李靖靖

（鄒平市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東鄒平 256200）

食品安全一直以來都是人們關(guān)注的焦點(diǎn)，而微生物污染是造成食品安全問題的重要因素之一。因此，微生物檢測(cè)至關(guān)重要。酶聯(lián)免疫吸附法作為一種可靠、高效的微生物檢測(cè)技術(shù)，基于抗原-抗體反應(yīng)原理，通過標(biāo)記抗體或抗原的方式，可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中的毒素、藥物殘留、微生物等，具有結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，酶聯(lián)免疫吸附法一直被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)真菌毒素、轉(zhuǎn)基因食品、藥物材料及食品微生物等。

1 酶聯(lián)免疫吸附法概述

1.1 原理與常見類型

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）作為一種常見的免疫檢測(cè)技術(shù)，基于抗原-抗體反應(yīng)原理，通過將待檢測(cè)物質(zhì)（如藥物殘留、毒素或微生物）與特異性抗體結(jié)合，使用酶標(biāo)記的底物或二抗來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。該技術(shù)具有簡(jiǎn)便易行、高特異性、高靈敏度等特點(diǎn)，可用于定性或定量分析[1]。酶聯(lián)免疫吸附法的核心與關(guān)鍵在于抗原-抗體反應(yīng)，如果待測(cè)樣品中存在目標(biāo)物質(zhì)（抗原），其會(huì)與特異性抗體發(fā)生結(jié)合，這種結(jié)合可借助直接、間接或夾心ELISA 等來實(shí)現(xiàn)。

常見的ELISA 類型包括直接ELISA、間接ELISA 及夾心ELISA。其中，直接ELISA 最簡(jiǎn)單，其將待測(cè)樣品中的目標(biāo)物質(zhì)（抗原）與酶標(biāo)記的特異性一抗進(jìn)行結(jié)合，而后通過底物的酶反應(yīng)來檢測(cè)目標(biāo)抗原的存在，這一方法適用于抗原濃度較高的情況。間接ELISA 較常用，通過將待測(cè)樣品中的目標(biāo)物質(zhì)（抗原）與特異性一抗結(jié)合，而后再放入酶標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，觀察底物的酶反應(yīng)來檢測(cè)目標(biāo)抗原的存在，這一方法具有較高的靈敏性，適用于抗原濃度較低的情況。夾心ELISA 又稱間接捕獲ELISA，在樣品檢測(cè)過程中，其憑借兩種特異性抗體的結(jié)合來獲得目標(biāo)物質(zhì)，原理是第一種特異性抗體、目標(biāo)物質(zhì)及酶標(biāo)記的第二種特異性抗體形成“夾心”結(jié)構(gòu)，而后通過底物的酶反應(yīng)來檢測(cè)目標(biāo)抗原的存在[2]。這一方法因具有較高的靈敏度與特異性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于食品中毒素與微生物的檢測(cè)。除了上述提到的ELISA 類型，還有其他ELISA 變種，如競(jìng)爭(zhēng)ELISA，這些ELISA 在特定的應(yīng)用場(chǎng)景下具有適用性與優(yōu)勢(shì)。在實(shí)際應(yīng)用中，可以結(jié)合具體需求來選擇最恰當(dāng)?shù)姆椒ㄍ瓿赡繕?biāo)物質(zhì)的檢測(cè)。

1.2 操作步驟

酶聯(lián)免疫吸附分析法操作步驟涉及樣品處理與檢測(cè)以及數(shù)據(jù)分析。樣品處理與檢測(cè)的主要步驟如下。①樣品處理。根據(jù)實(shí)際需要，采取不同的樣品處理方法，如稀釋、濃縮、提取等，得到適合ELISA分析的樣品。②固相板涂層。在固相板（微孔板或多孔板）的孔洞內(nèi)涂上特異性抗體，并將固相板放置在孵化箱或冰箱中，在特定溫度與時(shí)間條件下，抗體會(huì)與孔洞內(nèi)的表面結(jié)合。③加入樣品。將樣品加入至涂有抗體的固相板孔洞中，使待測(cè)物質(zhì)與固相板上抗體形成特異性結(jié)合。④洗滌。洗滌孔洞的目的是去除非特異性結(jié)合的物質(zhì)。⑤加入二抗。再加入酶標(biāo)記的二抗，如抗動(dòng)物IgG、抗人類IgG 等，其可以與待測(cè)物質(zhì)形成特異性結(jié)合。⑥再次洗滌。再次洗滌的目的是去除非特異性結(jié)合的二抗。⑦加入底物。加入含有底物的試劑，使底物與酶標(biāo)記的二抗產(chǎn)生反應(yīng)，生成可觀測(cè)的信號(hào)。常見的底物有ABTS、TMB 等。⑧停止反應(yīng)。加入一定的反應(yīng)停止溶液，停止酶與底物的反應(yīng)，一般是通過添加化學(xué)物質(zhì)或改變pH 值來實(shí)現(xiàn)。⑨測(cè)量。利用ELISA 讀板儀可以讀取反應(yīng)產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度，通常以吸光度（OD值）表示，同時(shí)按照具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品處理的方式，能選擇合適的波長(zhǎng)完成測(cè)量[3]。

