基于網(wǎng)絡藥理學方法和分子對接技術探究六君二陳解毒湯治療非小細胞肺癌的潛在作用機制Δ

楊文珂,趙玉榮,王 強,馬莉娉,蘇占海,董秋霞,馬雪曼*

(1.青海大學醫(yī)學部,西寧 810001;2.青海紅十字醫(yī)院,西寧 810000)

有研究認為,六君二陳解毒湯降低了肺腺癌小鼠肺部轉移率[1],但未被廣泛認同。本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法和分子對接技術開展相關研究。

網(wǎng)絡藥理學為探索藥物與疾病之間的關系提供了一種新的策略,與中醫(yī)整體觀念、辨證論治的基本思想不謀而合[2]。分子對接技術是一種研究分子(如小分子配體和生物大分子)之間的相互作用并預測其結合模式和親和力的理論模擬方法[3]。基于網(wǎng)絡藥理學方法和分子對接技術研究傳統(tǒng)中藥的潛在藥理機制是一種可靠的研究方法。因此,本研究構建六君二陳解毒湯的網(wǎng)絡藥理模型,用以系統(tǒng)分析六君二陳解毒湯治療非小細胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)的潛在作用機制,并運用分子對接技術驗證預測結果。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 數(shù)據(jù)庫

所選數(shù)據(jù)庫(網(wǎng)址)包括TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、Uniport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)、OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org)、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org/)、STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)、DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)、Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)、RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)、PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.1.2 軟件工具

軟件工具包括Venny(2.1)在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)、微生信在線工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)和Cytoscape Version(3.9.2)、AutoDock(1.5.6)軟件和PYMOL軟件。

1.2 方法

1.2.1 網(wǎng)絡藥理學方法

1.2.1.1 六君二陳解毒湯藥物活性成分及靶點篩選

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索黨參、白術、陳皮、甘草、茯苓、半夏、土茯苓和半枝蓮的活性成分并進行篩選,設置篩選條件為口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug-likeness,DL)≥0.18,并將篩選獲得的活性成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫預測靶點。使用Uniport數(shù)據(jù)庫對預測得到的靶點信息進行標準化,轉換為相應靶點名稱,得到藥物活性成分靶點。

1.2.1.2 NSCLC相關靶點篩選

以“non-small cell lung cancer”為關鍵詞,在GeneCards、OMIM、PharmGKB數(shù)據(jù)庫檢索,收集NSCLC相關作用靶點。GeneCards數(shù)據(jù)庫中的疾病靶點篩選標準為得分≥10。對收集到的疾病數(shù)據(jù)庫中的靶點進行匯總,并去除重復值,獲得與NSCLC相關的靶點。

1.2.1.3 “中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡構建

使用Venny(2.1)在線工具來確定六君二陳解毒湯和NSCLC的交點,并建立韋恩圖。采用Cytoscape Version(3.9.2)軟件對“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡進行可視化。網(wǎng)絡圖中的節(jié)點為藥物名稱、活性成分、基因靶點。

1.2.1.4 蛋白質-蛋白質互作(protein-protein Interaction,PPI)網(wǎng)絡構建

將1.2.1.3獲得的交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫,建立PPI網(wǎng)絡。物種類型設置為“Homo sapiens”,最高置信度設置為“0.900”,隱藏游離節(jié)點,其他參數(shù)保持為默認,獲取PPI網(wǎng)絡并保存為TSV文件格式。將獲取的數(shù)據(jù)輸入Cytoscape Version(3.9.2)軟件進行可視化處理。

1.2.1.5 聚類分析

本研究通過MCODE插件對六君二陳解毒湯-疾病-靶點進行聚類分析,運用Cytoscape Version(3.9.2)軟件對聚類分析結果進行可視化處理。

1.2.1.6 GO生物功能和KEGG通路富集分析

本研究利用DAVID數(shù)據(jù)庫對PPI網(wǎng)絡中的靶點進行GO生物功能和KEGG通路富集分析,并使用微生信在線工具對GO生物功能和KEGG通路富集分析結果進行可視化處理,繪制氣泡圖。

1.2.1.7 核心基因靶點表達水平與NSCLC患者預后的相關性分析

運用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行生存分析,按中位數(shù)分組,其他選項均選擇默認設置,觀察得到該靶點生存曲線的風險比(HR)、95%的置信區(qū)間(CI)和對數(shù)等級P。

