李天天,張先鈞,戴重陽(yáng),朱夢(mèng)婷,鄧章昌,蒲小燕

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部,西寧 810001)

有研究發(fā)現(xiàn),1,25-二羥維生素D3[1,25-(OH)2D3]對(duì)肺組織損傷有良好的預(yù)防和保護(hù)作用[1-4],這提示1,25-(OH)2D3可能對(duì)HAPE具有較好的防治作用。本研究通過(guò)建立HAPE雄性大鼠模型,應(yīng)用不同濃度的1,25-(OH)2D3干預(yù)大鼠。通過(guò)檢測(cè)大鼠相關(guān)指標(biāo)和肺組織中炎癥因子及關(guān)鍵基因并觀察肺組織病理學(xué)變化,探究相關(guān)干預(yù)對(duì)雄性大鼠HAPE的防治效果及可能作用機(jī)制,初步明確1,25-(OH)2D3防治HAPE的最佳濃度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠(200 g～300 g)購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào):SCXK(陜)2019-0001]。本研究經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)中所涉處理動(dòng)物的操作均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例(GB14923-2010)》要求執(zhí)行。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑

骨化三醇[1,25-(OH)2D3]軟膠囊購(gòu)自青島正大制藥有限公司;Trizol Reagent、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,IL-1β、IL-6、TNF-α檢測(cè)試劑盒,熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自日本Ta Ka Ra公司;PCR引物購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司;SOD、GSH-Px、MDA的ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物有限公司;RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beyotime公司;PVDF膜購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;β-actin、CYP27B1、VDR抗體和兔克隆抗體購(gòu)自Ab clonal公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

低溫冷凍離心機(jī)(V28R)由Dynamica公司提供,多功能酶標(biāo)儀和MyCycler PCR擴(kuò)增儀及凝膠成像系統(tǒng)由BIO-Rad公司提供,實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x由Thermo Fisher公司提供,熒光顯微鏡由Nikon公司提供,全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x由Sysmex公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥及模型建立

所有大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為7組:對(duì)照組、低氧組和5個(gè)不同濃度組(低氧+濃度0.063 μg/kg組為A組;低氧+濃度0.126 μg/kg組為B組;低氧+濃度0.189 μg/kg組為C組;低氧+濃度0.252 μg/kg組為D組;低氧+濃度0.315 μg/kg組為E組),每組15只。對(duì)照組大鼠飼養(yǎng)于青海大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房;將骨化三醇軟膠囊溶解于丙二醇、乙醇和水的混合溶劑中(60,10,30;V,V,V)[5]灌胃,1次/d,連續(xù)5 d;低氧組和5個(gè)濃度組大鼠置于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心低壓氧艙(模擬海拔6 000 m,低氧脅迫48 h),構(gòu)建HAPE大鼠模型,隨后降至海拔3 500 m進(jìn)行生理指標(biāo)的檢測(cè),并從腹主動(dòng)脈采血。實(shí)驗(yàn)期間,大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境均達(dá)到如下要求:SPF環(huán)境,溫度為18℃～26℃,相對(duì)濕度為40%～60%,自由攝食及飲水(飲水瓶的瓶口加鋼珠)。出低壓氧艙時(shí)麻醉處死大鼠,于無(wú)菌條件下解剖,取標(biāo)本暫存液氮,放置-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.2 大鼠PAP及血?dú)庵笜?biāo)測(cè)定

將大鼠麻醉后,切開(kāi)大鼠腹部皮膚,經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取全血1 mL,使用全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x(Sysmex)測(cè)定PaO2、SaO2。切開(kāi)頸部皮膚,分離右頸外靜脈,結(jié)扎遠(yuǎn)心端,插入導(dǎo)管,使用Power Lab生理記錄儀觀察PAP波形的變化,并通過(guò)壓力傳感器收集PAP。

1.2.3 大鼠肺組織含水量(LWC)測(cè)定

麻醉處死大鼠后,取出左肺上葉組織,用生理鹽水沖洗兩遍,用無(wú)菌濾紙吸干表面水分后置于電子天平稱(chēng)濕重[W(g)],用恒溫烘干箱(55℃)烘干(72 h)稱(chēng)重[D(g)]。LWC百分比按Elliott計(jì)算[6],計(jì)算得出肺組織含水量公式:LWC(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.4 大鼠肺組織病理學(xué)變化觀測(cè)

