侯 薔，周 鑫，張建雄，馬瑞欣，吳江愛，崔亞楠，陳 宇，鄭百芹，張麗芳

（1.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)評價與營養(yǎng)健康重點實驗室，河北 唐山 063000；2.河北省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，河北 石家莊 050000）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）俗稱南美白對蝦，原種主要分布于太平洋沿岸熱帶水域，于1988 年引入我國。由于具有環(huán)境適應(yīng)能力強、成活率高、生長速度快、出肉率高等優(yōu)點，凡納濱對蝦目前在全國沿海省市均有養(yǎng)殖，養(yǎng)殖面積以及產(chǎn)量已占水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)主導(dǎo)地位[1]。2020 年，全國凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達186萬t以上，其中河北省凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達4.1 萬t，且淡水養(yǎng)殖的對蝦產(chǎn)量連年高于海水養(yǎng)殖[2]。作為北方地區(qū)的主要產(chǎn)區(qū)之一，河北省唐山市凡納濱對蝦的養(yǎng)殖面積逐年增大，養(yǎng)殖模式也由傳統(tǒng)的海水粗放養(yǎng)殖模式，逐漸改進為精養(yǎng)、混養(yǎng)及工廠化養(yǎng)殖等高密度集約化養(yǎng)殖模式。

盡管養(yǎng)殖規(guī)模逐年擴大，但仍然存在較多因素制約著凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，如細菌或病毒感染引發(fā)的病害等[3-4]。前人研究表明，蝦類疾病與蝦腸道及周圍環(huán)境的微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[5]，腸道微生物群落的時序性變化與對蝦疾病的嚴重程度呈正相關(guān)[6]，如對蝦白糞綜合征（White feces syndrome，WFS）等；而養(yǎng)殖環(huán)境微生物紊亂則可能改變腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，進而抑制對蝦生長甚至誘發(fā)疾病[7]，如出現(xiàn)紅腸、空腸等癥狀的患病對蝦，其養(yǎng)殖塘水及腸道中變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）相對豐度均顯著低于健康對蝦。因此，研究對蝦腸道和周圍環(huán)境微生物的組成及其相互關(guān)系，對凡納濱對蝦健康養(yǎng)殖具有重要意義。目前，針對凡納濱對蝦腸道及周圍環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的研究主要集中在我國南方地區(qū)，如海南[5]、浙江[8-9]、廣東[10-11]、上海[12]等省市，研究內(nèi)容主要涉及凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中其腸道和養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落的結(jié)構(gòu)與變化，以及不同養(yǎng)殖模式或?qū)ξr不同生長狀態(tài)下的微生物群落結(jié)構(gòu)的比較等方面。然而，對于北方地區(qū)養(yǎng)殖的凡納濱對蝦則鮮有此方面的研究，更多是關(guān)注養(yǎng)殖水域微生物群落的結(jié)構(gòu)及多樣性，如羅同陽等[13]系統(tǒng)分析了白洋淀水域的細菌多樣性。綜上所述，目前，尚無關(guān)于我國北方特別是河北省唐山市凡納濱對蝦腸道及養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的研究。為此，選取唐山市2 種凡納濱對蝦養(yǎng)殖模式淡水精養(yǎng)模式（Freshwater intensive culture，F(xiàn)I）和混養(yǎng)模式（Freshwater mixed culture，F(xiàn)M），利用Illumina HiSeq 平臺，對2 種模式下不同養(yǎng)殖時期采集的對蝦腸道、養(yǎng)殖塘水體和底泥樣品中微生物的16S rRNA 基因V3-V4 可變區(qū)進行高通量測序，分析比較各組樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)及差異，探究唐山市養(yǎng)殖凡納濱對蝦微生物群落的時序性變化，為科學(xué)制定對蝦養(yǎng)殖規(guī)劃、優(yōu)化養(yǎng)殖模式、建立健康養(yǎng)殖系統(tǒng)、提高養(yǎng)殖技術(shù)水平提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

凡納濱對蝦、養(yǎng)殖塘水體及底泥樣品均采集自河北省唐山市某對蝦養(yǎng)殖場；MagPure DNA Stool LQ Kit（廣州美基生物科技有限公司產(chǎn)品）；Qubit?dsDNA BR Assay Kit（美 國Invitrogen 公 司）；2×Phanta Max Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）；Agencourt AMPure XP 磁 珠（美 國Beckman Coulter公司）；瓊脂糖（西班牙Biowest公司）。

