徐芳芳，鄭 磊，琚 銘，馬 琴，李 春，段迎輝，張仙美，苗紅梅

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 芝麻研究中心，河南 鄭州450002；2.河南省特色油料基因組學重點實驗室，河南 鄭州450002；3.漯河市農(nóng)業(yè)科學院，河南 漯河462300）

芝麻（Sesamum indicumL.，2n=26）屬胡麻科胡麻屬，是世界上最古老的油料作物之一，也是我國重要的特色優(yōu)質(zhì)油料作物。芝麻籽粒含有豐富的脂肪（50%～60%）、蛋白質(zhì)（18%～24%）、多糖、膳食纖維以及維生素和微量元素[1]。其中粗脂肪含量為50%～60%，主要由油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸組成，占油分總量的80%以上。因此，芝麻油被認為是最為理想的植物油脂[1-2]。此外，芝麻籽粒中還含有芝麻酚、芝麻素等抗氧化物質(zhì)，廣泛應用于食品、營養(yǎng)保健、制藥及工業(yè)等各行業(yè)[1，3]。

芝麻屬于高含油量作物。但是在現(xiàn)有芝麻種質(zhì)資源中，籽粒油分含量和蛋白質(zhì)含量的變化范圍較大，分別為29.5%～62.7%和12.9%～31.0%[4-5]。研究表明，芝麻油分含量和蛋白質(zhì)含量等品質(zhì)性狀屬于數(shù)量性狀，受多基因控制，遺傳特性較為復雜[6-8]；同時，油分含量性狀易受基因型+環(huán)境共同影響，對優(yōu)質(zhì)新品種選育有一定的影響[9-10]。在高油、高蛋白等優(yōu)質(zhì)芝麻種質(zhì)鑒定及品種選育過程中，目前多采用傳統(tǒng)的化學法、核磁共振法以及近紅外光譜法進行表型測定，工作量大、耗時長[5，11-12]。發(fā)掘品質(zhì)相關分子標記和基因標記為快速精準鑒定和選育高油、高蛋白等優(yōu)質(zhì)芝麻新品種提供了可靠途徑。危文亮等[11]利用43 對SRAP（相關序列擴增多態(tài)性）引物、20 對SSR（簡單重復序列標記）引物以及16 對AFLP（擴增片段長度多態(tài)性）引物，對216 份芝麻種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析、群體結構分析和油分含量性狀關聯(lián)分析，在2 個環(huán)境下重復檢測出3個SRAP 標記和5個SSR 標記與油分含量性狀極顯著關聯(lián)。LI 等[6]利用自主研發(fā)的112 對多態(tài)性SSR標記，對來自國內(nèi)外的369 份芝麻種質(zhì)進行了5 個環(huán)境下的油分含量和蛋白質(zhì)含量性狀的關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)芝麻油分含量與蛋白質(zhì)含量呈極顯著負相關關系，共有19 個SSR 標記與油分含量緊密連鎖，24個SSR 標記與蛋白質(zhì)含量緊密關聯(lián)，且2 組中的SSR 標記存在重合現(xiàn)象，進一步證實了芝麻油分含量與蛋白質(zhì)含量之間存在一定的負相關關系。近幾年來，借助于高通量測序技術和芝麻參考基因組信息，人們開展了芝麻油分含量全基因組關聯(lián)及基因定位克隆研究[13-17]。一批油分含量相關的SSR 標記、SNP（單核苷酸多態(tài)性）標記、數(shù)量性狀QTL及基因被發(fā)掘，為加快芝麻品質(zhì)分子育種提供了重要信息[18]。但是，截至目前，鮮有SSR等分子標記用于高油芝麻種質(zhì)和品種精準鑒定與評價的報道。鑒于此，為搭建并完善芝麻分子標記輔助育種技術體系，利用自主篩選的24 個多態(tài)性SSR 標記，對48 個高/低油分含量芝麻種質(zhì)開展基因型鑒定，篩選出可以用于準確判定芝麻油分含量水平的SSR 標記，確定高油分相關SSR 標記鑒定方法和優(yōu)異等位位點信息，為實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)芝麻分子標記輔助育種提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

48 份芝麻種質(zhì)由河南省農(nóng)業(yè)科學院芝麻研究中心提供，油分含量在50%以上的樣本為高油分樣本，低于50%的為低油分樣本。2018年6月將48份芝麻種質(zhì)種植于河南省農(nóng)業(yè)科學院河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地，每個樣本種植2 行，行長5 m，行寬40 cm，株距20 cm。采用標準種植管理方式進行管理。采集現(xiàn)蕾期相同部位幼嫩葉片，液氮速凍后，-70 ℃保存，用于DNA 提取。成熟后收獲各樣本種子，用于品質(zhì)測定。

