朱鈞鍇，葛玲智，張超，曹璨，吳嘉惠，穆震*

1.泰安八十八醫(yī)院皮膚科，山東 泰安 271000；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚科，山東 泰安 271000

銀屑病是以鱗屑性紅斑、斑塊為特征的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病。伴隨銀屑病病程的延長(zhǎng)，患者患心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、代謝綜合征等共病的風(fēng)險(xiǎn)也大為增加，帶來極大的社會(huì)負(fù)擔(dān)［1-3］。銀屑病的發(fā)病基礎(chǔ)與遺傳、固有免疫、適應(yīng)性免疫系統(tǒng)有關(guān)，其中促炎因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)貫穿于疾病發(fā)生發(fā)展的整個(gè)階段。IFN-γ 是銀屑病發(fā)病的重要啟動(dòng)因子，TNF-α、IL-6 是參與銀屑病發(fā)生和發(fā)展的重要上游因子，這些炎癥因子在皮膚上，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化和異常表達(dá)［4-6］。隨著對(duì)自身炎癥性疾病和自身免疫性疾病相互作用研究的增多，發(fā)現(xiàn)除了免疫因素外，異常的氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷可能是另一危險(xiǎn)因素［7-12］。部分文獻(xiàn)報(bào)道銀屑病的發(fā)病存在抗氧化劑的減少和過氧化產(chǎn)物的增多，如銀屑病皮損和配對(duì)的血清樣本中發(fā)現(xiàn)SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的含量顯著降低，而MDA、一氧化氮（nitric oxide，NO）、超氧陰離子（superoxide anion，O2-）的含量升高［7］。同時(shí)，有學(xué)者指出氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物可用于評(píng)估銀屑病嚴(yán)重程度、預(yù)測(cè)治療效果和疾病的發(fā)展［13-14］。

目前，銀屑病的治療方式包括局部治療和全身治療。局部治療如糖皮質(zhì)激素、鈣調(diào)磷酸酶抑制劑常用于早期及輕度銀屑病的治療；全身治療包括免疫抑制劑如甲氨蝶呤、環(huán)孢素等常用于晚期及中重度銀屑病的治療。近年來，隨著細(xì)胞因子在銀屑病發(fā)病中地位的提升，銀屑病治療迎來了生物制劑發(fā)展的新時(shí)代，并在臨床應(yīng)用中取得了令人滿意的療效。盡管生物制劑的發(fā)展取得了巨大成就，但仍有一些問題尚未解決，如不良反應(yīng)、治療失敗、適應(yīng)癥受限及價(jià)格昂貴等。氫分子是一種新型的氣體信號(hào)分子，基礎(chǔ)和臨床研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種炎癥性疾病具有防治作用，可以用于治療皮膚病如銀屑?。?5-16］、特應(yīng)性皮炎［17］、衰老［18-19］、電擊傷［20］等。針對(duì)其顯示的治療價(jià)值，本研究通過氫分子干預(yù)以探究氫分子對(duì)銀屑病樣皮損的作用影響，以期為銀屑病的臨床治療提供經(jīng)濟(jì)、安全的輔助治療方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡Balb/c 雄性小鼠，體重18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0006，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證書編號(hào)：110011220105953464。本實(shí)驗(yàn)獲得山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器

5%咪喹莫特乳膏（imiquimod cream，IMQ）（四川明欣藥業(yè)）；氫氣呼吸機(jī)（山東淄博九辰生物科技，JC-H2-300A）；新宇宙XP-3140-H2（氫氣）檢測(cè)儀（日本）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將30 只Balb/c 小鼠背部2 cm×3 cm 區(qū)域的毛發(fā)用電動(dòng)剃毛器脫毛后，隨機(jī)分為空白組、IMQ組和干預(yù)組，每組10 只。除空白組皮損每日給予外用凡士林乳膏外，其余兩組小鼠通過涂抹IMQ 的方法構(gòu)建模型小鼠［21-22］。具體方法為背部剃毛部位涂抹5% IMQ 乳膏62.5 mg，1 次·d-1，連續(xù)給藥7 d。干預(yù)組在背部每日給予5% IMQ 乳膏30 min后，將小鼠放入密封的帶有進(jìn)氣口的玻璃樹脂箱即氫氣倉(cāng)內(nèi)，打開氫氣呼吸機(jī)，通過進(jìn)氣管通入H2，H2流速平均為300 mL·min-1，并每隔30 min 通過H2濃度檢測(cè)儀檢測(cè)箱中濃度并記錄，其平均濃度為35%，共給予氫氣4 h·d-1（上午2 h、下午2 h）。每天處理前拍照觀察并記錄小鼠背部皮膚變化，依據(jù)PASI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠背部皮損進(jìn)行評(píng)分。第8天，頸椎脫臼處死。取背部1 cm×1 cm 大小皮膚，立即4%多聚甲醛固定，常規(guī)法制備蠟塊切片，HE 染色后顯微鏡下觀察并Baker 評(píng)分；另1 cm×1 cm 皮膚置于RNA 穩(wěn)定保存液中，進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)；余背側(cè)皮膚保存在-80 ℃超低溫冰箱中，用于后續(xù)組織蛋白提取。其中，免疫組化結(jié)果、蛋白質(zhì)印跡條帶使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