1.2.2 分子對接技術

選取六君二陳解毒湯的主要活性成分與核心靶點進行分子對接。從PDB數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點的3D結構,其PDB ID見表1。從TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載化合物結構,并保存為mol2格式。靶點蛋白去水除配體的操作由PYMOL軟件完成,活性成分及靶點蛋白加氫、加電荷的操作由AutoDock1.5.6軟件完成,再運行Auto dockvina軟件進行分子對接驗證,使用PYMOL軟件將對接結果進行可視化處理[4]。

表1 目標蛋白PDB ID

2 結果

2.1 網(wǎng)絡藥理學預測結果

2.1.1 六君二陳解毒湯活性成分的收集和篩選

檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫得到六君二陳解毒湯所有活性成分及相關靶點,篩選后共收集到198個藥物活性成分,其中白術7個、半夏13個、半枝蓮29個、陳皮6個、黨參21個、茯苓15個、土茯苓15個、甘草92個。去除無效和重復成分后得到968個潛在作用靶點,其中白術19個、半夏90個、半枝蓮223個、陳皮68個、黨參109個、茯苓24個、土茯苓205個、甘草230個。采用Cytoscape Version(3.9.2)軟件分析六君二陳解毒湯藥物活性成分,Degree值居于前十位的活性成分見表2。

2.1.2 NSCLC的疾病靶點篩選

在GeneCards、OMIM、PharmGKB數(shù)據(jù)庫中以“non-small cell lung cancer”為關鍵詞進行篩選,分別獲得766、439、305個NSCLC相關靶點,在GeneCards數(shù)據(jù)庫中,以Score≥10為疾病靶點篩選條件獲得374個NSCLC相關靶點。合并3個疾病數(shù)據(jù)庫靶點并剔除重復靶點,共獲得1 093個與NSCLC相關的靶點,使用Venny(2.1)在線工具繪制韋恩圖(圖1)并分析,得到12個藥物活性成分與NSCLC疾病的共同靶點。

圖1 韋恩圖

2.1.3 “中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡構建

“中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡圖(圖2)中共包括23個節(jié)點、22條邊。藥物活性成分節(jié)點圖標越大表明其活性成分作用越大、節(jié)點越大表明藥物對該靶點作用越大。

圓形代表藥物成分,菱形代表藥物靶點,四邊形代表藥物名稱

2.1.4 PPI網(wǎng)絡構建與分析

去除游離靶蛋白后,六君二陳解毒湯治療NSCLC的PPI網(wǎng)絡見圖3。該PPI網(wǎng)絡共有10個節(jié)點和24條邊。節(jié)點越大代表靶蛋白度值越大;邊數(shù)連接的越多代表節(jié)點靶蛋白在網(wǎng)絡中與其他靶蛋白的聯(lián)系越多。

圖3 PPI網(wǎng)絡圖

拓撲學分析結果如表3所示,共有10個作用靶點(EGFR、CAV1、PTEN、MCL1、CASP8、MET、RASA1、VCAM1、PARK2、IRF1)與治療NSCLC密切相關。其中,Degree值排名前五位的作用靶點分別為EGFR、PTEN、CAV1、MCL1、CASP8。這些靶點在PPI網(wǎng)絡中占據(jù)重要地位,與網(wǎng)絡中的其他靶點密切相關。

表3 拓撲學分析結果

2.1.5 聚類分析

通過MCODE插件進行聚類分析后得到1個具有相似功能的子簇,涉及8個核心靶點,具體見圖4、表4。

圖4 聚類分析圖

表4 聚類分析表

2.1.6 富集分析

2.1.6.1 GO生物功能富集分析

為進一步明確六君二陳解毒湯的核心生物學功能,使用DAVID數(shù)據(jù)庫對10個核心靶點的生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和細胞組成(cell component,CC)等方面進行GO分析。在P<0.05的情況下,共得到69個GO條目,包括39個BP條目、13個MF條目和17個CC條目。BP條目共有39個,主要集中在下調細胞凋亡過程(negative regulation of apoptotic process)等方面;MF條目共有13個,主要涉及蛋白激酶結合(protein kinase binding)等;細胞組成(CC)相關條目有17個,主要有細胞溶質(cytoso)、細胞膜(plasma membrane)、細胞質(cytoplasm)。GO生物功能富集分析條帶圖見圖5。