取右下肺尖處肺組織(約5 mm×5 mm×5 mm大小),用預(yù)冷的生理鹽水洗凈血液,在4℃的4%多聚甲醛溶液中固定48 h,使組織充分展開(kāi)。用常規(guī)方法制片。選擇三個(gè)視野采集顯微圖像,觀察肺組織的組織病理學(xué)變化。

1.2.5 大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平檢測(cè)

用ELISA法檢測(cè)大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平。取大鼠右上肺組織稱(chēng)重后放入研磨器中勻漿,低溫離心10 min收集上清液,使用ELISA試劑盒測(cè)定肺組織SOD活力及GSH-Px活性和MDA的含量,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線孔和檢測(cè)孔。使用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量光密度,使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SOD活力、GSH-Px活性和MDA濃度。

1.2.6 大鼠肺組織CYP27B1、VDR、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)量檢測(cè)

用RT-PCR法檢測(cè)關(guān)鍵基因CYP27B1、VDR、IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)量。使用Trizol試劑提取肺組織總RNA,混勻并離心后取上清液,反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后采用RT-PCR法檢測(cè)肺組織中關(guān)鍵基因CYP27B1、VDR、IL-1β、IL-6、TNF -α mRNA的表達(dá)情況。按照Real-time Quality PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,使用實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x分析結(jié)果,得出各個(gè)樣本的Ct值。引物(由南京金斯瑞生物科技有限公司合成)序列見(jiàn)表1。以β-actin作內(nèi)參,采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)值。各個(gè)基因的表達(dá)值測(cè)量均重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列

1.2.7 大鼠肺組織CYP27B1、VDR的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺血流動(dòng)力學(xué)和血?dú)庾兓闆r

與對(duì)照組比,低氧組及A、B、C、E組大鼠PAP升高(P<0.05),D組大鼠PAP差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低氧組及濃度由低到高組大鼠SaO2、PaO2呈降低趨勢(shì)(P<0.05)。與低氧組比,濃度由低到高組大鼠PAP呈降低趨勢(shì)(P<0.05),其中D組明顯降低(P<0.05);SaO2、PaO2呈升高趨勢(shì)(P<0.05),其中D組明顯升高(P<0.05)。各濃度組間相比有差異。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠PAP、PaO2及SaO2水平變化情況

2.2 各組大鼠肺組織LWC

與對(duì)照組比,低氧組及濃度由低到高組大鼠LWC升高(P<0.05),經(jīng)1,25-(OH)2D3干預(yù)后,與低氧組比,濃度由低到高組大鼠LWC呈降低趨勢(shì)(P<0.05),其中D組明顯降低(P<0.05),各濃度組間有差異。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠肺組織

2.3 各組大鼠肺組織病理學(xué)變化情況

對(duì)照組大鼠的肺組織形態(tài)在光鏡下顯示結(jié)構(gòu)正常:肺泡腔結(jié)構(gòu)完整,未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)水腫現(xiàn)象(圖1 A);低氧組大鼠肺組織出現(xiàn)缺氧性肺水腫現(xiàn)象,肺組織結(jié)構(gòu)破壞,肺泡間隔增寬,紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B)。A、B組大鼠肺組織有輕度肺泡塌陷水腫現(xiàn)象,部分肺組織結(jié)構(gòu)受損,伴有少量紅細(xì)胞與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C、D);C、D、E組大鼠肺組織水腫減輕,肺泡結(jié)構(gòu)趨于完整,紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞減少,其中D組改善最為顯著(圖1E、F、G)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色(400×)

2.4 各組大鼠肺組織氧化應(yīng)激生化指標(biāo)

與對(duì)照組比,低氧組大鼠SOD、GSH-Px降低(P<0.05),A、B、C、E組大鼠SOD降低(P<0.05),D組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),各濃度組大鼠GSH-Px降低(P<0.05),低氧組及各濃度組大鼠MDA升高(P<0.05)。與低氧組比,各濃度組大鼠SOD、GSH-Px升高(P<0.05),A組大鼠MDA差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),B、C、D、E組降低(P<0.05)。各濃度組間有差異。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠肺組織中SOD、GSH-Px、MDA含量變化情況