JC-801A 活塞式柱狀采泥器（青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司）；LYNX4000 高速離心機（美國ThermoFisher 公司）；水平電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）；T100?PCR 擴增儀（美國Bio-rad 公司）；Agilent 2100 Bioanalyzer（美國Agilent 公司）；Illumina Miseq 測序儀（美國Illumina公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集地點及時間 樣品采集地點位于河北省唐山市落潮灣某凡納濱對蝦養(yǎng)殖場（北緯39°13′53″，東經(jīng)118°19′14″）。該養(yǎng)殖場同時擁有淡水精養(yǎng)（FI）和淡水混養(yǎng)（FM）模式養(yǎng)殖塘，每個養(yǎng)殖塘面積約26 000 m2，均為長方形，平均水深為1.9 m。FI模式養(yǎng)殖塘僅投放凡納濱對蝦，放養(yǎng)密度為60 尾/m2；FM 模式養(yǎng)殖塘凡納濱對蝦放養(yǎng)密度為22.5 尾/m2，同時套養(yǎng)草魚（2.4 尾/m2）、花鰱（0.4尾/m2）和白鰱（0.4 尾/ m2）。養(yǎng)殖過程中均不換水，適當(dāng)加水，每日投喂2 次。選取FI 模式和FM 模式養(yǎng)殖塘各1 個，分別于養(yǎng)殖初期（養(yǎng)殖第10 天）和養(yǎng)殖末期（養(yǎng)殖第120 天）采集凡納濱對蝦腸道、養(yǎng)殖塘水體及底泥樣品。養(yǎng)殖初期采樣時平均水溫為21.5 ℃；養(yǎng)殖末期采樣時平均水溫為25.3 ℃。

1.2.2 樣品采集方法及處理 每個時間點、每種模式養(yǎng)殖塘按照如下方式進行樣品采集及后續(xù)處理。對蝦腸道樣品：隨機捕捉24 尾凡納濱對蝦，低溫保存帶回實驗室后，先用無菌生理鹽水擦拭體表，隨后在無菌環(huán)境下挑取腸道，每8 尾蝦腸道合并作為1 個樣品置于無菌離心管中，共3 個重復(fù)樣品。水體樣品：采用5 點采樣法進行樣品采集，養(yǎng)殖塘4 個角的采樣位點均選在距離養(yǎng)殖塘岸邊1.0～1.5 m 處的位置，連同養(yǎng)殖塘中點在內(nèi)所有的采樣位點均需遠離食臺、增氧機及進/排水口[12]，分別在各個采樣位點采集水面下25～35 cm 處的養(yǎng)殖塘水250 mL 于集水瓶中，低溫保存帶回實驗室；混合后每取500 mL水為1 個樣品，采用孔徑為0.22 μm 的PVDF 膜過濾，收集濾液于無菌離心管中，共設(shè)置3 個重復(fù)樣品。底泥樣品：底泥樣品采樣位點的設(shè)置與水體樣品一致；使用柱狀采泥器分別在各個采樣位點采集養(yǎng)殖塘底泥，切取柱狀泥樣前10 cm 的底泥于無菌采樣袋，低溫保存帶回實驗室；混合后分裝置于3個無菌離心管中作為3 個重復(fù)樣品。所有樣品于-80 ℃條件下凍存。共采集36 個樣品，2 種養(yǎng)殖模式各18個，各樣品信息及編號詳見表1和表2。

表1 淡水精養(yǎng)模式各組樣品信息及高通量測序數(shù)據(jù)Tab.1 Statistical table of sample information and high-throughput sequencing data from FI pattern

表2 淡水混養(yǎng)模式各組樣品信息及高通量測序數(shù)據(jù)Tab.2 Statistical table of sample information and high-throughput sequencing data from FM pattern

1.2.3 DNA 提取與PCR 擴增 按照DNA 提取試劑盒說明書提取所有試驗樣品的總DNA，分別使用熒光定量法和1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA的濃度和完整性。取質(zhì)量合格的DNA 作為模板，使用引物338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對細菌16S rDNA V3-V4 區(qū)域進行PCR 擴增。擴增體系（50 μL）：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，引物338F和806R 各2 μL，DNA 模 板30 ng，ddH2O 補 足 至50 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.2.4 高通量測序及數(shù)據(jù)過濾 使用Agencourt AMPure XP 磁珠對PCR 擴增產(chǎn)物進行純化，完成建庫。使用Agilent 2100 Bioanalyzer 對文庫的片段范圍及濃度進行檢測。檢測合格的文庫采用HiSeq 2500 進行高通量測序（深圳華大基因股份有限公司）。原始測序數(shù)據(jù)的過濾采取按窗口去低質(zhì)量的方法，設(shè)置25 bp 的窗口，如果窗口平均質(zhì)量值低于20 bp，從窗口開始截除reads 末端序列，移除最終reads 長度低于原始reads 長度75%的序列，去除接頭污染的reads、含N 的reads和低復(fù)雜度reads，獲得Clean data。序列拼接使用FLASH 軟件[14]，利用重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對reads 組裝成1條序列，得到高變區(qū)的Tag。

