青?，敹嗟貐^(qū)藏族學(xué)齡肥胖兒童糞便非靶向代謝組學(xué)分析※

艾麗孜熱·艾尼瓦爾,馬 燕,2,閆 馨,吳子怡,杜文琪#

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生系,西寧 810001;2.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心,西寧 810001)

肥胖是目前威脅人類健康的疾病之一,它可導(dǎo)致相關(guān)并發(fā)癥,如胰島素抵抗(Insulin resistance,IR)、非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver diseases,NAFLD)和2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)等[1,2]。在全球范圍內(nèi),肥胖的患病率呈上升趨勢(shì)[3]。目前我國(guó)最新的流行病學(xué)調(diào)查顯示學(xué)齡兒童肥胖的患病率存在地理差異,高海拔地區(qū)肥胖的患病率明顯低于平原地區(qū),但在高海拔地區(qū)肥胖的發(fā)生率較高。因此,明確不同地域肥胖的發(fā)生機(jī)制,有助于預(yù)防和控制我國(guó)學(xué)齡兒童超重和肥胖現(xiàn)狀。故本研究采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)對(duì)青?，敹嗟貐^(qū)藏族兒童的糞代謝物進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)檢測(cè),為高海拔地區(qū)藏族兒童肥胖發(fā)生機(jī)制研究提供研究思路。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選取青海省瑪多縣(海拔4 300 m)7～12歲藏族兒童作為研究對(duì)象。按照相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]將研究對(duì)象分為肥胖組和正常體質(zhì)量組;通過(guò)分層整群抽樣法選擇12名藏族肥胖兒童(HOB:High-altitude obesity),并匹配12名正常體質(zhì)量藏族兒童(HN:High altitude normal)。采用病例-對(duì)照研究法,分別采集兩組研究對(duì)象的糞便樣品作為檢測(cè)樣本。所納入的兒童均為寄宿生,有相同的膳食結(jié)構(gòu)。納入的研究對(duì)象在糞便采集前食用2周的標(biāo)準(zhǔn)飲食。兩組研究對(duì)象的年齡和身高無(wú)明顯差異,體質(zhì)量和身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)在兩組間存在顯著性差異(P<0.01),詳見(jiàn)表 1。

表1 兩組研究對(duì)象一般情況

兒童監(jiān)護(hù)人同意參加本研究并簽署相關(guān)知情同意書(shū)。本實(shí)驗(yàn)所涉及的人群研究獲青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑選擇

質(zhì)譜儀(Q ExactiveTMHF,Thermo Fisher)、色譜儀(Vanquish UHPLC,Thermo Fisher)、低溫離心機(jī)(D3024R,Scilogex);甲醇(A456-4,Thermo Fisher)、甲酸(A117-50,Thermo Fisher)、醋酸銨(A114-50,Thermo Fisher)。

1.2.2 樣本采集與制備

使用一次性糞便采樣盒收集新鮮糞便200 mg放入3 mL保存液中混勻,置-80℃冰箱保存。樣品制備:(1)取100 μL樣本置EP管中,加入400 μL 80%甲醇水溶液;(2)渦旋振蕩,靜置(冰浴)5 min后離心(15 000 g,4℃,20 min);(3)取一定量的上清加超純水稀釋至甲醇含量為53%;(4)離心(15 000 g,4℃,20 min)后收集上清,應(yīng)用 LC-MS 技術(shù)進(jìn)行分析[5,6]。用兩組樣本提取液等量混合配制QC樣本進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2.3 色譜柱及質(zhì)譜條件設(shè)定

色譜柱為Hypesil Gold column色譜柱(C18,100 mm×2.1 mm,1.9 μm,Thermo Fisher)。正離子檢測(cè)模式下,流動(dòng)相A:甲醇,流動(dòng)相B:0.1%甲酸水溶液;負(fù)離子檢測(cè)模式下,流動(dòng)相A:甲醇,流動(dòng)相B:5 mM醋酸銨水溶液(pH 9.0)。梯度洗脫:0～1.5 min,2% A;1.5～3.0 min,2%～85% A;3～10 min,85%～100% A;10.0～10.1 min,100%～2% A;10.1～12.0 min,2% A。柱溫:40℃;流速:0.2 mL/min。質(zhì)譜條件:噴霧電壓為3.5 KV;鞘氣流速為35 psi;輔助氣流速為10 L/min;離子傳輸管溫度為320℃;離子導(dǎo)入射頻電平為60;輔助氣加熱器溫度為350℃;一級(jí)分辨率為60 000;二級(jí)分辨率為15 000;掃描范圍為100～1500。二級(jí)掃描為數(shù)據(jù)依賴性掃描(DDA,data dependent scans)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