1.2 油分含量檢測

芝麻籽粒油分含量數(shù)據(jù)采集采用近紅外光譜法進行[12]，利用瑞典Perten 公司生產(chǎn)的DA-7200 型近紅外光譜儀測得。測定前，各測試樣本籽粒均精選、去除雜質(zhì)；重復測定2～3次。近紅外光譜檢測用譜段為950～1 650 nm，采樣間隔2 nm。

1.3 SSR引物合成

24 對SSR 標記的引物序列信息參考LI 等[6]獲得，引物合成由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.4 SSR引物PCR檢測

采用CTAB 法（QIAGEN，Hilden，Germany）提取各芝麻樣本葉片DNA，用于SSR 標記PCR 擴增和檢測。PCR 反應體系：引物對（0.2 μmol/L）4 μL，模板DNA（50 ng/μL）1 μL，10×Buffer（含Mg2+）1 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.2 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，加入無菌雙蒸餾水至10 μL。PCR反應程序包括：95 ℃2 min；95 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，30個循環(huán)；72 ℃5 min，4 ℃保存。

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳與帶型統(tǒng)計

參照魏利斌等[13]的方法對PCR 產(chǎn)物進行9%聚丙烯酰胺凝膠電泳；銀染法染色，然后照相觀察。DNA Marker 為DL 500 bp DNA Marker（英邁捷公司，中國）。根據(jù)電泳結果統(tǒng)計每個SSR 引物對擴增后形成的位點，以“1”和“0”分別記錄等位位點的有無，即：“1”表示“有帶”；“0”表示“無帶”；“-”表示“缺失”。

1.6 SSR標記數(shù)據(jù)分析

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結果，統(tǒng)計并建立24個SSR 標記數(shù)據(jù)矩陣。利用Excel 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計；采用DPS統(tǒng)計分析軟件進行SSR標記方差分析。

2 結果與分析

2.1 48個芝麻樣本的油分含量分布

本研究選用不同油分含量的48 份芝麻樣本用于SSR 標記鑒定。首先，采用近紅外測定法和標準曲線對各芝麻樣本的油分含量進行測定。結果（圖1）顯示，48 個芝麻樣本的油分含量為29.81%～57.86%，平均油分含量為46.91%。48 個芝麻樣本的油分含量分布出現(xiàn)2個峰，分別在油分含量35%～40%和50%～55%區(qū)間。結合芝麻油分含量水平，把油分含量高于50%的樣本歸為高油組（編號1—24 號），低于50%的樣本歸為低油組（編號25—48號）。在48 份芝麻樣本中，高油組樣本的油分含量為52.74%～57.86%，平均油分含量54.58%；低油組樣本的油分含量為29.81%～49.16%，平均油分含量39.24%。2組之間的油分含量差異顯著。

圖1 48個芝麻樣本的油分含量水平分布Fig.1 Distribution characters of oil content in the 48 sesame samples

2.2 SSR標記位點類型分布與芝麻樣本油分含量表型相關關系分析

選用自主發(fā)掘的與芝麻油分含量和蛋白質(zhì)含量緊密連鎖的24 個SSR 標記[6]，對上述48 份芝麻樣本進行PCR 擴增。電泳后統(tǒng)計帶型并進行方差分析，結果見圖2、表1、表2。PCR帶型結果顯示，24個SSR 標記在48 個芝麻樣本中均呈現(xiàn)出多態(tài)性特征。條帶數(shù)量為2～6 個。例如，Hs393 標記PCR 擴增的產(chǎn)物存在6 個條帶，其中4 個為等位變異位點（圖2A），攜帶第1、2、3、4 個變異位點的樣本分別有7 份、34 份、1 份（油分含量為39.59%）和2 份（表1）。方差分析顯示，在4 個等位變異位點中，第2 個等位變異與第1、4 個等位變異之間均具有極顯著差異（P＜0.001）。結合樣本表型結果顯示，攜帶有Hs393（4/2）（即第2 個等位變異位點）的34 份芝麻樣本平均油分含量為50.08%，其中24 份（64.7%）樣本油分含量高于50%。攜帶有第1、4個等位位點的芝麻樣本平均油分含量分別為37.61%、39.57%；攜帶有第3個等位變異的樣本油分含量為39.59%，均屬于低油芝麻樣本。

