劉 雅,陳思嬡,龐一丹,齊佳瑞,孫靜薇,安 娟,蘇占海

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部,西寧 810001)

鬼臼毒素(Podofilox)是一種鬼臼屬植物桃兒七(生長于海拔2 000～4 000米的青藏高原)的芳基萘類木脂素內(nèi)酯[1],具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等多種生物學(xué)活性,其中抗腫瘤活性最為顯著[2]。研究人員通過修飾鬼臼毒素結(jié)構(gòu),得到衍生物依托泊苷(etoposide,VP-16)和替尼泊苷(teniposide,VM-26)[3],為廣譜抗腫瘤藥物。雖然鬼臼毒素及其衍生物取得了較好的臨床療效,但作用機(jī)制不甚清楚。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)法研究鬼臼毒素對胃癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與細(xì)胞

鬼臼毒素(上海陶素生化有限公司,產(chǎn)品編號:T1121),人胃腺癌AGS細(xì)胞(武漢普諾賽生物公司)。

1.1.2 試劑與儀器

人胃癌AGS細(xì)胞專用培養(yǎng)基(武漢普諾賽生物公司),0.25%胰蛋白酶溶液(北京索萊寶公司),PBS(北京索萊寶公司),CCK-8試劑溶液(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司),引物(中國上海生工公司),總RNA提取試劑盒(中國北京天根生化科技有限公司),FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(中國北京天根生化科技有限公司),SuperReal PreMix Color(中國北京天根生化科技有限公司)。

NanoDrop 2000紫外分光光度計(美國Thermo公司),實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法

1.2.1.1 鬼臼毒素的分子靶標(biāo)確定

基于TCMSP(https://tcmsp-e.com/)、Pubchem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、Swiss Target Prediction(http://swisstargetprediction.ch/)、Similarity ensemble approach(https://sea.bkslab.org/)、Pharmapper(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數(shù)據(jù)庫[4]完成靶標(biāo)預(yù)測。由于識別出的部分候選靶標(biāo)未使用公認(rèn)基因名,因此使用UniProt(www.uniprot.org/)、STRING數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)進(jìn)行基因映射,獲取鬼臼毒素分子靶標(biāo)名稱。

1.2.1.2 與胃癌相關(guān)的基因鑒定

應(yīng)用GeneCards(http://www.gene-cards.org/)、Disgenet(https://www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫鑒定與胃癌相關(guān)的基因。

1.2.1.3 韋恩圖交集靶標(biāo)篩選

將使用韋恩圖在線網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)預(yù)測得到的鬼臼毒素潛在靶標(biāo)和胃癌基因取交集,再將轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中的差異基因與公共數(shù)據(jù)庫來源的潛在靶標(biāo)基因上傳至該網(wǎng)站做韋恩圖,取韋恩圖中的交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫。

1.2.1.4 PPI蛋白互作分析

利用公共數(shù)據(jù)庫STRING構(gòu)建胃癌相關(guān)基因和鬼臼毒素相關(guān)治療靶標(biāo)的相互作用網(wǎng)絡(luò)。各靶標(biāo)間的最低交互得分是0.4。將結(jié)果保存為tsv格式后導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件,繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.2.1.5 GO和KEGG富集分析

我們將核心靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID(https://david.ncifcrf.gov)數(shù)據(jù)庫[5]獲得由GO和KEGG分析的結(jié)果。GO富集分析包括3類:生物過程(BPs)、細(xì)胞組分(CCs)和分子功能(MFs)。利用微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn)繪制GO富集和KEGG信號通路富集的氣泡圖。

1.2.2 體外實(shí)驗(yàn)方法

1.2.2.1 藥物配置

取鬼臼毒素藥品粉末用DMSO溶解至100 μM,再用培養(yǎng)基稀釋至工作濃度(12.50、6.25、3.13、1.56 nM),用微膜過濾后置-20℃冰箱保存。用前震蕩混勻。

1.2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

使用含10%胎牛血清的專用培養(yǎng)基(37℃,5% CO2)培養(yǎng)人胃腺癌細(xì)胞AGS,每2 d換液一次。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時進(jìn)行傳代,分為對照組和不同藥物濃度實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將對數(shù)生長階段的AGS細(xì)胞以每孔5 000個細(xì)胞的密度接種于96孔板,置細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃,5% CO2)培養(yǎng)24 h,加藥繼續(xù)培養(yǎng)24 h后吸去原培養(yǎng)基,每孔(4個復(fù)孔)加入10 μL CCK-8溶液和100 μL完全培養(yǎng)基混合液,搖勻避光培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測光密度(OD)值,根據(jù)OD值繪制細(xì)胞增殖曲線并計算IC50值。細(xì)胞存活率(%)按下式計算:細(xì)胞存活率(%)=(給藥組的OD值-空白組的OD值)/(對照組的OD值-空白組的OD值)×100%。

