蔡 瑜王璐婉謝冬琳高大鵬*

(1.浙江藥科職業(yè)大學(xué),浙江 寧波 315500;2.寧波大學(xué),浙江 寧波 315211;3.寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院,浙江 寧波 315020)

酒是人類(lèi)社會(huì)流傳下來(lái)最古老的飲料之一。無(wú)論慶典、社交還是日常生活,酒都是必不可少之物。 但長(zhǎng)期過(guò)量飲酒會(huì)造成酒精濫用及依賴(lài),嚴(yán)重影響學(xué)習(xí)、記憶和認(rèn)知等神經(jīng)功能,是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。 據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)表的全球酒精與健康報(bào)告指出,全球所有死亡人數(shù)的5.9%和全球疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的5.1%可歸因于過(guò)量飲酒[1]。 我國(guó)是一個(gè)酒類(lèi)生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó),到2030 年中國(guó)成人的人均飲酒量將超過(guò)美國(guó),成為世界上最大的飲酒國(guó)家[1]。 酒精依賴(lài)患者由于長(zhǎng)期大量飲酒造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)代謝紊亂、神經(jīng)損傷及神經(jīng)退行性病變,被稱(chēng)為慢性酒精中毒性腦病[2-3]。 該病臨床主要表現(xiàn)有認(rèn)知功能障礙,包括注意力不集中、記憶力下降和思維能力受損等,后期可出現(xiàn)酒精性癡呆、酒精性譫妄等[4-5]。 臨床病例研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期飲酒造成腦內(nèi)海馬和額葉區(qū)域的灰質(zhì)和白質(zhì)體積異常減少,提示這些區(qū)域有顯著的神經(jīng)元丟失[6]。 過(guò)量飲酒對(duì)個(gè)體、家庭及社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān),因此,為探究慢性酒精中毒性腦損傷的發(fā)病機(jī)制和治療藥物而構(gòu)建有效穩(wěn)定的動(dòng)物研究模型十分重要。

目前,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的常見(jiàn)的動(dòng)物模型給酒方式包括口服、灌胃、腹腔注射和吸入。 通常,腹腔注射和灌胃方式用于急性飲酒模型,而口服和吸入方式用于慢性的酒精暴露方案[7]。 但是,以上任何一種單一的給酒方式均存在不足,無(wú)法滿(mǎn)足方便經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定可靠和盡可能模擬人類(lèi)飲酒的造模要求。因此探索多種給酒方式結(jié)合的造模方法可能是解決單一給酒方式局限性的有效途徑。 此外,已報(bào)道的慢性酒精中毒性腦損傷小鼠模型的評(píng)價(jià)尚有很多不足。 因此,探索建立多種給酒方式結(jié)合的慢性酒精中毒的動(dòng)物模型,并全面、客觀評(píng)價(jià)腦損傷動(dòng)物模型具有重要意義。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小鼠長(zhǎng)期飲用水中添加酒精結(jié)合酒精灌胃法,觀察小鼠的認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)行為學(xué)改變以及檢測(cè)腦組織的形態(tài)學(xué)變化,構(gòu)建慢性小鼠酒精中毒性腦損傷模型,為后續(xù)慢性酒精中毒性腦病機(jī)制的研究和治療藥物的評(píng)價(jià)建立有效穩(wěn)定的動(dòng)物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40 只SPF 級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠,體重(19±1.5)g,7 周齡,購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(浙)2019-0001]。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(浙)2019-0005]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(IACUC-NBU20230138),并在動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3R 原則。 所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,隨機(jī)分成對(duì)照組20 只和模型組20 只,開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器

北京56°二鍋頭酒(北京京極酒業(yè)有限公司,生產(chǎn)批號(hào):20210827);蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色試劑盒(Solarbio 北京索萊寶科技有限公司,G1120,生產(chǎn)批號(hào):20230217)和尼氏染色試劑盒(焦油紫法)(Solarbio 北京索萊寶科技有限公司,G1430,生產(chǎn)批號(hào):20220214)。 ANY-maze 行為學(xué)分析系統(tǒng)(美國(guó)stoelting 公司);徠卡RM2235 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司);光學(xué)顯微鏡(日本Nikon 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型的建立