表1 4個SSR標記在48個芝麻樣本中的等位變異位點統(tǒng)計及差異顯著性分析Tab.1 Statistics and significance analysis of allelic variation loci of four SSR markers in the 48 sesame samples

表2 4個SSR標記等位變異位點在48份樣本中的帶型分布統(tǒng)計Tab.2 Statistical analysis of zonal distribution of allelic variation loci of four SSR markers in the 48 sesame samples

圖2 4個標記在芝麻高/低油樣本中的擴增結果Fig.2 Amplification results of four SSR markers in sesame samples with high and low oil content，respectively

Hs635 標記的PCR 擴增產(chǎn)物存在2 個等位變異位點（圖2B）。攜帶有第1個和第2個等位位點的樣本分別有14份和31份（表1）。2個等位位點之間存在極顯著差異（P＜0.01）。在表型方面，攜帶Hs635（2/1）（即第1 個等位位點）的樣本平均油分含量為42.51%；攜帶Hs635（2/2）（即第2 個變異位點）的樣本平均油分含量為49.63%，其中22 份樣本（71.0%）油分含量大于50%?？梢姡琀s635（2/2）標記位點與高油分含量性狀存在顯著的連鎖關系。

對于Hs4082標記，其PCR 擴增產(chǎn)物也存在2個等位位點變異，且差異顯著（P＜0.05）（圖2C、表1）。其中，攜帶有Hs4082（2/1）和Hs4082（2/2）變異位點的樣本分別有24 份和23 份。帶有Hs4082（2/1）位點的樣本平均油分含量為49.79%，其中18 份（75.0%）樣本的油分含量高于50%；帶有Hs4082（2/2）位點的樣本，平均油分含量為43.98%，其中15份（65.2%）樣本為低油分含量類型。可見，Hs4082（2/1）標記位點與高油分含量性狀存在顯著連鎖關系。

此外，Hs4089 標記的擴增產(chǎn)物存在2 個等位變異類型，且2 個變異之間存在極顯著差異（P＜0.001）（圖2D、表1）。表型顯示，攜帶Hs4089（2/1）（即第1 個等位變異位點）的樣本有21 份，平均油分含量為42.14%；帶有Hs4089（2/2）（即第2 個等位變異位點）的樣本共有24份，平均油分含量為51.41%，其中19 份（79.2%）為高油分含量材料（＜50%）。表明Hs4089（2/2）標記位點與高油分含量性狀存在極顯著的連鎖關系。

2.3 SSR標記對芝麻油分含量性狀鑒定的穩(wěn)定性分析

為進一步分析上述SSR 標記在芝麻油分含量性狀鑒定中的穩(wěn)定性和可靠性，分析芝麻樣本油分含量表型與4個SSR 標記等位變異位點之間的相關關系和頻率。在48 份芝麻樣本中，共有12 個樣本同時攜帶有4 個SSR 標記的高油帶型；且12 個樣本（100%）的油分含量均大于50%，均屬于高油分含量芝麻樣本。12 個樣本包括漯芝系列、豐芝系列、豫芝系列等高油品種，以及漢冢萬莊、新蔡選抗、武昌遲芝麻等地方農(nóng)家種。其中，漯芝16的油分含量最高，為57.86%。在48 個樣本中，能夠同時被檢測到攜帶有3 個及以上高油帶型的樣本有24 個，油分含量為46.82%～57.86%，平均油分含量為54.03%。其中22 個（91.6%）樣本的油分含量高于50%，屬于高油分樣本；油分含量低于50%的材料僅有2個，分別為墨西哥Yori77-1（油分含量48.19%）和淮陽紅芝麻（油分含量46.82%），但其油分含量接近50%。

進一步比較發(fā)現(xiàn)，有10個樣本被檢測到同時攜帶有3 個及以上的低油帶型，油分含量為32.04%～47.77%，平均油分含量為40.60%。在這10 個樣本中，有6 個低油分樣本，分別為湖南岳陽芝麻、泥里蹲、冀9014、貴州荔波黑芝麻、鄭黑芝-3和江蘇泰州LZX04，均攜帶有4 個低油位點標記。上述結果表明，采用與油分含量緊密連鎖的4 個SSR 標記聯(lián)合進行芝麻油分含量水平的判定，結果可靠。

