個CAX 基因，與二倍體植物擬南芥、水稻、蘋果、森林草莓、丹參和楊樹的基因數(shù)量相仿，少于四倍體植物甘藍型油菜基因數(shù)量。VvCAX1和VvCAX2屬 于ⅠA 亞 家 族，VvCAX3、VvCAX4和VvCAX5屬 于ⅠB 亞 家 族，預(yù) 示 著 葡 萄CAX基因的功能可能存在分化。

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，VvCAX 蛋白均為疏水蛋白，同一亞家族的成員表現(xiàn)出相似的結(jié)構(gòu)特征，如跨膜結(jié)構(gòu)域和內(nèi)含子數(shù)量、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、保守基序等，這種現(xiàn)象也出現(xiàn)在擬南芥[11]、水稻[12]和蘋果[4]等物種中，表明CAX 家族在進化過程中具有保守性。亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，VvCAX 主要定位在質(zhì)膜和液泡上，與前人在其他物種上的研究結(jié)果相同[20，23，34-35]，但還需要進一步進行試驗驗證。共線性分析結(jié)果顯示，葡萄基因組內(nèi)存在7 對同源的VvCAX基因，然而所有同源基因均分布在不同的染色體上，不存在串聯(lián)復(fù)制的情況。其中6 對同源基因的Ka/Ks 值小于1，表明這6對VvCAX基因在葡萄的進化過程中發(fā)生了純化選擇作用，基因功能保守。VvCAX2和VvCAX5基因表現(xiàn)出較大的序列分歧度，可能具有不同的生物學(xué)功能。

CAX 基因家族在不同的組織中表達豐度不同。AtCAX1、AtCAX2和AtCAX5基因在根、葉、花和種子中特異性表達，AtCAX3基因在根、花和種子中表達，而AtCAX4基因僅在根和葉中特異性表達[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，ⅠA 亞家族的VvCAX基因在紅地球葡萄花中的表達量最高，ⅠB 亞家族的VvCAX3和VvCAX5基因主要在葡萄成熟葉和卷須中表達，暗示了這2個亞家族的VvCAX基因在不同的組織和發(fā)育階段中發(fā)揮作用。

轉(zhuǎn)錄因子可通過與下游基因啟動子中的順式作用元件結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因的表達。前人研究發(fā)現(xiàn)，MYB、Dof、WRKY、W-box、MBS 和LTR等順式作用元件在調(diào)控植物CAX 基因響應(yīng)外界脅迫時發(fā)揮了重要作用[27，32]。本研究中，VvCAX基因上游可能存在一些轉(zhuǎn)錄因子，如MYB、Dof、ERF 等，啟動子序列中也包含相應(yīng)的的順式作用元件（MYB、Dof、ERE），推測VvCAX基因可能響應(yīng)激素和脅迫反應(yīng)。為了證明這一推論，分析了不同條件下VvCAX基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)VvCAX家族基因在不同處理下表達豐度不同。對赤霞珠葡萄的各組織和器官進行10 μmol/L ABA 處理2 h 后，2 個亞家族VvCAX基因表現(xiàn)出相反的表達趨勢。創(chuàng)傷和霜霉菌侵染后VvCAX1基因的表達量均下降，其余4 個VvCAX基因受到創(chuàng)傷和霜霉菌侵染后表達量增加，但ⅠB 亞家族的VvCAX基因表達水平變化不大。VvCAX5基因受紫外線影響不大，VvCAX1和VvCAX2基因受到紫外線的抑制，VvCAX3和VvCAX4基因受到紫外線的誘導(dǎo)。擬南芥AtCAX1與植物的抗寒性密切相關(guān)[18，36]，與其處于同一分支的VvCAX1基因在紅地球受到低溫脅迫后表達上調(diào)，推測VvCAX1基因可能參與調(diào)控植物的低溫脅迫耐受性。VvCAX1和VvCAX5基因?qū)Ω邷氐捻憫?yīng)最為明顯，表明這2個基因可能參與調(diào)控高溫脅迫。ⅠA 亞家族的VvCAX基因比ⅠB 亞家族的VvCAX3和VvCAX5基因?qū)EG 6000 模擬的干旱脅迫更敏感，表明ⅠA 亞家族的VvCAX基因更有可能與干旱脅迫相關(guān)。此外，ⅠA亞家族的AtCAX1、AtCAX3和AtCAX4還具有響應(yīng)滲透脅迫、磷缺乏和有毒金屬的功能，ⅠB 亞家族的AtCAX2和AtCAX5具有響應(yīng)低溫、滲透和有毒金屬的功能[7]。以上結(jié)果表明，VvCAX基因可能具有響應(yīng)多種脅迫的功能，但是還需進行進一步的驗證。