根據(jù)美國(guó)國(guó)家酒精濫用與酒精中毒研究所(National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism,NIAAA)的定義,危險(xiǎn)飲酒(risky use)是指65 歲以下的男性,每天飲用超過(guò)4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)杯乙醇。 為了模擬人類(lèi)酗酒者的每日酒精飲用量,經(jīng)過(guò)體表面積折算,每只小鼠每天的酒精使用量需達(dá)到10 g/kg 及以上。 造模過(guò)程使用的酒精濃度和實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)基于預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,具體動(dòng)物模型建立過(guò)程如下:將56°白酒稀釋成5%(v/v)和28%(v/v)兩個(gè)濃度,模型組小鼠除基礎(chǔ)飲用水中含終濃度為5%(v/v)的酒精外,同時(shí)灌胃28%(v/v)酒精,前兩周灌胃劑量呈梯度增長(zhǎng)(從0 逐漸增加至6 g/kg 體重),隨后4 周灌胃劑量維持在6 g/kg 體重,對(duì)照組飲用水中不添加酒精同時(shí)灌胃等量生理鹽水。 繼6 周的建模過(guò)程后,所有小鼠接受認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)包括Y 迷宮、Morris 水迷宮、爬桿實(shí)驗(yàn)和平衡木實(shí)驗(yàn),每個(gè)實(shí)驗(yàn)之間間隔1 ～3 d,使得動(dòng)物獲得充分的休息。 具體慢性酒精中毒性腦損傷的建模過(guò)程和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)間表見(jiàn)圖1。

圖1 慢性酒精中毒性腦損傷的建模過(guò)程和行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)間表Figure 1 Modeling process of chronic alcoholic brain injury and timeline for behavior experiments

1.3.2 行為學(xué)測(cè)試方法

(1)Y 迷宮實(shí)驗(yàn)

Y 迷宮實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行并稍有改進(jìn)。 Y 迷宮裝置由三個(gè)等長(zhǎng)水平臂組成(每個(gè)臂長(zhǎng)40 cm,寬10 cm,高20 cm),彼此成120°角,從一個(gè)中心點(diǎn)向外輻射。 簡(jiǎn)要步驟如下:小鼠被放置在三個(gè)臂的中心,在8 min 的時(shí)間里,它們可以自由地出入所有的三個(gè)臂。 記錄進(jìn)入三個(gè)臂的總次數(shù)和進(jìn)入順序。交替百分比被定義為連續(xù)進(jìn)入三個(gè)不同臂的次數(shù)/(總次數(shù)-2)。 交替百分比可以作為動(dòng)物空間工作記憶的指標(biāo),而進(jìn)入三個(gè)臂的總次數(shù)可以作為動(dòng)物自發(fā)運(yùn)動(dòng)的指標(biāo)。

(2)Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[9-10]進(jìn)行并稍有改進(jìn)。 水迷宮宮體直徑125 cm,高75 cm。 內(nèi)壁涂黑,宮體內(nèi)充滿(mǎn)自來(lái)水,水溫保持在(23±2)℃。 逃生平臺(tái)直徑9 cm,距離圓周30 cm,置于宮體內(nèi)坐標(biāo)位置的第一象限。 簡(jiǎn)要步驟如下:整個(gè)水迷宮實(shí)驗(yàn)包括1 d 的適應(yīng)環(huán)境,1 d 的尋找可見(jiàn)平臺(tái)定位航行,5 d的尋找隱藏平臺(tái)(平臺(tái)低于水面0.7 cm)定位航行和去除平臺(tái)后1 d 的空間探索。 在定位航行過(guò)程中,將自由活動(dòng)的小鼠分別從四個(gè)象限隨機(jī)放入水中,讓其在逃生中尋找平臺(tái),若90 s 后,小鼠仍未找到平臺(tái),則引導(dǎo)小鼠找到平臺(tái)上,并在平臺(tái)上待15 s,每天訓(xùn)練3 次;在空間探索過(guò)程中,將小鼠從迷宮的固定位置放入水中,讓其自由探索60 s。 小鼠活動(dòng)通過(guò)水池上方固定的攝像頭進(jìn)行圖像采集并用ANY-mazeTM軟件進(jìn)行處理。 主要觀察指標(biāo)有:定位航行實(shí)驗(yàn)中小鼠找到平臺(tái)的平均逃避潛伏期和平均游泳速度,空間探索實(shí)驗(yàn)中小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)、在平臺(tái)象限的停留時(shí)間和搜索路徑。 動(dòng)物在最后1 d 空間探索實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)可以用來(lái)全面評(píng)估小鼠的空間記憶能力。