實(shí)際ELISA 實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合樣品的OD值，能夠定量或定性分析樣品中目標(biāo)物質(zhì)的存在。其中，數(shù)據(jù)分析通常包含以下幾個(gè)方面。①標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。根據(jù)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品的OD值，并繪制出OD值與濃度之間的關(guān)系曲線。②樣品濃度計(jì)算。按照樣品的OD值，借助標(biāo)準(zhǔn)曲線完成反推，計(jì)算得到樣品中目標(biāo)物質(zhì)的濃度，常可使用回歸分析、插值法來完成。③結(jié)果解讀?；跇悠分心繕?biāo)物質(zhì)的濃度來進(jìn)行結(jié)果解讀，同時(shí)結(jié)合檢測(cè)要求和限制來判斷樣品是否超過了安全標(biāo)準(zhǔn)[4]。具體實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)分析與結(jié)果解讀的可靠性與準(zhǔn)確性非常關(guān)鍵。由此，相關(guān)實(shí)驗(yàn)人員需要嚴(yán)格遵循正確的操作步驟，同時(shí)進(jìn)行恰當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制和驗(yàn)證，以此得到可靠、準(zhǔn)確的食品安全檢測(cè)結(jié)果。

2 ELISA 法在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 細(xì)菌檢測(cè)

細(xì)菌污染是造成細(xì)菌性食源性疾病的一種主要原因，而沙門氏菌與大腸桿菌是常見的致病菌。由此，使用ELISA 法檢測(cè)食物中的細(xì)菌具有重要意義。由于沙門氏菌感染可能引起腹瀉、發(fā)熱、胃腸道炎癥等不適，準(zhǔn)確、快速地確定食品樣品中的沙門氏菌有助于及時(shí)預(yù)防食源性感染。實(shí)際沙門氏菌檢測(cè)時(shí)，可以使用抗沙門氏菌特異性抗體，如抗沙門氏菌抗原抗體或抗沙門氏菌脂多糖抗體等，與沙門氏菌特定抗原相結(jié)合來完成檢測(cè)。大腸桿菌作為常見腸道細(xì)菌，多存在于人和動(dòng)物的腸道中。然而，食品中的大腸桿菌污染往往隱藏著一定的疾病風(fēng)險(xiǎn)。由此，檢測(cè)食品樣品中存在的大腸桿菌有助于確保食品安全。具體大腸桿菌檢測(cè)過程中，可以使用抗大腸桿菌特異性抗體，如抗大腸桿菌O 抗原抗體，將其與大腸桿菌特定抗原相結(jié)合來完成檢測(cè)[5]。

2.2 真菌毒素檢測(cè)

真菌毒素屬于有毒化合物，由真菌產(chǎn)生，廣泛存在于多種食品中，常見的真菌毒素有黃曲霉毒素與赭曲霉毒素等。黃曲霉毒素多存在于谷物、飼料、堅(jiān)果及調(diào)味品中，其能造成免疫抑制、肝臟損傷及神經(jīng)系統(tǒng)問題等。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)食品樣品中的黃曲霉毒素含量具有重要意義。利用ELISA 技術(shù)能將抗黃曲霉毒素特異性抗體與黃曲霉毒素相結(jié)合來完成檢測(cè)[6]。赭曲霉毒素多存在于谷物與堅(jiān)果等食品中，對(duì)人體的免疫系統(tǒng)與肝臟具有一定的潛在危害，可以借助ELISA 技術(shù)，將抗赭曲霉毒素特異性抗體與赭曲霉毒素相結(jié)合來完成檢測(cè)。

2.3 食品介導(dǎo)病毒檢測(cè)