圖5 GO生物功能富集分析條帶圖

2.1.6.2 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集的分析結果顯示了23個核心靶點的信號通路條目。六君二陳解毒湯治療NSCLC主要涉及FAK信號通路(Focal adhesion)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、微小核糖核酸信號通路(MicroRNAs in cancer)等信號通路。KEGG功能富集分析氣泡圖見圖6。

圖6 KEGG功能富集分析氣泡圖

2.1.7 潛在治療靶點相關靶點對NSCLC患者預后的分析

NSCLC患者生存分析曲線由Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫生成,患者按中位數(shù)分組,其他參數(shù)均選擇默認參數(shù)。圖7顯示,EGFR、CAV1、PTEN、MCL1、MET、RASA1、VCAM1表達與NSCLC患者總生存期(Overall survival,OS)相關(P<0.05)。其中,MCL1靶點低表達患者生存期明顯高于高表達患者(P<0.05);EGFR、CAV1、PTEN、MET、RASA1、VCAM1靶點高表達患者生存期明顯高于低表達患者(P<0.05);CASP8、PARK2、IRF1靶點表達與患者OS無關(P>0.05)。

x軸代表時間,y軸代表生存可能性

2.2 分子對接驗證結果

將六君二陳解毒湯的5個主要成分(槲皮素、柚皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黃芩苷)與核心靶點(EGFR、PTEN、CAV1、MCL1、CASP8、MET、RASA1、PARK2)逐一進行分子對接,六君二陳解毒湯活性成分與核心靶點結合能熱圖見圖8。結合能越小,說明成分和靶點之間的結合越穩(wěn)定,β-谷甾醇與MCL1、MET、EGFR對接示意圖見圖9。通過上述所得,槲皮素、柚皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黃芩苷與核心靶點EGFR、CAV1、MCL1、MET、RASA1均有較為穩(wěn)定的結合。其中,β-谷甾醇與核心靶點MCL1、MET、EGFR結合者的能量較低,分別為-4.33、-4.2、-3.94 kJ/mol。

圖8 六君二陳解毒湯活性成分與核心靶點結合能熱圖

圖9 β-谷甾醇與MCL1、MET、EGFR對接示意圖

3 討論

本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法預測了六君二陳解毒湯治療NSCLC的主要有效藥物活性成分和核心靶點,并通過分子對接技術得出主要有效藥物活性成分與核心靶點的結合能力,驗證網(wǎng)絡藥理學方法預測出的結果,進一步探究六君二陳解毒湯治療NSCLC的作用機制。

本研究通過對六君二陳解毒湯的藥物活性成分篩選分析發(fā)現(xiàn),槲皮素、柚皮素、β-谷甾醇等可能是六君二陳解毒湯治療NSCLC的主要活性成分。有研究表明,槲皮素可以調節(jié)SIRT1/AMPK信號通路誘導NSCLC細胞系自噬和凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用[5]。柚皮素能夠減少基質金屬蛋白酶-2(MMP2)和基質金屬蛋白酶-9(MMP9)表達,抑制磷酸激酶B(AKT)的活性,降低腫瘤細胞的侵襲和遷移能力,減緩肺癌增殖進程[6]。β-谷甾醇可以阻滯肺癌A549細胞周期,抑制腫瘤細胞的增殖,同時促進細胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。此外,β-谷甾醇通過下調硫氧還蛋白(Trx)/硫氧還蛋白還原酶(TrxR1)信號通路引起NSCLC細胞中的ROS依賴性細胞凋亡[8]。上述研究表明,六君二陳解毒湯通過多種藥物活性成分發(fā)揮治療NSCLC作用。

