楊金初，童治軍，李 萌，趙 旭，徐永明，馮穎杰，楊宗燦，曲 鵬，李 悅，孫九喆，張 軻

（1.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，河南 鄭州 450000；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院/煙草行業(yè)煙草生物技術(shù)育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家煙草基因工程研究中心，云南 昆明 650021；3.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；4.云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站，云南 昆明 650106）

煙草品種直接影響卷煙產(chǎn)品的感官質(zhì)量穩(wěn)定性，準(zhǔn)確、高效地鑒定煙草品種是煙草行業(yè)一直關(guān)注的問(wèn)題。盡管我國(guó)審定通過(guò)的烤煙品種較多，但主栽品種單一化現(xiàn)象比較嚴(yán)重。2014 年，我國(guó)栽培面積占比超過(guò)5%的品種僅有4個(gè)，云煙87、K326和紅花大金元3 個(gè)品種的栽培面積占總栽培面積的64%[1]。田間可通過(guò)株型、葉片形狀等形態(tài)學(xué)指標(biāo)區(qū)分主栽煙草品種，但煙葉經(jīng)復(fù)烤后成為形態(tài)、大小均一片煙，無(wú)法根據(jù)形態(tài)鑒別其品種。目前，卷煙企業(yè)主要依賴(lài)感官評(píng)吸區(qū)分復(fù)烤煙葉品種，其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性均不理想，亟待開(kāi)發(fā)高效、準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化的品種鑒別技術(shù)。

DNA 分子標(biāo)記直接反映作物品種間的遺傳差異，且不受樣品狀態(tài)的影響，是理想的煙草品種鑒別方法。目前，煙草領(lǐng)域已報(bào)道的分子標(biāo)記包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）[2]、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）[3]、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）[4]、簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間（ISSR）[5]、序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）[6]、MITE位點(diǎn)間多態(tài)性（IMP）[7]及單核苷酸多態(tài)性（SNP）[8-13]等。與其他分子標(biāo)記相比，第3 代分子標(biāo)記SNP 具有分布廣、密度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、多態(tài)性好及分型簡(jiǎn)單等諸多優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)，隨著測(cè)序成本大幅減低，基于全基因組的SNP 標(biāo)記開(kāi)發(fā)及應(yīng)用已成為分子標(biāo)記研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)[14]。張劍鋒等[8]利用高密度SNP芯片對(duì)不同煙草品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，可將24 個(gè)品種劃分為不同類(lèi)群；余世洲等[13]基于全基因組重測(cè)序SNP位點(diǎn)數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了48個(gè)核心SNP標(biāo)記，可用于區(qū)分主栽煙草品種的基因型。然而，以上研究中材料多為新鮮煙葉，僅個(gè)別研究應(yīng)用SSR[6，15]、SRAP[6]等第2代分子標(biāo)記對(duì)少量品種的烤后煙葉進(jìn)行了區(qū)分，尚未見(jiàn)應(yīng)用SNP 標(biāo)記鑒別烤后煙葉品種的研究報(bào)道。為探究SNP 標(biāo)記在復(fù)烤煙葉品種鑒別上的可行性，以卷煙企業(yè)常用的4 個(gè)主栽煙草品種云煙87、K326、紅花大金元及NC102 的復(fù)烤煙葉為研究對(duì)象，通過(guò)全基因組測(cè)序質(zhì)控過(guò)濾篩選SNP位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)等位基因特異性引物，利用等位基因特異性PCR 篩選品種多態(tài)性位點(diǎn)，應(yīng)用多態(tài)性SNP 位點(diǎn)構(gòu)建不同煙草品種復(fù)烤煙葉的SNP指紋圖譜和分子ID，以期實(shí)現(xiàn)復(fù)烤煙葉品種的準(zhǔn)確鑒別。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 復(fù)烤煙葉 云煙87、K326、紅花大金元及NC102 四個(gè)品種的復(fù)烤煙葉由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供，均為中部葉，產(chǎn)地均為云南。