(3)平衡木實(shí)驗(yàn)

參照Drucker-Colín 等[11]報(bào)道的平衡木實(shí)驗(yàn)方法并稍有改進(jìn),簡(jiǎn)要步驟如下:取100 cm 長(zhǎng)、直徑1.8 cm 的圓木棒作為平衡木,平放于地面,兩端各一木架支撐(高60 cm)。 其中一端置一黑色塑料籠,為每次實(shí)驗(yàn)小鼠的終點(diǎn)。 實(shí)驗(yàn)前,訓(xùn)練小鼠從平衡木一端爬行至另一端的塑料籠里,并在籠里待15 s,每只小鼠訓(xùn)練6 次。 訓(xùn)練完畢進(jìn)行平衡木爬行時(shí)間測(cè)定,記錄每只小鼠在整根平衡木爬行的總時(shí)間,作為動(dòng)物運(yùn)動(dòng)和平衡能力的指標(biāo)。

(4)爬桿實(shí)驗(yàn)

參照Arai 等[12]報(bào)道的爬桿實(shí)驗(yàn)方法并稍有改進(jìn)。 簡(jiǎn)要步驟如下:將小鼠放在長(zhǎng)50 cm,直徑1.2 cm,45°固定的圓木棒上,使肌肉處于靜力緊張狀態(tài)。 先引導(dǎo)動(dòng)物在15 s 內(nèi)由桿頂爬至桿底,每只訓(xùn)練4 次,訓(xùn)練完畢進(jìn)行爬桿時(shí)間測(cè)定,記錄每只小鼠的爬桿時(shí)間,作為動(dòng)物運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力的指標(biāo)。

1.3.3 腦組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法

將小鼠麻醉后,開(kāi)胸,左心室插入灌注針頭,先灌注生理鹽水50 mL,再灌注4%多聚甲醛溶液50 mL,待小鼠全身僵直后,斷頭處死,冰上取全腦,4%多聚甲醛溶液固定18 h,石蠟包埋,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution, PBS)漂洗,梯度乙醇脫水,石蠟包埋,切片,片厚8 μm,HE 及尼氏染色,光鏡觀察皮層及海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(xˉ±sxˉ)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,Morris水迷宮隱藏平臺(tái)測(cè)試期采用two-way ANOVA 進(jìn)行分析。 所有統(tǒng)計(jì)分析及作圖均使用GraphPad Prism 9.5.0 軟件進(jìn)行。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠認(rèn)知功能比較

在建立慢性酒精中毒性腦損傷模型小鼠的過(guò)程中,模型組小鼠體重增長(zhǎng)顯著低于對(duì)照組,從第2周開(kāi)始直至第6 周,模型組小鼠的體重明顯低于同齡的對(duì)照組小鼠(圖2)。 為了揭示酒精暴露小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷,每只小鼠都接受了Y 迷宮測(cè)試和Morris 水迷宮測(cè)試。 在Y 迷宮測(cè)試中,對(duì)照組和模型組小鼠進(jìn)入三臂的總次數(shù)沒(méi)有差異,這表明動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)不受長(zhǎng)期酒精暴露的影響。 在Y 迷宮測(cè)試中,模型組小鼠的自發(fā)交替率低于對(duì)照組(P＜0.01),提示慢性乙醇處理可誘發(fā)小鼠短期空間工作記憶障礙(圖2)。

注:A:小鼠體重變化;B:Y 迷宮實(shí)驗(yàn)。 與對(duì)照組相比, *P＜0.05, **P＜0.01。圖2 小鼠體重和Y 迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Note.A, Body weight changes of mice.B, Y maze test.Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 2 Comparison of body weights and the performance in Y maze between two groups

在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,平臺(tái)測(cè)試中兩組的逃避潛伏期和平均游泳速度均無(wú)顯著差異(圖3)。 在隱藏平臺(tái)試驗(yàn)測(cè)試中,對(duì)于兩組小鼠在連續(xù)4 d 訓(xùn)練的逃避潛伏期數(shù)據(jù)進(jìn)行two-way ANOVA 分析(針對(duì)組別和訓(xùn)練天數(shù)這兩個(gè)因素),所得的分析結(jié)果說(shuō)明,無(wú)論是組別因素,還是訓(xùn)練天數(shù)因素,均對(duì)最終的逃避潛伏期有顯著影響(分別是P＜0.05 和P＜0.001),但上述兩個(gè)因素沒(méi)有交叉影響(P=0.9313)。