1.2.2.4 qRT-PCR測定

將計算得到的IC50值設(shè)置為加藥組的藥物濃度,使用該濃度的鬼臼毒素處理AGS細(xì)胞。根據(jù)試劑盒說明,使用總RNA提取試劑盒提取藥物作用24 h的細(xì)胞總RNA?？俁NA被反向轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Sybrgreen PCR試劑進(jìn)行相對定量PCR實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性900 s;95℃變性15 s,60℃退火/延伸20 s,共40個循環(huán)(兩步法)。相對mRNA表達(dá)水平使用2-ΔΔCt法表示。qRT-PCR 使用的引物序列信息見表1。

表1 引物序列信息

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析方法

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.1.1 潛在靶標(biāo)篩選

應(yīng)用TCMSP、Swiss Target Prediction、Pubchem等數(shù)據(jù)庫共篩選出120個鬼臼毒素潛在靶標(biāo)。從Genecard、Disgenet數(shù)據(jù)庫共得到1 901個胃癌相關(guān)基因。分析鬼臼毒素靶標(biāo)和胃癌基因的共同基因(即鬼臼毒素對胃癌作用的潛在靶標(biāo)),得到120個交集基因。

我們前期從測序數(shù)據(jù)研究中共獲得了1 278個差異基因[6],將這些差異基因與從公共數(shù)據(jù)庫得到的120個預(yù)測靶標(biāo)上傳到上文提到的韋恩圖在線網(wǎng)站繪制Venn圖(圖1),該圖顯示有15個相交靶標(biāo),分別是ISG20、HSPA5、MTHFD1、RELA、TP53、ANG、EGFR、IGF1R、MET、ALDH1A1、DHFR、JUN、BCL2L1、CCND1、VIM,鬼臼毒素和胃癌交集靶標(biāo)名稱和信息見表2。

圖1 鬼臼毒素和胃癌交集靶標(biāo)Venn圖

表2 鬼臼毒素潛在靶標(biāo)名稱和基因信息

2.1.2 蛋白-蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將鬼臼毒素的15個核心靶標(biāo)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白-蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖,并應(yīng)用Cytoscape 3.8.2軟件優(yōu)化網(wǎng)絡(luò)(圖2)。隨著度值減小,節(jié)點(diǎn)顏色和大小由深到淺,每條邊代表活性成分與作用靶標(biāo)之間的相互作用關(guān)系。

圖2 Cytoscape蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.1.3 GO富集分析與KEGG信號通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對15個潛在靶標(biāo)進(jìn)行了GO富集分析和KEGG信號通路富集分析。我們將數(shù)據(jù)導(dǎo)入微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制GO富集分析氣泡圖(圖3A-C),以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選MF、CC、BP。結(jié)果表明,潛在靶標(biāo)與23個MFs、84個BPs和17個CCs密切相關(guān)。MFs的結(jié)果顯示,這15個潛在靶標(biāo)主要與各種蛋白質(zhì)的結(jié)合相關(guān)。BPs的結(jié)果顯示,這15個潛在靶標(biāo)主要與細(xì)胞凋亡、pri-miRNA轉(zhuǎn)錄等生物過程相關(guān)。CCs主要富集在細(xì)胞體、轉(zhuǎn)錄抑制器復(fù)合體、細(xì)胞質(zhì)、微管組織(中心)、受體復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、核膜、線粒體、軸突等細(xì)胞組分中。使用DAVID數(shù)據(jù)庫對15個潛在靶標(biāo)進(jìn)行KEGG信號通路富集分析發(fā)現(xiàn),這15個潛在靶標(biāo)主要富集在黑色素瘤相關(guān)通路、癌癥通路、PI3K/AKT信號通路和MAPK信號傳導(dǎo)通路(圖3D)等通路中。