1.1.2 儀器 JXSF TPRP-2 組織研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；NanoDrop 2000 超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Scientific 公司）；Vetiti 型梯度PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）；Mini Bis Pro 型凝膠成像分析系統(tǒng)（以色列DNR凝膠成像系統(tǒng)公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 全基因組測(cè)序及SNP 位點(diǎn)挖掘 挑選代表性復(fù)烤煙葉，用液氮研磨成粉置于1.5 mL 離心管中，依照Rapid Plant Genomic DNA Isolation Kit 試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]操作步驟提取基因組DNA，得到的DNA用TE Buffer稀釋?zhuān)?20 ℃保存。通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 完整性，利用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA 濃度和純度?；蚪M測(cè)序及SNP 位點(diǎn)挖掘均委托生工生物工程（上海）股份有限公司開(kāi)展，具體流程如下：將基因組DNA 構(gòu)建文庫(kù)，利用Illumina HiseqTM高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行全基因組重測(cè)序，以Fastqc 和Trimmomatic 軟件進(jìn)行質(zhì)控和數(shù)據(jù)處理。采用BWA（Burrows-Wheeler Aligner）程序?qū)y(cè)序獲得的高質(zhì)量序列與從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)得到的普通煙參考基因組（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/? term=common+tobacco%5Borgn%5D）進(jìn)行比對(duì)。將基因組質(zhì)控后的高質(zhì)量序列匹配到參考基因組，利用SAMTOOL 軟件轉(zhuǎn)換格式，采用GATK 軟件過(guò)濾（設(shè)定條件：mindDP=5，mac=3，maf=0.5）獲得SNP 位點(diǎn)，利用ANNOVAR軟件對(duì)過(guò)濾得到的SNP進(jìn)行注釋。

1.2.2 等位基因特異性PCR 引物設(shè)計(jì) 基于過(guò)濾得到的高質(zhì)量SNP 位點(diǎn)，截取突變位點(diǎn)前后上游或下游100 bp 左右無(wú)SNP 位點(diǎn)突變的序列，利用引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，每個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)3 條引物，即1 條通用引物Primer-R 和2 條特異性引物Primer-FA、Primer-FB。Primer-FA 和Primer-FB 的3′末端堿基分別與SNP 位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)或者相同。挑選其中53 個(gè)SNP 位點(diǎn)設(shè)計(jì)、合成了不同錯(cuò)配類(lèi)型的引物570 條，多態(tài)性位點(diǎn)35、45 和51 引物信息如表1所示。

SNP 引物設(shè)計(jì)原則：引物長(zhǎng)度12～30 bp；引物GC 含量45%～60%；退火溫度55～70oC；在特異引物3′端第2 位或第3 位人工引入強(qiáng)錯(cuò)配或中等錯(cuò)配堿基，其中強(qiáng)錯(cuò)配類(lèi)型有A/G 和C/T 2 種，中等錯(cuò)配類(lèi)型有A/A、T/T、G/G和C/C 4種；對(duì)于強(qiáng)錯(cuò)配或中等錯(cuò)配都篩選不出差異的位點(diǎn)，再考慮無(wú)錯(cuò)配和弱錯(cuò)配方式，弱錯(cuò)配方式有A/C 和G/T 2 種。2 條特異性引物FA與FB除3′端突變堿基與人工錯(cuò)配堿基不同之外，其他堿基均相同，以此分別設(shè)計(jì)不同錯(cuò)配類(lèi)型的特異性引物。

1.2.3 等位基因特異性PCR 反應(yīng)擴(kuò)增體系 等位基因特異性PCR（Allele specific PCR，AS-PCR）反應(yīng)體系10 μL：2×TaqMaster Mix Ⅱ5 μL，DNA 模板0.5 μL，10 μmol/L Primer-R 與Primer-FA 或FB 各0.25 μL，ddH2O 4 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，各退火溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。

1.2.4 SNP 位點(diǎn)驗(yàn)證與基因分型 利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，自動(dòng)凝膠成像儀觀察結(jié)果并且拍照。根據(jù)PCR 產(chǎn)物大小是否與預(yù)期一致驗(yàn)證SNP 位點(diǎn)，依據(jù)目標(biāo)條帶的有、無(wú)對(duì)4個(gè)品種進(jìn)行基因分型。

1.2.5 品種鑒別 從SNP 位點(diǎn)中篩選出多態(tài)性位點(diǎn)，構(gòu)建不同品種的指紋圖譜庫(kù)。將不同類(lèi)型等位基因型轉(zhuǎn)化為0/1 矩陣，通過(guò)構(gòu)建不同煙草品種的分子ID進(jìn)行品種鑒別。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)品種復(fù)烤煙葉樣品全基因組重測(cè)序