1.3 數(shù)據(jù)處理

獲得的Clean tag 利用軟件USEARCH 聚類為可操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU），即利用UPARSE[15]在97 %相似度下進行聚類，得到OTU 的代表序列，同時利用UCHIME[16]去除PCR 擴增產(chǎn)生的嵌合體。隨后通過軟件RDP classifer 將OTU 代表序列與Greengene[17]數(shù)據(jù)庫比對進行物種注釋，置信度閾值設(shè)置為0.6。根據(jù)每個樣品的OTU 豐度計算獨有及共有的OTU，通過R 語言工具包制作Venn 圖及物種組成柱形圖。利用軟件Mothur[18]計算每個樣品的Alpha 多樣性指數(shù)，包括Chao 指數(shù)、Ace 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)，通過R 語言繪制Alpha 多樣性組間差異盒型圖。使用QIIME 軟件[19]，采用迭代算法在加權(quán)物種分類豐度信息的情況下，使用所有樣品中序列數(shù)最少的樣品的序列數(shù)的75%進行抽樣分析，迭代100 次之后綜合統(tǒng)計得到主坐標(biāo)分析（Principal co-ordinates analysis，PCoA）展示圖。利用軟件phytools 及R 語言，根據(jù)Weighted Unifrac 距離矩陣繪制UPGMA 聚類分析圖[20]。采用線性判別分析（LEfSe，https://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）比較不同樣品微生物群落差異，確認主要特異類群。樣本指數(shù)的顯著性差異分析采用統(tǒng)計學(xué)t檢驗的方法進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

根據(jù)試驗設(shè)計方案所采集的36個對蝦腸道、水體和底泥樣品，通過16S rRNA基因測序獲得的高通量數(shù)據(jù)如表1 和表2 所示。原始測序數(shù)據(jù)經(jīng)過濾去除低質(zhì)量序列及模糊序列，共獲得有效序列條數(shù)為60 717～69 068；再經(jīng)去除無法聚類和沒有注釋的序列后，拼接獲得Tag 個數(shù)為40 853～64 371；以97%的相似水平進行OTU聚類，所獲得樣品的OTU個數(shù)為264～4 298。所有樣品的測序覆蓋率均大于0.972 2（0.972 2～0.999 4），表明此次測序數(shù)據(jù)能夠代表樣品中絕大多數(shù)細菌類群組成的真實情況，可進行后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

同組間不同樣品共有及獨有OTU 數(shù)經(jīng)加和后，得到不同養(yǎng)殖模式下各組樣品OTU 數(shù)（圖1a），繪制Venn圖（圖1b—d），分析比較不同養(yǎng)殖模式、不同養(yǎng)殖時間對蝦腸道、水體和底泥樣品中的微生物物種組成相似性及差異情況。FI 模式所有樣品共聚類為6 077個OTU，F(xiàn)M模式所有樣品共聚類為7 961個OTU，相較于FI 模式，F(xiàn)M 模式各組樣品的物種數(shù)量更多。不同養(yǎng)殖模式的同類型樣品中，對蝦腸道包含125 個共有OTU，水體包含131 個共有OTU，底泥包含1 047 個共有OTU。總體而言，2 種養(yǎng)殖模式無論是在養(yǎng)殖初期還是末期，底泥樣品聚類得到的OTU 數(shù)均為最高，顯著高于對蝦腸道和水體樣品（P＜0.05），且隨養(yǎng)殖時間的延長而有明顯增長，表明底泥樣品中微生物數(shù)量最為豐富。

圖1 不同養(yǎng)殖模式凡納濱對蝦腸道、底泥和水體樣品OTU數(shù)統(tǒng)計（a）及Venn圖（b—d）Fig.1 The counts（a）and Venn diagrams（b—d）of OTUs in L.vannamei intestine，sediment and water samples from different culture patterns

2.2 不同養(yǎng)殖模式下凡納濱對蝦腸道及養(yǎng)殖環(huán)境微生物多樣性分析

2.2.1 Alpha 多樣性分析 基于高通量測序結(jié)果對各組樣品進行Alpha 多樣性分析，得到多樣性指數(shù)統(tǒng)計表（表3）及組間差異分析圖（圖2）。Chao 指數(shù)和Ace 指數(shù)可反映樣品中物種的數(shù)量，而不考慮每個物種的豐度情況；Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)則反映樣品的多樣性受物種豐度和均勻度的影響，即相同物種豐度的情況下，樣品中各物種具有越大的均勻度，則認為其具有越大的多樣性[21]。由表3 可知，無論是FI 模式還是FM 模式，底泥樣品的Alpha多樣性均高于水體樣品和對蝦腸道樣品；2 種養(yǎng)殖模式相比，F(xiàn)M 模式底泥樣品的多樣性更高。以各組樣品Shannon 指數(shù)繪制組間差異分析圖，如圖2所示。對不同養(yǎng)殖時期采集樣品的多樣性進行比較可知，F(xiàn)I 模式養(yǎng)殖末期對蝦腸道、底泥及水體樣品多樣性均高于養(yǎng)殖初期時相應(yīng)樣品（圖2a）；FM模式養(yǎng)殖末期底泥和水體樣品多樣性高于養(yǎng)殖初期，而對蝦腸道樣品多樣性則低于養(yǎng)殖初期（圖2b）；養(yǎng)殖末期，F(xiàn)M 模式與FI模式相比，底泥樣品及水體樣品多樣性更高，而對蝦腸道樣品多樣性較低（圖2c）。