2.5 1,25-(OH)2D3對(duì)HAPE大鼠肺組織中的CYP27B1、VDR蛋白表達(dá)量的影響情況

與對(duì)照組比,低氧組CYP27B1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與低氧組比,各濃度組CYP27B1蛋白表達(dá)水平呈降低趨勢(shì)(P<0.05),其中C組明顯降低(P<0.05)。與對(duì)照組比,低氧組VDR蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),各濃度組VDR蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),其中C組升高明顯(P<0.05)。與低氧組比,各濃度組VDR蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05),其中C組升高明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖2、表5。

A:對(duì)照組,B:低氧組,C:A組,D:B組,E:C組,F:D組,G:E組

表5 各組大鼠肺組織中CYP27B1、VDR蛋白表達(dá)含量

2.6 1,25-(OH)2D3對(duì)HAPE大鼠肺組織中的CYP27B1、VDR及IL-1β、IL-6、TNF -α mRNA表達(dá)的影響情況

與對(duì)照組比,低氧組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)升高(P<0.05),CYP27B1、VDR mRNA表達(dá)升高(P<0.05),A、C、E組CYP27B1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05),B、D組CYP27B1 mRNA的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),各濃度組大鼠VDR mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。與低氧組比,各濃度組大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α、CYP27B1 mRNA表達(dá)降低(P<0.05),VDR mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。各濃度組間有差異。見(jiàn)表6、7。

表6 各組大鼠肺組織CYP27B1、VDR mRNA相對(duì)表達(dá)量

表7 各組大鼠肺組織IL-1β、IL-6、TNF -α mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn),1,25-(OH)2D3可明顯減輕低壓低氧所致的肺組織損傷。本研究結(jié)果顯示,1,25-(OH)2D3能夠顯著提高雄性大鼠肺組織中的SOD和GSH-Px活性,降低MDA含量,提示1,25-(OH)2D3可能通過(guò)其抗氧化應(yīng)激作用發(fā)揮對(duì)低氧脅迫所致大鼠肺損傷的保護(hù)作用。IL-1β、IL-6、TNF-α作為主要的促炎因子,在誘導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷中發(fā)揮重要作用,其活性的高低可以反映機(jī)體的炎癥損傷情況[7-9]。本研究發(fā)現(xiàn),1,25-(OH)2D3可使雄性大鼠肺組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平顯著降低,炎癥反應(yīng)被抑制。綜上所述,1,25-(OH)2D3對(duì)雄性大鼠HAPE具有較好的防治效果。

1,25-(OH)2D3的免疫調(diào)節(jié)作用依賴(lài)于25-(OH)D3的激活并與特定組織中的VDR 結(jié)合[10]。CYP27B1是調(diào)控1,25-(OH)2D3生成的關(guān)鍵基因,負(fù)責(zé)將25-(OH)D3轉(zhuǎn)化為1,25-(OH)2D3[11]。研究證實(shí),1,25-(OH)2D3和VDR通過(guò)負(fù)反饋機(jī)制調(diào)節(jié)CYP27B1水平[12-13]。本研究探究了各組大鼠肺組織CYP27B1和VDR的變化,結(jié)果顯示,低氧組大鼠肺組織CYP27B1 mRNA和蛋白水平顯著升高,VDR mRNA和蛋白水平顯著降低,1,25-(OH)2D3可下調(diào)CYP27B1、上調(diào)VDR,從而減輕炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)致大鼠HAPE得以緩解。提示1,25-(OH)2D3通過(guò)調(diào)控CYP27B1、VDR的表達(dá),發(fā)揮對(duì)HAPE的防治作用。

綜上所述,1,25-(OH)2D3可降低低氧環(huán)境下雄性大鼠肺組織LWC,減輕肺組織損傷,通過(guò)下調(diào)CYP27B1、上調(diào)VDR抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,降低氧化應(yīng)激水平,有效預(yù)防大鼠HAPE的發(fā)生;初步確定了預(yù)防大鼠HAPE的最佳濃度為0.252 μg/kg。