注:A:可見(jiàn)平臺(tái)測(cè)試;B:隱藏平臺(tái)測(cè)試;C:空間探索測(cè)試。 與對(duì)照組相比, *P＜0.05。圖3 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Note.A, Visible platform trial.B, Hidden platform trial.C, Probe trial.Compared with the control group, *P＜0.05.Figure 3 Comparison of the results of water maze between two groups

這些分析結(jié)果表明,在隱藏平臺(tái)試驗(yàn)測(cè)試中,兩組小鼠隨訓(xùn)練天數(shù)的增加,逃避潛伏期逐漸降低,結(jié)果有顯著性差異;并且相對(duì)于對(duì)照組,模型組的逃避潛伏期維持較長(zhǎng)時(shí)間,結(jié)果有顯著性差異。此外,對(duì)于隱藏平臺(tái)試驗(yàn)測(cè)試的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),兩組小鼠隱藏平臺(tái)測(cè)試第1 天逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與對(duì)照組相比,模型組在第2 ～4 天逃避潛伏期顯著增加(P＜0.05)。 在空間探索測(cè)試中,長(zhǎng)期暴露于酒精的小鼠與對(duì)照組小鼠相比,穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P＜0.05)以及在平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比顯著降低(P＜0.05)。 在搜索策略方面,模型組小鼠的路徑軌跡不太集中于平臺(tái)所在象限。 綜上,與對(duì)照組相比,長(zhǎng)期酒精暴露導(dǎo)致小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶缺陷。

2.2 兩組小鼠運(yùn)動(dòng)功能比較

在平衡木實(shí)驗(yàn)中,模型組小鼠通過(guò)平衡木的總時(shí)間顯著大于對(duì)照組(P＜0.01),見(jiàn)圖4。 在爬桿實(shí)驗(yàn)中,模型組小鼠的爬桿時(shí)間與對(duì)照組相比顯著延長(zhǎng)(P＜0.05),見(jiàn)圖4。 綜上,與對(duì)照組相比,慢性酒精暴露導(dǎo)致小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力明顯降低。

注:A:平衡木實(shí)驗(yàn);B:爬桿實(shí)驗(yàn)。 與對(duì)照組相比, *P ＜0.05, **P＜0.01。圖4 平衡木和爬桿實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Note.A, beam balance experiment.B, pole test.Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.Figure 4 Comparison of the results of beam balance experiment and pole test between two groups

2.3 兩組小鼠腦組織形態(tài)學(xué)比較

HE 染色顯示對(duì)照組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元排列清晰,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、輪廓清晰,而模型組小鼠神經(jīng)元表型明顯收縮變形(圖5A),并且,在長(zhǎng)期乙醇暴露后,小鼠海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。 尼氏染色結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了兩組神經(jīng)元的這些病理改變(圖5B)。 即對(duì)照組海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)輪廓清晰,而模型組小鼠神經(jīng)元萎縮,形態(tài)破壞。 并且,經(jīng)長(zhǎng)期乙醇暴露后,小鼠海馬組織CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。 兩組小鼠腦組織病理染色結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,長(zhǎng)期乙醇暴露導(dǎo)致小鼠海馬區(qū)形態(tài)損傷和細(xì)胞壞死。

注:A:海馬組織HE 染色;B:海馬組織尼氏染色。圖5 海馬組織HE 和尼氏染色結(jié)果比較Note.A, HE staining of hippocampus.B, Nissl staining of hippocampus.Figure 5 Comparison of the results of HE staining and Nissl staining of hippocampus

3 討論

酒精使用障礙是發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的神經(jīng)和精神疾病之一,影響全球數(shù)百萬(wàn)人[13]。 隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,慢性酒精中毒性腦病的發(fā)病率逐年上升,但目前尚未得到足夠的重視。 為了進(jìn)一步對(duì)長(zhǎng)期過(guò)量酗酒所致的腦損傷的病理變化和發(fā)病機(jī)制有更好的研究,探索建立合適的動(dòng)物模型至關(guān)重要。