圖2 不同養(yǎng)殖模式凡納濱對蝦腸道、底泥和水體樣品Shannon指數(shù)差異分析Fig.2 The differentiation analysis of Shannon index of L.vannamei intestine，sediment and water samples from different culture patterns

表3 不同養(yǎng)殖模式下各組樣品Alpha多樣性Tab.3 Alpha diversity statistics of samples from different culture patterns

2.2.2 Beta 多樣性分析 對不同養(yǎng)殖模式、不同養(yǎng)殖時期各組樣品中微生物群落進行PCoA 分析，結(jié)果如圖3 所示，第一主坐標(biāo)軸對樣本差異的貢獻度為26.37%，第二主坐標(biāo)軸對樣本差異的貢獻度為20.34%。不同類型的樣品微生物群落分區(qū)明顯，其中底泥與對蝦腸道微生物分區(qū)距離較近，表明底泥與對蝦腸道的微生物組成結(jié)構(gòu)相似度較高，群落差異較??；而水體和底泥、對蝦腸道微生物組成均有差異。FI 模式下，不同養(yǎng)殖時期的底泥和水體樣品分別聚類，群落相似性較高，而對蝦腸道樣品養(yǎng)殖末期與養(yǎng)殖初期分別聚類，微生物組成差異較大；FM 模式下，不同養(yǎng)殖時間的同類型樣品聚集在一起，表明其微生物群落相似度較高，組成差異較小。

圖3 不同養(yǎng)殖模式凡納濱對蝦腸道、底泥和水體樣品PCoA聚類分析Fig.3 The PCoA cluster analysis of L.vannamei intestine，sediment and water samples from different culture patterns

2.3 不同養(yǎng)殖模式下凡納濱對蝦腸道及養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 基于門水平的微生物群落結(jié)構(gòu) 在門水平上，2 種養(yǎng)殖模式、不同養(yǎng)殖時期的對蝦腸道、底泥和水體樣品的OTU 共注釋到69 個門，匯總分析各組樣品中相對豐度大于1%的物種，結(jié)果如圖4 所示。FI 模式養(yǎng)殖初期，對蝦腸道可注釋到34 個門，其中藍細菌門（Cyanobacteria，83.45%）、變形菌門（11.43%）和擬桿菌門（Bacteroidetes，3.01%）3 個門的相對豐度大于1%；水體樣品可注釋到39個門，其中放線菌門（61.07%）、變形菌門（21.65%）、擬桿菌門（8.39%）等5 個門的相對豐度大于1%；底泥樣品可注釋到56 個門，其中9 個門的相對豐度大于1%，包括變形菌門（41.61%）、擬桿菌門（13.08%）、放線菌門（11.95%）等。養(yǎng)殖末期，對蝦腸道樣品可注釋到39 個門，其中8 個門的相對豐度大于1%，包括變形菌門（56.58%）、藍細菌門（12.58%）、柔壁菌門（Tenericutes，8.42%）等；水體樣品可注釋到27 個門，包括放線菌門（45.95%）、擬桿菌門（18.93%）、變形菌門（15.46%）等在內(nèi)的8 個門的相對豐度大于1%；底泥樣品可注釋到59 個門，其中變形菌門（38.84%）、放線菌門（16.38%）、擬桿菌門（15.07%）等8 個門的相對豐度大于1%。FM 模式養(yǎng)殖初期，對蝦腸道樣品可注釋到36 個門，其中7 個門的相對豐度大于1%，包括變形菌門（57.88%）、藍細菌門（16.46%）、擬桿菌門（12.6%）等；水體樣品可注釋到35 個門，其中8 個門的相對豐度大于1%，包括放線菌門（72.62%）、變形菌門（9.46%）、藍細菌門（7.32%）等；底泥樣品共注釋到56個門，其中變形菌門（35.04%）、擬桿菌門（16.43%）、放線菌門（9.27%）等12 個門的相對豐度大于1%。養(yǎng)殖末期，對蝦腸道樣品共注釋到33個門，其中柔壁菌門（60.7%）、變形菌門（20.11%）、藍細菌門（7.28%）等7 個門的相對豐度大于1%；水體樣品共注釋到45 個門，其中9個門的相對豐度大于1%，包括放線菌門（23.87%）、藍 細 菌 門（19.98%）、浮 霉 菌 門（Planctomycetes，15.92%）等；底泥樣品共注釋到65個門，包括變形菌門（35.01%）、擬 桿 菌 門（13.7%）、綠 彎 菌 門（Chloroflexi，10.33%）等在內(nèi)的14 個門的相對豐度大于1%。總體來看，F(xiàn)M 模式下整體微生物群落中的細菌數(shù)量及相對豐度均更高。FI 和FM 2 種養(yǎng)殖模式不同養(yǎng)殖時期對蝦腸道、水體和底泥樣品中，優(yōu)勢門類均為變形菌門、擬桿菌門及放線菌門；相較于對蝦腸道和水體樣品，底泥樣品中微生物門類的數(shù)量和豐富度均為最高。與養(yǎng)殖初期相比，養(yǎng)殖末期時各類型樣品中微生物物種組成基本一致，但是物種群落相對豐度更高，F(xiàn)I 模式養(yǎng)殖末期疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）、綠菌門（Chlorobi）、浮霉菌門、梭桿菌門（Fusobacteria）、衣原體門（Chlamydiae）、WS6 等物種豐度均有顯著提高（P＜0.05）；FM 模式養(yǎng)殖末期疣微菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、柔壁菌門、梭桿菌門、螺旋體門（Spirochaetes）等門類相對豐度均有顯著提高。