采用高通量Illumina HiSeqTM測(cè)序技術(shù)對(duì)4 個(gè)品種的復(fù)烤煙葉樣品進(jìn)行全基因組重測(cè)序，共獲得24.3 Gb 的原始數(shù)據(jù)（Raw data）。經(jīng)過(guò)質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)過(guò)濾，得到21.5 Gb 高質(zhì)量的純凈數(shù)據(jù)（Clean data）作為分析基礎(chǔ)，平均每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)量為5.4 Gb。每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)信息如表2所示，堿基錯(cuò)誤率低于1%（Q20）的堿基平均占比97.67%，堿基錯(cuò)誤率低于0.1%（Q30）的堿基平均占比90.21%，GC分布正常。4個(gè)樣品平均獲得高質(zhì)量序列數(shù)47 670 156條，平均47 517 800條序列可以比對(duì)到煙草參考基因組上，平均比對(duì)率為99.68%，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

表2 4個(gè)品種復(fù)烤煙葉樣品全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Tab.2 Quality statistics of whole genome resequencing data of redried tobacco leaves from four varieties

2.2 SNP位點(diǎn)的分類(lèi)、注釋與比對(duì)

應(yīng)用GATK 軟件共得到27 137 個(gè)SNP 位點(diǎn)，其中20 757 個(gè)為轉(zhuǎn)換，6 380 個(gè)為顛換，轉(zhuǎn)換與顛換的比率為3.25。變異類(lèi)型以C/T 和G/A 較多，分別占比38.24% 和38.25%，C/A 和G/T 變 異 分 別 占 比11.89%和11.62%。參照參考基因組基因功能對(duì)SNP 位點(diǎn)功能進(jìn)行注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)SNP 在基因間區(qū)的比例最大（92.28%），其次為外顯子區(qū)（3.17%）、內(nèi)含子區(qū)（2.79%）和其他區(qū)域（1.77%）。

品種間SNP 位點(diǎn)相似度統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1 所示，4個(gè)品種相同的SNP 突變點(diǎn)為23 275 個(gè)，占比85.8%；K326、云煙87 和紅花大金元相同的SNP 突變位點(diǎn)為641個(gè)，占比2.4%；K326、云煙87和NC102相同的SNP 突變位點(diǎn)為790 個(gè)，占比2.9%；云煙87、紅花大金元和NC102 相同的SNP 突變位點(diǎn)為625個(gè)，占比2.3%；紅花大金元、云煙87 和NC102 相同的SNP突變位點(diǎn)為1 806個(gè)，占比6.7%。

圖1 4個(gè)品種復(fù)烤煙葉SNP位點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Venn diagram of SNP sites of redried tobacco leaves from four varieties

2.3 SNP位點(diǎn)驗(yàn)證和基因分型

從云煙87、K326、紅花大金元及NC102 復(fù)烤煙葉提取的基因組DNA 質(zhì)量濃度分別為2 633.0、727.2、1 365.9、617.9 ng/μL，OD260/OD280值 分 別 為1.81、1.81、1.81、1.90，質(zhì)量達(dá)到等位基因PCR 擴(kuò)增要求。紅花大金元、云煙87、K326 及NC102 復(fù)烤煙葉在53 個(gè)SNP 位點(diǎn)上的基因分型分別如圖2—5 所示。PCR 產(chǎn)物電泳條帶均與引物設(shè)計(jì)預(yù)期一致，表明通過(guò)高通量測(cè)序和GATK軟件挖掘出的SNP位點(diǎn)可靠性較好，篩選出的SNP 位點(diǎn)質(zhì)量較高。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，53 個(gè)SNP 位點(diǎn)中雜合突變C/T 較多，僅在35、45、51位點(diǎn)出現(xiàn)純合突變。

圖2 紅花大金元復(fù)烤煙葉53個(gè)SNP位點(diǎn)基因分型結(jié)果Fig.2 Geno typing of 53 SNP loci of Honghuadajinyuan redried tobacco leaves

圖3 云煙87復(fù)烤煙葉53個(gè)SNP位點(diǎn)基因分型結(jié)果Fig.3 Geno typing of 53 SNP loci of Yunyan 87 redried tobacco leaves

圖4 K326復(fù)烤煙葉53個(gè)SNP位點(diǎn)基因分型結(jié)果Fig.4 Geno typing of 53 SNP loci of K326 redried tobacco leaves