將數(shù)據(jù)(.raw)文件導(dǎo)入搜庫(kù)軟件(Compound Discoverer 3.1,簡(jiǎn)稱CD 3.1)進(jìn)行預(yù)處理及代謝物鑒定。采用公共數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG、HMDB和LIPID Maps數(shù)據(jù)庫(kù))對(duì)鑒定的代謝物進(jìn)行注釋。使用SIMCA14.1軟件進(jìn)行PCA、OPLS-DA分析,得到每個(gè)代謝物的VIP值。用MetaboAnalyst5.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來(lái)判斷統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,并計(jì)算代謝物在兩組間的FC值。篩選差異代謝物的默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)為VIP>1、P<0.05且FC≥2或FC≤0.5[7,8]。應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異代謝物進(jìn)行通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 青?，敹嗟貐^(qū)藏族肥胖兒童糞便代謝輪廓分析

圖1(聚類熱圖)直觀展現(xiàn)了所有樣本的聚集性,表明組內(nèi)樣本較聚集。通過(guò)PCA、OPLS-DA分析法,在整體水平上對(duì)代謝物的組間差異進(jìn)行可視化分析,各組樣本代謝物在組內(nèi)的分布是均勻的,在組間的分布存在差異。

圖1 正離子模式(左圖)和負(fù)離子模式(右圖)糞便樣本的層次聚類

OPLS-DA模型顯示,左圖:R2Y=0.981,R2X=0.278,Q2=0.820;右圖:R2Y=0.964,R2X=0.292,Q2=0.838。R2>Q2,說(shuō)明模型不存在過(guò)擬合。代謝物在正負(fù)離子模式下都有一定的差異,提示糞代謝樣本存在代謝差異。圖2、圖3顯示,樣本存在離群情況,這可能與樣本量及糞便質(zhì)量等因素相關(guān)。

圖2 正負(fù)離子模式下PCA得分圖

圖3 正負(fù)離子模式下OPLSDA得分圖

2.2 差異代謝物篩選

通過(guò)KEGG、HMDB、Lipid Maps數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)代謝物進(jìn)行定性、定量分析。從數(shù)量上看,兩組樣本(HN、HOB)在正離子模式下篩選出927個(gè)代謝產(chǎn)物,在負(fù)離子模式下篩選出554個(gè)代謝產(chǎn)物。HN與HOB組在正離子模式下篩選出差異代謝物20個(gè),其中5個(gè)代謝物上調(diào)、15個(gè)代謝物下調(diào);在負(fù)離子模式下篩選出差異代謝物14個(gè),其中11個(gè)代謝物上調(diào)、3個(gè)代謝物下調(diào)。見(jiàn)表2。

表2 正負(fù)離子模式下差異代謝物及上下調(diào)個(gè)數(shù)

表3 正負(fù)離子模式FC值>2的顯著差異代謝物

2.3 相關(guān)代謝途徑富集分析

圖4 差異代謝物富集通路

表4 顯著富集通路

3 討論

本研究?jī)山M研究對(duì)象的PCA及OPLS-DA結(jié)果顯示,兩組樣本組內(nèi)分布均勻,組間存在一定差異。結(jié)果顯示,大部分化合物以脂質(zhì)分子為主,其脂質(zhì)分子占比呈現(xiàn)增高趨勢(shì),結(jié)論與大部分的肥胖研究結(jié)果一致[9]。具體哪一類脂質(zhì)分子起到關(guān)鍵性的生物標(biāo)志物作用需要進(jìn)一步研究闡明。