圖4 不同養(yǎng)殖模式凡納濱對蝦腸道、底泥和水體樣品基于門水平的微生物物種組成及相對豐度統(tǒng)計（＞1%）Fig.4 Composition and relative abundance of microbiota of L.vannamei intestine，sediment and water samples from different culture patterns at phylum level（＞1%）

2.3.2 基于屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu) 在屬水平上，2 種養(yǎng)殖模式、不同養(yǎng)殖時期的對蝦腸道、底泥和水體樣品的OTU 共注釋到1 028 個屬，其中35 個屬的相對豐度大于1%，各組樣品物種相對豐度匯總結(jié)果如圖5所示。不同養(yǎng)殖模式下不同樣品組的優(yōu)勢菌屬組成及豐度明顯不同。FI 模式養(yǎng)殖初期，對蝦腸道樣品主要優(yōu)勢菌屬為紅桿菌屬（Rhodobacter，2.61%）和黃桿菌屬（Flavobacterium，1.33%）；水體樣品主要優(yōu)勢菌屬為Polynucleobacter（7.89%）、Limnohabitans（5.32%）、嗜 氫 菌 屬（Hydrogenophaga，2.92%）等；底泥樣品主要優(yōu)勢菌屬為Gillisia（5.55%）、溶桿菌屬（Lysobacter，5.38%）、硫桿菌屬（Thiobacillus，3.05%）等。養(yǎng)殖末期時對蝦腸道和底泥樣品中屬水平物種組成及豐度均有一定提升，對蝦腸道主要優(yōu)勢菌屬為弧菌屬（Vibrio，16.52%）、希瓦氏菌屬（Shewanella，8.13%）和鯨桿菌屬（Cetobacterium，5.39%）等。底泥樣品主要優(yōu)勢菌屬 為Gillisia（5.62%）、海 桿 菌 屬（Marinobacter，4.93%）、嗜鹽單胞菌屬（Halomonas，4.11%）等；水體樣品主要優(yōu)勢菌屬為Candidatus_Aquiluna（8.35%）、黃桿菌屬（3.51%）、Candidatus_Xiphinematobacter（1.66%）等。FM 模式養(yǎng)殖初期，對蝦腸道樣品主要優(yōu)勢菌屬為長命菌屬（Rubrivivax，13.48%）、嗜氫菌屬（8.66%）、黃桿菌屬（8.2%）等；水體樣品主要優(yōu)勢菌 屬 為 聚 球 菌 屬（Synechococcus，4.43%）和Candidatus_Xiphinematobacter（1.9%）；底泥樣品主要優(yōu)勢菌屬為單胞菌屬（Polaromonas，4.63%）、紅育菌屬（Rhodoferax，2.53%）、Lutibacter（2.5%）等。養(yǎng)殖末期，對蝦腸道、水體及底泥樣品共有的優(yōu)勢菌屬為聚球藻屬（Synechococcus），相對豐度分別為4.75%、11.56%和3.36%。此外，對蝦腸道樣品主要優(yōu)勢菌屬還包括弧菌屬（5.93%）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium，3.25%）和希瓦氏菌屬（1.71%）；水體樣品主要優(yōu)勢菌屬還包括長命菌屬（1.72%）和Candidatus_Xiphinematobacter（1.68%）；底泥樣品主要優(yōu)勢菌屬還包括硫桿菌屬（3.3%）、Lutibacter（1.37%）和脫硫球菌屬（Desulfococcus，1.34%）。