食品介導(dǎo)病毒檢測(cè)旨在檢測(cè)食品中是否存在病毒感染源。其中，甲肝病毒與乙肝病毒是非常常見的食品介導(dǎo)病毒。甲肝病毒主要通過飲用水或食物傳播，會(huì)引起甲型肝炎；而乙肝病毒主要通過體液或血液傳播，可能導(dǎo)致乙型肝炎。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品樣品中是否存在乙肝病毒與甲肝病毒具有重要意義。利用ELISA 技術(shù)，借助相應(yīng)特異性抗體，如抗甲肝病毒抗原抗體、抗乙肝病毒表面抗原抗體等，將其與對(duì)應(yīng)病毒抗原相結(jié)合來完成檢測(cè)，這對(duì)于預(yù)防食源性感染具有積極意義。

2.4 藥物材料檢測(cè)

藥物材料檢測(cè)旨在檢測(cè)食品中是否存在禁用獸用殘留物與激素等物質(zhì)，這些物質(zhì)可能會(huì)對(duì)人體健康造成一定的危害。禁用獸用殘留物是指食品中存在超過法定限量的藥物殘留物，而激素作為常用于畜牧業(yè)的化學(xué)物質(zhì)，過度使用可能引發(fā)潛在的健康問題[7]。利用ELISA 技術(shù)，將相關(guān)特異性抗體與禁用獸用殘留物或激素相結(jié)合來完成檢測(cè)，這對(duì)于保障食品安全具有積極作用。

2.5 轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因食品是指含有外源基因的食品，而轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)可用于檢測(cè)食品中是否含有目的蛋白質(zhì)、基因序列等轉(zhuǎn)基因成分。利用ELISA 技術(shù)，使用抗轉(zhuǎn)基因DNA 序列抗體、抗轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)抗體等特異性抗體，與轉(zhuǎn)基因序列或轉(zhuǎn)基因目的蛋白質(zhì)相結(jié)合，能夠完成轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)，這對(duì)于準(zhǔn)確、客觀評(píng)估食品安全具有積極意義[8]。ELISA 技術(shù)在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用廣泛且多樣化，能夠準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出食品樣品中的細(xì)菌、真菌毒素、病毒、藥物材料以及轉(zhuǎn)基因成分，從而為食品安全提供有力保障。

3 ELISA 法面臨的局限性及未來發(fā)展方向

ELISA 法面臨的局限性如下。①交叉反應(yīng)。檢測(cè)目標(biāo)抗體可能與結(jié)構(gòu)類似的分子發(fā)生非特異性結(jié)合，造成誤判。若要解決這一問題，需要選用更精確的驗(yàn)證抗體，并研究更具特異性的檢測(cè)方法。②樣品在檢測(cè)過程中的限制。不恰當(dāng)?shù)奶幚聿僮骺赡茉斐煽乖蚩贵w損失，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。尤其是復(fù)雜樣品，如高脂食品等，需要額外的預(yù)處理操作來提高檢測(cè)的靈敏度與特異性。③ELISA 法的檢測(cè)范圍受限。傳統(tǒng)的ELISA 法過度依賴于抗體的識(shí)別能力，僅可以檢測(cè)已知的目標(biāo)分子，而對(duì)于未知變種或新興食品污染物，缺乏特異性抗體，由此需要研究新的技術(shù)，以獲得更多具有特異性與高親和力的抗體。因此，ELISA 法的未來發(fā)展方向可以集中在以下方面。①ELISA 法與質(zhì)譜分析相結(jié)合。質(zhì)譜分析具有高分辨率、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)，適用于檢測(cè)與鑒定食品中的微量污染物，為ELISA 法提供更多的信息。②ELISA 法與基因測(cè)序技術(shù)結(jié)合?；驕y(cè)序技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)食品與轉(zhuǎn)基因食品的真實(shí)性驗(yàn)證與溯源。引入質(zhì)譜分析與基因測(cè)序，ELISA 有望在未來提高特異性、靈敏度及準(zhǔn)確性，提供精準(zhǔn)的檢測(cè)手段。

4 結(jié)語

綜上所述，ELISA 作為一種靈敏、高效的檢測(cè)方法，在食品安全相關(guān)領(lǐng)域具有重要意義。通過快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的藥物殘留、真菌毒素、微生物及轉(zhuǎn)基因成分，能夠有效保障公眾的飲食安全。ELISA 雖然有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)與識(shí)別潛在的風(fēng)險(xiǎn)和問題，但也面臨一些挑戰(zhàn)和限制，如交叉反應(yīng)與樣品處理等因素會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，不同食品樣品的多樣性與復(fù)雜性也會(huì)影響ELISA 的特異性與準(zhǔn)確性等。因此，我國(guó)應(yīng)持續(xù)研究與探索ELISA 技術(shù)，同時(shí)嘗試結(jié)合新興的檢測(cè)技術(shù)，如質(zhì)譜分析、基因測(cè)序等，以提高食品安全檢測(cè)的準(zhǔn)確性與適用性。