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的慢性酒精中毒性肝損傷模型和慢性飲酒成癮/戒斷模型及評(píng)價(jià)已較成熟,而慢性酒精誘導(dǎo)的腦損傷動(dòng)物模型及評(píng)價(jià)尚未完善。對(duì)于建立慢性酒精中毒性腦損傷動(dòng)物模型,有一些重要的造模因素需考慮并優(yōu)化,包括選取的動(dòng)物種類(lèi)品系、給予動(dòng)物酒精的方式、給予酒精的濃度、動(dòng)物酒精暴露的時(shí)間和劑量等。 本研究均通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)上述各因素進(jìn)行確定并優(yōu)化,以期得到一種盡可能模擬人類(lèi)慢性飲酒過(guò)程、穩(wěn)定可靠且造模時(shí)間短的腦損傷模型,這也是本研究對(duì)于目前已有造模方法的改進(jìn)創(chuàng)新之處。 具體模型建立過(guò)程中,首先,本實(shí)驗(yàn)選取了C57BL/6J 品系的小鼠作為建立模型的對(duì)象,這向該品系小鼠有較高的自愿飲酒量以及對(duì)酒精的生理反應(yīng)與人類(lèi)非常相似等特征有關(guān)[14]。 盡管?chē)?guó)內(nèi)外文獻(xiàn)也選用過(guò)BALB/c、ICR 及昆明小鼠作為造模對(duì)象[15-17],但總體而言,C57BL/6J 小鼠是目前研究酒精誘導(dǎo)的器官損傷最常用的動(dòng)物之一。 此外,建立模型過(guò)程中,如何給予動(dòng)物酒精的方式也是需要考慮并優(yōu)化的。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道常見(jiàn)的給酒方式包括口服(含酒精的流質(zhì)飲食或飲用水)、灌胃、腹腔注射和吸入(暴露于酒精蒸氣)。 通常,急性飲酒模型采用的是腹腔注射和灌胃方式,而慢性的動(dòng)物酒精暴露方案采用口服和吸入方式[7]。 含酒精的流質(zhì)飲食最早是由Lieber 和DeCarli 開(kāi)發(fā)的,在造模過(guò)程中,該飲食作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物唯一的食物和水來(lái)源[18-19]。 Lieber-DeCarli 模型雖然造模簡(jiǎn)便但未模仿人類(lèi)飲酒。 并且,還存在造模耗時(shí)長(zhǎng)、飲食種類(lèi)受限、營(yíng)養(yǎng)情況與正常飲食時(shí)不同等不足。 Tsukamoto-French 模型是通過(guò)動(dòng)物胃內(nèi)植入導(dǎo)管的方式給予酒精[20],造模過(guò)程需要特殊的設(shè)備技術(shù)和持續(xù)的動(dòng)物監(jiān)測(cè)、成本高,不便于廣泛應(yīng)用。 飲用水中添加酒精的模型是長(zhǎng)期乙醇暴露的更實(shí)用的解決方案,該模型已用于多種物種,包括小鼠、大鼠和豚鼠[21-22]。 該模型優(yōu)點(diǎn)是模擬人類(lèi)飲酒的生理過(guò)程、建模方便便宜,可長(zhǎng)期給酒(8 個(gè)月以上),但存在造模時(shí)間長(zhǎng),并且可能無(wú)法模擬人類(lèi)酒精疾病的晚期階段等不足[23]。de Witte 等[24]開(kāi)發(fā)了一種稱(chēng)為“肺酒精化”的酒精吸入模型,可以長(zhǎng)期達(dá)到較高的(200 mg/dL)血液酒精水平,適合酒精成癮方面的研究,但吸入酒精畢竟不同于飲用酒精,不能完全模擬真實(shí)情況。 綜合考量上述給酒方式的優(yōu)缺點(diǎn),此次模型采用飲水中添加酒精+灌胃法,避免單一給酒方式的局限性,使動(dòng)物模型盡可能模擬人類(lèi)慢性飲酒過(guò)程并縮短造模時(shí)間。 更值得一提的是,通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),小鼠灌胃時(shí)能耐受的酒精濃度需低于30%(v/v),因此56°的白酒原液需稀釋1 倍后使用并1 d 中分兩次灌胃。 陳翠桃等[16]采用白酒原液灌胃前30 min給予小鼠灌胃蒸餾水的方法,這些都是為了減少高度酒精灌胃引起的小鼠中毒癥狀甚至死亡。 并且,造模前兩周采用酒精劑量梯度提升,提高小鼠耐受性和存活率。 最后,動(dòng)物暴露酒精的時(shí)間長(zhǎng)短也是建立模型時(shí)需要考慮的問(wèn)題。 通常研究人員會(huì)將1個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間地給予酒精視為慢性酒精暴露[23]。酒精引起的慢性疾病,如慢性酒精中毒性腦病,是一個(gè)多步驟的疾病過(guò)程,研究者感興趣的多步驟多進(jìn)程的哪個(gè)階段將決定酒精的給藥持續(xù)時(shí)間[23]。 本研究對(duì)慢性酒精中毒性腦病的早期癥狀尤其是認(rèn)知功能障礙和運(yùn)動(dòng)功能障礙最為關(guān)注,結(jié)合前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,最終將小鼠慢性酒精暴露的時(shí)間優(yōu)化為6 周,相比目前報(bào)道的造模方法,既縮短了造模時(shí)間,又可以獲得穩(wěn)定的慢性酒精中毒性腦損傷模型。