圖5 不同養(yǎng)殖模式凡納濱對蝦腸道、底泥和水體樣品基于屬水平的微生物物種組成及相對豐度統(tǒng)計（＞1%）Fig.5 Composition and relative abundance of microbiota of L.vannamei intestine，sediment and water samples from different culture patterns at genus level（＞1%）

2.4 不同養(yǎng)殖模式下凡納濱對蝦腸道及養(yǎng)殖環(huán)境微生物物種組成聚類分析

對2種養(yǎng)殖模式不同養(yǎng)殖時期的各組樣品微生物群落的相似性進行聚類分析，繪制成UPGMA 圖（圖6），結(jié)果顯示，微生物物種分別在不同類型樣品（底泥、對蝦腸道、水體）上進行聚類，而非以不同養(yǎng)殖模式或不同養(yǎng)殖時期進行聚類，表明不同類型的樣品間物種組成差異更為顯著。

圖6 不同養(yǎng)殖模式凡納濱對蝦腸道、底泥和水體樣品UPGMA聚類分析Fig.6 UPGMA cluster diagram of L.vannamei intestine，sediment and water samples from different culture patterns

從圖6 聚類分析上可以看出，不同類型樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)有所不同，底泥與對蝦腸道樣品微生物群落結(jié)構(gòu)較為相近，聚為一組；水體樣品微生物群落結(jié)構(gòu)則單獨聚類為一組。熱圖分析橫向聚類結(jié)果（圖7）同樣表明，底泥與對蝦腸道樣品微生物種類及組成較為相似，其相對豐度最高的物種均為變形菌門，其次為擬桿菌門；而水體樣品微生物種類與其他2 組樣品差異較大，其豐度最高的物種為放線菌門，其次為變形菌門。

圖7 不同養(yǎng)殖模式凡納濱對蝦腸道、底泥和水體樣品門水平上微生物物種分類熱圖Fig.7 Taxa heatmap of microbiota of L.vannamei intestine，sediment and water samples from different culture patterns at phylum level

2.5 不同養(yǎng)殖模式下凡納濱對蝦腸道及養(yǎng)殖環(huán)境微生物指示物種線性判別分析

對各組樣品間微生物群落差異進行線性判別分析，篩選組間主要的特異類群，確認對不同養(yǎng)殖模式、不同養(yǎng)殖時期微生物群落產(chǎn)生顯著性影響的指示物種，結(jié)果如圖8所示。養(yǎng)殖初期，F(xiàn)I模式下的指示物種在目水平上包括屬于變形菌門的紅桿菌目（Rhodobacterales）、根瘤菌目（Rhizobiales）和彎曲菌目（Campylobacterales），在科水平上包括屬于變形菌門的伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、嗜甲基菌科（Methylophilaceae）和螺桿菌科（Helicobacteraceae），放線菌門的微桿菌科（Microbacteriaceae）以及擬桿菌門的噬纖維菌科（Cytophagaceae）；FM模式下的指示物種在目水平上包括屬于變形菌門的假單胞菌目（Pseudomonadales）、擬桿菌門的噬纖維菌目（Cytophagales）以及放線菌門的酸微菌目（Acidimicrobiales），在科水平上包括屬于變形菌門的鞘脂桿菌科（Sphingobacteriaceae）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）和著色菌科（Chromatiaceae），擬桿菌門的黃桿菌科（Flavobacteriaceae），放線菌門的分支桿菌科（Mycobacteriaceae）以及厚壁菌門的毛螺菌科（Lachnospiraceae）。養(yǎng)殖末期時2 種養(yǎng)殖模式的特異類群在門水平上均有增加，相應(yīng)的指示物種也發(fā)生了變化，如FI模式下的指示物種在門水平上增加了厚壁菌門和衣原體門，在綱水平上增加了屬于厚壁菌門的芽孢桿菌綱（Bacilli），在目水平上變 為 屬 于 變 形 菌 門 的 海 洋 螺 菌 目（Oceanospirillales）、放線菌門的土壤紅桿菌目以及衣原體門的衣原體目（Chlamydiales），在科水平上變?yōu)閷儆谧冃尉T的希瓦氏菌科（Shewanellaceae）、軍團 菌 科（Legionellaceae） 、甲 基 球 菌 科（Methylococcaceae）、脫硫桿菌科（Desulfobacteraceae）、交替單胞菌科（Alteromonadaceae）、鹽硫桿狀菌科（Halothiobacillaceae），放線菌門的間孢囊菌科（Intrasporangiaceae），擬桿菌門的噬幾丁質(zhì)菌科（Chitinophagaceae）以及厚壁菌門的梭菌科（Clostridiaceae_3）；相較于FI 模式，F(xiàn)M 模式下的指示物種變化更為顯著，在門水平上增加了芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門、螺旋體門、酸桿菌門（Acidobacteria）以及柔壁菌門，在綱水平上增加了屬于變形菌門的 δ - 變形菌綱（Deltaproteobacteria）、浮霉菌門的Phycisphaerae、酸桿菌門的全噬菌綱（Holophagae）以及柔壁菌門的柔膜菌綱（Mollicutes），在目水平上變?yōu)閷儆谘繂伟T的芽單胞菌目（Gemmatimonadales）和螺旋體門的螺旋體目（Spirochaetales），在科水平上變?yōu)閷儆谧冃尉T的弧菌科（Vibrionaceae）和產(chǎn)堿菌科（Alcaligenaceae），厚壁菌門的單胞菌科（Syntrophomonadaceae）和 氨 基 酸 球 菌 科（Acidaminococcaceae）。