根據(jù)FC值對(duì)差異代謝物進(jìn)一步篩選,貢獻(xiàn)較大的代謝產(chǎn)物有6個(gè)脂質(zhì)化合物、2個(gè)有機(jī)酸類化合物、4個(gè)苯環(huán)及類苯環(huán)化合物,它們的占比均表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì),其中α-酮戊二酸、檸檬酸作為三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物,與糖、脂肪分解及能量產(chǎn)生密切相關(guān)[10]。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,葉酸碳庫(kù)代謝,檸檬酸鹽循環(huán)代謝,乙醛酸和二羧酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路顯著富集(P<0.05)。檸檬酸循環(huán)代謝物被認(rèn)為是細(xì)胞代謝的主要副產(chǎn)物,對(duì)核苷酸、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等大分子的生物合成很重要[11]。檸檬酸鹽循環(huán)的分析機(jī)制:通過(guò)丙酮酸脫羧酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化為線粒體OAA和谷氨酰胺,谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸,隨后轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸。當(dāng)α-酮戊二酸水平下降時(shí),檸檬酸鹽從線粒體輸入到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行脂質(zhì)合成。本研究中,α-酮戊二酸含量上升,影響了脂質(zhì)從頭合成機(jī)制。另外一些檸檬酸鹽循環(huán)中間體的產(chǎn)生可以通過(guò)谷氨酰胺依賴性還原羧化的過(guò)程來(lái)維持,在該途徑中,通過(guò)NADPH依賴性異檸檬酸脫氫酶2(IDH2)和烏頭酸酶(ACO)催化兩個(gè)后續(xù)反應(yīng),從谷氨酰胺衍生的α-酮戊二酸產(chǎn)生檸檬酸鹽[12]。還有研究表明,α-酮戊二酸、富馬酸、草酰乙酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸等作為三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物,與糖、脂肪分解及能量產(chǎn)生密切相關(guān)[10]。其中α-酮戊二酸是決定三羧酸循環(huán)總體速率的關(guān)鍵分子[13]。三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝存在一定的交互關(guān)系,三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物如草酰乙酸、α-酮戊二酸分別是天冬氨酸和谷氨酸的前體。丙酮酸在胰腺導(dǎo)管腺癌中與葡萄糖和谷氨酰胺衍生的碳競(jìng)爭(zhēng),為三羧酸循環(huán)提供燃料[14]。谷氨酸被谷氨酸脫氫酶或谷草轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化為三羧酸循環(huán)中間物α-酮戊二酸[15]。谷氨酸是氨基酸能量代謝途徑的一種底物,可經(jīng)由谷氨酰胺途徑在谷氨酰胺酶的作用下生成,并能通過(guò)生成α-酮戊二酸進(jìn)入三羧酸循環(huán),獨(dú)立于葡萄糖為三羧酸循環(huán)供能[16]。本研究的代謝通路也涉及檸檬酸循環(huán)代謝,乙醛酸、二羧酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝,是通過(guò)影響脂質(zhì)從頭合成,影響三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,來(lái)改變能量代謝。這可能與青?，敹嗟貐^(qū)學(xué)齡藏族兒童長(zhǎng)期的飲食結(jié)構(gòu)密切相關(guān),藏族家庭遵循民族傳統(tǒng)的生活方式和飲食習(xí)慣,每天主要攝入高脂肪、高碳水、低膳食纖維類食物,故能量攝入較其他地區(qū)多[17]。因此,我們假設(shè)瑪多地區(qū)學(xué)齡兒童肥胖發(fā)生機(jī)制也與能量代謝相關(guān)的通路密切相關(guān)。

本研究存在一定的局限性:樣本較局限;由于非靶向代謝組學(xué)無(wú)偏向性,故發(fā)現(xiàn)的差異代謝物存在一定偏差。因此,在后續(xù)研究中應(yīng)進(jìn)一步增加樣本量,并進(jìn)行靶向代謝組學(xué)研究。

綜上所述,本研究通過(guò)非靶向代謝組學(xué)方法,對(duì)青?，敹嗟貐^(qū)不同體質(zhì)量的肥胖藏族兒童的糞代謝水平進(jìn)行了分析,獲得了3種富集于檸檬酸鹽循環(huán)代謝,乙醛酸、二羧酸代謝,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝的差異代謝物葉酸、檸檬酸、α-酮戊二酸,為梳理肥胖的發(fā)病機(jī)制提供了新的思路。