采用動(dòng)物模型效度對(duì)本研究所建立的小鼠動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。 動(dòng)物模型效度是動(dòng)物模型的綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),即評(píng)價(jià)所建立的動(dòng)物模型在多大程度上模擬了臨床該種疾病。 動(dòng)物模型效度主要由表面效度、結(jié)構(gòu)效度和預(yù)測(cè)效度組成,其中表面效度指動(dòng)物模型與臨床疾病癥狀和體征的相似性,結(jié)構(gòu)效度指動(dòng)物造模過(guò)程與臨床疾病的致病過(guò)程和病理機(jī)制的相似性,預(yù)測(cè)效度指動(dòng)物模型與臨床患者對(duì)治療藥物反應(yīng)的相似性。 首先,從表面效度看,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,模型組體重增長(zhǎng)幅度顯著降低,日常活動(dòng)易被噪聲驚嚇、動(dòng)作刻板;在認(rèn)知行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,模型組在Y 迷宮測(cè)試中的自發(fā)交替率顯著降低,在水迷宮空間探索階段的穿越平臺(tái)次數(shù)和在平臺(tái)象限停留時(shí)間百分比顯著降低;在運(yùn)動(dòng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,長(zhǎng)期酒精暴露會(huì)導(dǎo)致小鼠通過(guò)平衡木的總時(shí)間和爬桿時(shí)間顯著延長(zhǎng);并且,模型組小鼠腦組織HE 染色和尼氏染色均顯示出海馬區(qū)形態(tài)損傷和細(xì)胞壞死。 這些與臨床上觀察到的患者在病理及病理生理方面的變化極為相似。 例如,慢性酒精中毒性腦病的患者早期常有焦慮不安、頭痛、失眠、乏力、注意力不集中等,逐漸出現(xiàn)智能障礙和精神異常,表現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、注意力不集中、記憶力下降,常伴有虛構(gòu)、思維能力受損,有的出現(xiàn)眼肌麻痹、共濟(jì)失調(diào)和影像學(xué)改變等。 與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)已報(bào)道的慢性酒精中毒性腦損傷模型評(píng)價(jià)相比,本研究對(duì)模型小鼠的認(rèn)識(shí)功能、運(yùn)動(dòng)功能以及海馬區(qū)病理?yè)p傷都采用兩種經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果相互佐證。 其次,從結(jié)構(gòu)效度看,慢性飲酒是酒精中毒性腦病的重要誘因,據(jù)此,建立小鼠長(zhǎng)時(shí)間酒精暴露可以認(rèn)為是一種具有良好效度的疾病模型。最后,從預(yù)測(cè)維度看,目前臨床尚無(wú)藥物治療該疾病,因此無(wú)從驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)效度。 綜上所述,本實(shí)驗(yàn)所建立的小鼠慢性酒精中毒性腦損傷模型在動(dòng)物模型的表面和結(jié)構(gòu)效度上是非常有優(yōu)勢(shì)的,基本模擬了人類(lèi)長(zhǎng)期飲酒導(dǎo)致的早期神經(jīng)病理和行為學(xué)改變。 此外,本實(shí)驗(yàn)造模方法簡(jiǎn)單方便、飼養(yǎng)成本較低、動(dòng)物存活率高、時(shí)間短,在6 周內(nèi)可初步建立小鼠慢性酒精中毒性腦損傷模型。 本研究的局限性在于,僅從動(dòng)物行為學(xué)和腦組織形態(tài)學(xué)兩方面評(píng)價(jià)了慢性酒精對(duì)小鼠腦組織所造成的損傷。在接下來(lái)的研究工作中,我們將進(jìn)一步探討慢性酒精所致的認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制以及潛在藥物的治療作用。