圖8 不同養(yǎng)殖模式凡納濱對蝦腸道、底泥和水體樣品微生物群落線性判別分析Fig.8 Linear discriminant analysis of microbiota of L.vannamei intestine，sediment and water samples from different culture patterns

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)的微生物群落結(jié)構(gòu)分析多采用變性梯度凝 膠 電 泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）或末端限制性片段長度多態(tài)性（Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）等[22-23]分子生物學(xué)技術(shù)，但這2 種技術(shù)分析通量較低，無法全面揭示復(fù)雜樣品中的微生物組成及多樣性。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和數(shù)據(jù)分析方法的不斷優(yōu)化，高通量測序技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中獲得了廣泛應(yīng)用[24]。本研究即采用Illumina HiSeq 高通量測序方法，對河北省唐山市淡水養(yǎng)殖FI 和FM 2 種模式下，凡納濱對蝦腸道及養(yǎng)殖環(huán)境樣品微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)進行分析，研究顯示，2種養(yǎng)殖模式無論是在養(yǎng)殖初期還是末期，底泥樣品聚類得到的OTU 數(shù)最多，Alpha 多樣性最高，明顯高于對蝦腸道和水體樣品，且隨養(yǎng)殖時間的延長而有明顯增加，表明底泥樣品中微生物群落最為豐富。這與金若晨等[12]對上海市凡納濱對蝦養(yǎng)殖的研究結(jié)論一致。此外，隨著養(yǎng)殖時間的延長，F(xiàn)M 模式較FI 模式菌群相對豐度的變化更加顯著，由于FI 模式只飼養(yǎng)凡納濱對蝦，養(yǎng)殖環(huán)境相對單一，而FM 模式是魚蝦混養(yǎng)，養(yǎng)殖環(huán)境受到影響的因素增多，因此微生物群落結(jié)構(gòu)相對更加復(fù)雜。