2.4 SNP標(biāo)記鑒別復(fù)烤煙葉品種

在53個(gè)SNP位點(diǎn)中，35、45、51位點(diǎn)在品種間具有多態(tài)性（圖2—5），可通過(guò)基因分型區(qū)分4 個(gè)煙草品種。云煙87 在35 位點(diǎn)FA 與FB 引物均無(wú)條帶，在45、51 位點(diǎn)的基因型為C/T、C/T；紅花大金元在35、45、51 位點(diǎn)的基因型為T(mén)/T、C/C、T/T，K326 為C/T、C/T、C/C，NC102為C/T、C/T、C/T。將T記為0，C記為1，無(wú)條帶記為-，可將不同類(lèi)型等位基因型轉(zhuǎn)化為0/1 矩陣，從而構(gòu)建不同煙草品種的分子ID。在35、45、51 位點(diǎn)，紅花大金元的分子ID 為001100、K326 為101011、NC102 為101010、云 煙87 為--1010，可有效鑒別4個(gè)品種的復(fù)烤煙葉。

3 結(jié)論與討論

本研究以我國(guó)4個(gè)主栽烤煙品種的復(fù)烤煙葉為供試材料，利用全基因組重測(cè)序技術(shù)獲得21.5 Gb數(shù)據(jù)，共檢測(cè)出27 137 個(gè)SNP 位點(diǎn)。本研究篩選出的SNP位點(diǎn)較以往報(bào)道偏少[9-10]，推測(cè)可能與本研究所用復(fù)烤煙葉基因組DNA 嚴(yán)重降解有關(guān)[16]。為驗(yàn)證篩選出SNP位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，挑選53個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)了PCR 引物對(duì)復(fù)烤煙葉進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)所有位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物大小均與預(yù)期結(jié)果一致，表明測(cè)序質(zhì)量較高，發(fā)掘出的位點(diǎn)可靠性較好。

應(yīng)用多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的SNP 位點(diǎn)構(gòu)建指紋圖譜和分子ID 是可操作性較好的植物品種鑒別方法[17-23]。目前，SNP 相關(guān)研究所用材料均為新鮮植物樣本，尚無(wú)應(yīng)用加工后植物材料的研究報(bào)道。前人研究結(jié)果顯示，新鮮與烤后煙葉的SSR 指紋圖譜有較大差異[6，15]，從新鮮煙葉基因組DNA 開(kāi)發(fā)出的SNP 位點(diǎn)可能在烤后煙葉中缺失或無(wú)多態(tài)性。為探索SNP 分子標(biāo)記在烤后煙葉上品種鑒別的可行性，本研究應(yīng)用53 個(gè)SNP 位點(diǎn)對(duì)4 個(gè)品種的復(fù)烤煙葉進(jìn)行了基因分型，發(fā)現(xiàn)其中3 個(gè)位點(diǎn)具有品種多態(tài)性，通過(guò)構(gòu)建指紋圖譜和分子ID 可準(zhǔn)確區(qū)分4個(gè)品種的復(fù)烤煙葉。需要指出的是，隨著區(qū)分煙草品種的增多，所需SNP 位點(diǎn)也會(huì)相應(yīng)增加，未來(lái)可利用本研究挖掘的候選SNP 位點(diǎn)進(jìn)一步進(jìn)行多態(tài)性篩選，構(gòu)建更加完善的復(fù)烤煙葉SNP 分子ID，實(shí)現(xiàn)更多復(fù)烤煙葉品種的分子鑒別。

煙葉經(jīng)打葉復(fù)烤后成為形態(tài)、結(jié)構(gòu)大小類(lèi)似的片煙，目前尚無(wú)準(zhǔn)確、高效的品種鑒別方法。本研究應(yīng)用3 個(gè)多態(tài)性SNP 位點(diǎn)，通過(guò)等位基因特異性PCR及電泳構(gòu)建4個(gè)煙草品種復(fù)烤煙葉的指紋圖譜和分子ID，首次開(kāi)發(fā)了基于SNP 分子標(biāo)記的烤后煙草品種鑒別技術(shù)。與前人報(bào)道通過(guò)高密度SNP 芯片進(jìn)行煙草品種鑒別的方法[8]相比，本研究中的方法所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、結(jié)果分析直觀，對(duì)一線檢測(cè)人員的知識(shí)背景和試驗(yàn)技能要求較低，更適于在卷煙生產(chǎn)企業(yè)推廣應(yīng)用。