A:MF富集分析;B:BP富集分析;C:CC富集分析;D:KEGG通路富集分析

2.2 qRT-PCR結(jié)果

2.2.1 抑制胃癌細(xì)胞的增殖

結(jié)果顯示,與對照組比較,隨著鬼臼毒素濃度增加,各加藥組的AGS細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05),且呈濃度依賴性,提示鬼臼毒素對AGS細(xì)胞的增殖具有顯著抑制作用。并且鬼臼毒素處理胃癌細(xì)胞AGS的IC50的濃度為11.49 nM,見表3、圖4。

鬼臼毒素(藥物濃度,nM)

表3 鬼臼毒素對AGS細(xì)胞活性的影響

2.2.2 驗(yàn)證PI3K/AKT信號通路

為了研究與PI3K/AKT信號通路相關(guān)的基因,我們設(shè)計了7對引物,采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測對照組和鬼臼毒素加藥組各個基因的表達(dá)情況。以β-actin為內(nèi)源性對照,使用2-ΔΔCt法定量每個樣品中mRNA的相對含量。采用t檢驗(yàn)分析各組間差異。結(jié)果顯示,除CCND1外,TP53、MET、RELA、EGFR、BCL2L1、IGF1R的mRNA表達(dá)在兩組之間有差異,并且差異有顯著性(P<0.05),見表4、圖5。

Ns:not significant,*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001

表4 關(guān)鍵靶標(biāo)mRNA表達(dá)水平

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析獲得鬼臼毒素作用于胃癌的15個潛在靶標(biāo)。通路富集分析顯示,鬼臼毒素可能是通過抑制PI3K/AKT信號通路相關(guān)基因的表達(dá)抑制胃癌生長。Yu HG等的研究結(jié)果提示[7],鬼臼毒素衍生物依托泊苷對胃癌細(xì)胞的抑制作用可能是通過影響PI3K/AKT信號通路實(shí)現(xiàn)的。Zhang Y等采用SGC7901/ADR胃癌細(xì)胞系探究了鬼臼毒素衍生物依托泊苷對胃癌的作用機(jī)制,認(rèn)為它通過抑制PI3K/AKT信號通路進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[8]。2022年有學(xué)者采用HGC-27胃癌細(xì)胞和GES-1胃粘膜正常細(xì)胞探究鬼臼毒素衍生物12 c對胃癌細(xì)胞的影響,指出該化合物作用的靶標(biāo)可能是PI3K/AKT信號通路[9]。以往的研究發(fā)現(xiàn),PI3K/AKT信號通路在促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵的作用,并且鬼臼毒素對于胃癌細(xì)胞的生長抑制有劑量依賴效應(yīng)[10,11],這與我們的分析結(jié)論一致。我們通過分析發(fā)現(xiàn),潛在靶標(biāo)CCND1、TP53、MET、RELA、EGFR、BCL2L1、IGF1R均富集在這條通路,qRT-PCR結(jié)果顯示,經(jīng)鬼臼毒素處理后的TP53、RELA、EGFR、BCL2L1、IGF1R表達(dá)下調(diào)。然而CCND1和MET與該通路其他基因的受抑制程度不同,可能是這兩個基因在鬼臼毒素發(fā)揮作用的同時,被其他調(diào)控機(jī)制影響。以往的研究表明,PI3K/AKT信號通路被抑制可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12],是癌癥治療的重要靶點(diǎn)[13,14]。有研究顯示,凋亡相關(guān)通路PI3K/AKT/NF-κB信號通路軸在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[13]。PI3K/AKT信號通路已在大多數(shù)腫瘤中被發(fā)現(xiàn),并被用作藥物治療的靶標(biāo)。TP53在許多腫瘤類型中充當(dāng)腫瘤抑制劑[15],TP53可以誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯或者促使細(xì)胞凋亡[16];RELA又名NF-κB,可以通過調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化影響腫瘤微環(huán)境的組成[17],從而改變腫瘤對化療藥物的耐藥性[18];EGFR是人體內(nèi)的一類跨膜受體酪氨酸激酶,該區(qū)域的激活即磷酸化對抑制腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、腫瘤侵襲、腫瘤轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有重要意義[19];BCL2L1是細(xì)胞死亡的有效抑制劑[20];IGF1R對于腫瘤的轉(zhuǎn)化和惡性細(xì)胞的存活至關(guān)重要。文獻(xiàn)及本研究的qRT-PCR結(jié)果提示,鬼臼毒素可能在mRNA轉(zhuǎn)錄水平抑制PI3K/AKT信號通路相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而影響胃癌細(xì)胞的生長。下一步,我們將通過蛋白水平的Western Blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。