水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，了解腸道及養(yǎng)殖環(huán)境的優(yōu)勢菌群，對養(yǎng)殖模式的選擇和預(yù)防疾病暴發(fā)至關(guān)重要。在門水平上，作為淡水養(yǎng)殖系統(tǒng)中分布最廣泛的兩大細菌門類[25]，變形菌門細菌廣泛存在于土壤及動植物體內(nèi)，其豐度的提高可作為人體腸道微生物組成失衡的標(biāo)志[26]，但其在對蝦腸道菌群中的作用尚未得到深入研究[10]；擬桿菌門細菌則是一個系統(tǒng)發(fā)育高度多樣化的類群，主要在富營養(yǎng)化程度較低的湖泊中占優(yōu)勢，可將復(fù)雜分子（如多糖）加工轉(zhuǎn)化成為簡單化合物[27]。HE等[5]對海南省凡納濱對蝦腸道和養(yǎng)殖水體的微生物組成和功能進行研究，結(jié)果顯示，所有樣品中的優(yōu)勢門類均為變形菌門（38.70%～61.90%）和擬桿菌門（5.37%～25.11%）；趙月季等[9]對浙江省不同養(yǎng)殖模式下凡納濱對蝦腸道核心微生物類群組成研究結(jié)果顯示，變形菌門（61.1%）占據(jù)優(yōu)勢地位；ZHANG 等[28]通過16S rRNA測序和宏基因組測序2 種方法，研究了廣東省凡納濱對蝦傳統(tǒng)養(yǎng)殖模式下養(yǎng)殖環(huán)境的微生物群落，結(jié)果表明，變形菌門是所有樣品中最豐富的門類；PEI等[29]研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦腸道微生物的優(yōu)勢菌門為變形菌門、擬桿菌門和柔壁菌門，其中變形菌門是絕對優(yōu)勢門類（32.248%～32.40%），顯著高于其他門類細菌；羅同陽等[13]對河北白洋淀水域細菌多樣性的研究結(jié)果顯示，變形菌門、擬桿菌門和放線菌門是湖水的優(yōu)勢菌門，且以變形菌門為絕對優(yōu)勢菌門（44.15%～60.18%）。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致，變形菌門是所有樣品中相對豐度均較高的物種（9.46%～57.88%），其次為擬桿菌門（3.01%～18.93%）。此外，放線菌門在水體樣品中豐度最高，綠彎菌門、厚壁菌門和酸桿菌門等在底泥樣品中的豐度最高。放線菌門細菌是一類具有重大實用價值的微生物，能夠代謝產(chǎn)生具有生物活性的產(chǎn)物，可用于分離篩選具有益生功能的菌株，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的預(yù)防與控制[30]。綠彎菌門細菌多定殖于海洋、潮間帶及淡水的表層沉積物中，其可在無氧環(huán)境下進行光合作用[10]。綠彎菌門、酸桿菌門等門類細菌均具有氧化還原環(huán)境中過剩的有機物碳、氨氮和亞硝酸鹽的能力，對于維持環(huán)境穩(wěn)定起到重要的作用[31]。在屬水平上，有研究表明，作為一種條件致病菌，弧菌屬細菌是對蝦養(yǎng)殖業(yè)中常見的病原微生物之一，其豐度的提高可能會影響對蝦的健康狀況甚至引起疾病[8]。因此，有必要監(jiān)測養(yǎng)殖過程中弧菌屬細菌的豐度變化，以降低對蝦疾病暴發(fā)的風(fēng)險[5]。本研究中，凡納濱對蝦養(yǎng)殖末期時，2種養(yǎng)殖模式下的對蝦腸道中弧菌屬相對豐度較養(yǎng)殖初期均有顯著提高，由此推測養(yǎng)殖末期時的對蝦具有更高的患病風(fēng)險，在實際生產(chǎn)過程中應(yīng)開展重點監(jiān)測。

腸道及環(huán)境微生物在維持凡納濱對蝦的生長和健康方面有重要的作用[32-33]，特別是腸道微生物，能夠促進腸道消化吸收平衡、參與宿主免疫和代謝、維持宿主健康[34-37]。此外有研究表明，疾病會影響凡納濱對蝦腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)，健康對蝦比患病對蝦具有更高的細菌Alpha 多樣性[7，38]。本研究中，F(xiàn)I 模式養(yǎng)殖末期凡納濱對蝦腸道及養(yǎng)殖環(huán)境樣品微生物多樣性均高于養(yǎng)殖初期時相應(yīng)樣品，而FM 模式對蝦腸道樣品微生物Alpha 多樣性則隨著養(yǎng)殖時間的變化呈現(xiàn)降低的趨勢，且低于同時期FI模式的對蝦腸道樣品，結(jié)合養(yǎng)殖末期時FM 模式對蝦腸道的指示物種包括弧菌科類群，提示本研究中FM 模式養(yǎng)殖末期時的凡納濱對蝦存在較高的患病風(fēng)險。本研究每種養(yǎng)殖模式只選取了1 個養(yǎng)殖塘，結(jié)果存在一定的局限性。此外，因?qū)ξr腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能還與環(huán)境因素息息相關(guān)[28]，本研究中關(guān)于此方面尚有待于進一步研究。在實際生產(chǎn)中，有必要在對蝦養(yǎng)殖期間隨時關(guān)注環(huán)境因素的變化，特別是在FM 模式養(yǎng)殖的末期，以便及時調(diào)節(jié)養(yǎng)殖環(huán)境，避免因疾病暴發(fā)造成損失。

綜上，本研究分析比較了河北省唐山市2 種淡水養(yǎng)殖模式的凡納濱對蝦腸道及養(yǎng)殖環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)，隨著養(yǎng)殖時間的變化，對蝦腸道、水體及底泥樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)基本不變，優(yōu)勢物種均為變形菌門細菌，但是物種群落豐富度及多樣性均有一定提高；2 種模式相比，F(xiàn)M 模式各個類型樣品微生物群落物種數(shù)量更高，且養(yǎng)殖末期時物種相對豐度的變化更加顯著；無論是FI還是FM 模式，底泥樣品微生物群落的數(shù)量、豐度及多樣性均為最高。通過本次研究，初步了解了唐山市淡水養(yǎng)殖對蝦的微生態(tài)調(diào)控形式，為制定維持對蝦健康的全菌群管理策略提供了基礎(chǔ)信息，為促進凡納濱對蝦健康養(yǎng)殖及高品質(zhì)對蝦的生產(chǎn)提供了參考數(shù)據(jù)。