本研究通過PPI分析發(fā)現(xiàn),EGFR、PTEN、CAV1等靶點可能是治療NSCLC的核心靶點。EGFR是刺激DNA合成和影響細胞增殖、轉移、侵襲的主要驅動因素[9]。其主要通過EGFR-Ras/Raf/MEK/ERK和EGFR-PI3K/AKT通路增加腫瘤細胞增殖和遷移。此外,EGFR還能夠定位于細胞核以促進細胞增殖,同時還能刺激多種促進癌癥侵襲和轉移的基質金屬蛋白酶發(fā)揮促進腫瘤生長和轉移的作用[10]。PTEN可以調節(jié)腫瘤微環(huán)境,抑制細胞外基質重塑,促進腫瘤細胞的侵襲和轉移[11-12]。此外,PTEN還能夠負向調節(jié)PTEN/PI3K/Akt通路,調控細胞生長、凋亡和遷移[13-14]。在高分化的NSCLC腫瘤中,高達70%的PTEN蛋白表達下調與PI3K/AKT通路激活有關[15-16]。CAV1參與多種腫瘤相關的生物學過程,包括細胞遷移侵襲、細胞轉化、血管生成等[17]。CAV1的表達量與肺癌細胞的增殖呈正相關,CAV1表達下調可以阻滯細胞周期來抑制肺癌細胞的增殖[18]。研究表明,MCL1在癌細胞中的過表達會破壞抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之間的平衡,從而阻止癌細胞發(fā)生凋亡,導致惡性增殖[19]。此外,MCL1的PEST結構域與PH結構域上的AKT相互作用以激活AKT,共同促進肺癌進展[20]。上述研究表明,六君二陳解毒湯作用于多靶點發(fā)揮治療NSCLC作用。

本研究對六君二陳解毒湯治療NSCLC進行GO生物功能和KEGG通路富集分析,結果顯示NSCLC的發(fā)生發(fā)展主要與細胞凋亡,RNA聚合酶II啟動子的轉錄,FAK、PI3K-Akt信號通路調控有關。六君二陳解毒湯可能通過下調細胞凋亡過程,上調RNA聚合酶II啟動子的轉錄,調控細胞FAK、PI3K-Akt信號通路發(fā)揮治療NSCLC的作用。有研究表明,在一些惡性腫瘤中,FAK被激活而過度表達[21]。靶向FAK激酶結構域的小分子抑制劑(如PF-573,228)現(xiàn)已被開發(fā)為對NSCLC等癌癥的靶向治療方法[22-23]。PI3K/Akt信號通路與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關。激活PI3K/Akt信號通路可抑制細胞凋亡,促進腫瘤血管生成及腫瘤組織的侵襲和轉移[24]。上述研究表明,六君二陳解毒湯治療NSCLC是通過多條通路發(fā)揮治療作用的。

本研究采用Kaplan-Meier-Plotter數(shù)據(jù)庫分析了六君二陳解毒湯作用于NSCLC核心靶點的生存曲線。結果表明,六君二陳解毒湯可能是通過降低EGFR、CAV1、PTEN、MET、RASA1、VCAM1基因表達,增加MCL1基因表達發(fā)揮抗腫瘤作用。有研究表明,40%至80%的NSCLC預后不良患者與EGFR過度表達有關[25]。EGFR突變主要是外顯子19的缺失,外顯子21、密碼子858的亮氨酸替代精氨酸的點造成[26]。MCL1的過表達與腫瘤預后不良和耐藥性增強密切相關。MCL1 mRNA或蛋白的表達與多種癌癥類型的腫瘤進展和患者不良結局有關。有研究發(fā)現(xiàn),MCL1的擴增可影響中國南方人群中NSCLC患者的OS[27]。在人NSCLC細胞的一個亞群中發(fā)現(xiàn)MCL1的過表達[28]。高水平的MCL1可以保護肺癌細胞,避免各種促凋亡行為刺激誘導肺癌細胞死亡[29]。上述研究表明,六君二陳解毒湯可以通過多靶點改善NSCLC患者的預后。

本研究基于分子對接技術驗證六君二陳解毒湯的主要藥物活性成分槲皮素、柚皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黃芩苷與核心靶點EGFR、MCL1、MET、RASA1、PARK2之間的相互作用。當結合能小于0時,表明配體與受體可以自行結合。結合能越低,氫鍵數(shù)量越多,結合就越穩(wěn)定,疾病靶點與藥物活性成分作用的可能性就越大。對接結果表明,β-谷甾醇能夠作用于MCL1而促進細胞凋亡,抑制腫瘤生長。驗證了網(wǎng)絡藥理學預測六君二陳解毒湯藥物活性成分作用于NSCLC靶點的可行性。

本研究結果顯示,六君二陳解毒湯以多成分-多靶點-多通路的方式在NSCLC中發(fā)揮治療作用。