3 結論與討論

本研究對48 份不同油分含量的芝麻種質(zhì)開展了油分含量相關分子標記鑒定與評價研究。48 份芝麻種質(zhì)的油分含量為29.81%～57.86%。利用自主創(chuàng)制的與芝麻油分含量緊密連鎖的24個SSR 標記，檢測了48份芝麻種質(zhì)的標記位點類型。結果顯示，24個SSR標記在48份芝麻樣本中均具有多態(tài)性；其中Hs393（4/2）、Hs635（2/2）、Hs4082（2/1）和Hs4089（2/2）4個SSR標記的高油位點與其他等位位點均具有顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.001）差異，篩選出4個與高油分緊密關聯(lián)的SSR 標記位點，表明SSR標記可以用于芝麻種質(zhì)油分含量類型的評價和鑒定。在檢測的48 個樣本中，同時攜帶這4 個SSR 標記等位變異位點的12 個樣本（油分含量52.74%～57.86%）均屬于高油分樣本，顯示出SSR 標記在評價和鑒定特異芝麻種質(zhì)中的重要作用。因此，在今后高油芝麻新品種選育過程中，可以采用上述SSR標記對低世代材料進行快速篩選，以提高育種效率和準確度[14，18]。此外，本研究通過上述4個SSR標記鑒定出了漯芝系列、豐芝系列、豫芝系列等一批高油品種以及漢冢萬莊、新蔡選抗、武昌遲芝麻等高油地方農(nóng)家種，并篩選出了一批低油分含量種質(zhì)，為今后搭建芝麻分子標記輔助育種技術體系、選育高油優(yōu)質(zhì)芝麻新品種提供了豐富的材料和方法。本研究為進一步完善芝麻分子標記輔助育種、加快優(yōu)異新品種品質(zhì)選育提供了技術支持。

芝麻屬于小粒型高含油量作物。近年來，芝麻品質(zhì)相關性狀主要涉及油分含量、蛋白質(zhì)含量、脂肪酸組分以及芝麻素等次生代謝物含量等性狀[1，18]。油分含量、蛋白質(zhì)含量等性狀均屬于數(shù)量性狀，由微效多基因控制[18-19]。LI 等[6]分析顯示，369 份芝麻種質(zhì)的油分含量性狀受基因型與環(huán)境共同影響，基因型的效應更大。因此，發(fā)掘與品質(zhì)性狀相關的QTL、基因及分子標記，對提高芝麻品質(zhì)育種效率具有重要意義。

芝麻品質(zhì)相關的遺傳研究主要涉及重要分子標記發(fā)掘、QTL 圖譜定位、全基因組關聯(lián)分析及基因克隆等方面[19-22]。在分子標記發(fā)掘與應用中，SSR標記是指1～6 bp 的短序列重復序列，大量存在于植物基因組中，因其具有多樣性和重復性的特點，被廣泛用于農(nóng)作物種質(zhì)及品種的特異性分子鑒定、重要性狀關聯(lián)分析等工作[23-27]。DIXIT 等[28]首次開發(fā)了芝麻SSR 標記。在芝麻基因組中，約有110 495個SSR 存在，其中單核苷酸類（Mononucleotide）和二核苷酸類（Dinucleotide）重復分別占總量的39.1%和34.3%。根據(jù)文獻所知，目前已發(fā)掘出的與油分含量性狀緊密連鎖的SSR 標記共有29 個[6，11]。其中，LI 等[6]開展了369 份芝麻種質(zhì)5 個環(huán)境下油分含量和蛋白質(zhì)含量的關聯(lián)分析，確定了24個SSR 標記與油分和蛋白質(zhì)含量緊密連鎖。此外，WU 等[29]依據(jù)SNP 遺傳圖譜開展了油分含量、蛋白質(zhì)含量及芝麻素含量3 個品質(zhì)性狀的QTL 定位，發(fā)掘了5 個與油分含量緊密關聯(lián)的QTL 位點，對表型變異的解釋率為5.2%～18.6%。

近幾年來，芝麻基因組計劃及芝麻基因組精細圖譜的完成為芝麻品質(zhì)相關性狀遺傳研究提供了重要技術和信息支撐[19，30-34]。WEI等[17]對705份芝麻種質(zhì)進行了全基因組重測序和關聯(lián)分析，研究了包括油分含量等56 個農(nóng)藝性狀在4 個不同環(huán)境下的關聯(lián)SNP 位點分布。ZHOU 等[35]通過全基因組關聯(lián)分析定位了3 個與油分含量緊密關聯(lián)的功能基因（NAC，SiTPS1和SiKAS1），為芝麻優(yōu)質(zhì)育種提供了分子元件。今后將進一步開展芝麻油分含量等品質(zhì)性狀的遺傳解析，以構建完善的分子標記輔助育種技術體系，加快芝麻品質(zhì)育種研究進程。