參照PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)給予小鼠背部皮膚的紅斑、鱗屑、皮膚增厚的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分（0~4 分），3項(xiàng)評(píng)分累積，總計(jì)0~12分。顯微鏡下觀察切片，測(cè)量其表皮厚度，參照Baker 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估其病理?yè)p害程度。采用石蠟切片免疫組化檢測(cè)小鼠皮損中IL-6、TNF-α、IFN-γ 的表達(dá)；使用RT-qPCR 和Western blot 法分別檢測(cè)各組皮損中炎癥因子IL-6、TNF-α 和IFN-γ 的相對(duì)mRNA 水平和蛋白水平的表達(dá)，其中Actin作為檢測(cè)mRNA 水平的內(nèi)參，其他引物見表1，使用2-ΔΔCt算法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平，各引物序列見表1；應(yīng)用MDA 和CAT 試劑盒檢測(cè)皮損組織的氧化指標(biāo)MDA含量和CAT活力。

表1 RT-qPCR目標(biāo)基因的引物序列Table 1 Primers sequence of RT-qPCR target gene

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行分析。兩組間比較時(shí)，采用t檢驗(yàn)，多組間比較時(shí)，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）統(tǒng)計(jì)分析，不符合正態(tài)分布或方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 氫分子對(duì)小鼠銀屑病樣皮損形成的作用

通過IMQ 誘導(dǎo)，成功建立小鼠銀屑病模型，在此基礎(chǔ)上展開后續(xù)研究。處死前觀察其背部皮損形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)空白組小鼠背部皮膚光滑，與IMQ 組相比，干預(yù)組小鼠背部皮損處的紅斑、鱗屑及皮膚增厚程度減輕。小鼠PASI 評(píng)分結(jié)果顯示（圖1A），與IMQ 組相比，干預(yù)組小鼠背部皮損各項(xiàng)評(píng)分及總評(píng)分均顯著降低（P<0.05，圖1B）。這些結(jié)果提示氫分子可抑制小鼠銀屑病樣皮損的臨床表現(xiàn)。

圖1 氫分子對(duì)小鼠銀屑病樣皮損的形態(tài)學(xué)影響Fig. 1 Morphological effects of molecular hydrogen on psoriasis-like mice

2.2 氫分子對(duì)小鼠銀屑病樣皮損的組織病理學(xué)影響

由圖2A 可見，空白組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)清晰、完整。與空白組相比，IMQ 組小鼠皮膚病理形態(tài)與臨床中銀屑病的組織形態(tài)相似；與IMQ 組相比干預(yù)組小鼠皮膚Munro 微膿腫消失，角化過度及角化不全現(xiàn)象減輕或消失，棘層變薄，其表皮厚度、紅斑、鱗屑、炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度均減輕，組織學(xué)Baker評(píng)分降低（圖2B）。隨機(jī)測(cè)量各組小鼠皮膚表皮層的垂直厚度，每個(gè)視野5 處，如圖2C 所示，IMQ組小鼠表皮層厚度約為空白組的4~5倍（P<0.001），和IMQ 組小鼠相比，干預(yù)組小鼠皮膚表皮厚度較IMQ 組明顯變薄（P<0.001）。結(jié)果提示氫分子可改善小鼠銀屑病樣皮損的組織學(xué)表現(xiàn)。

圖2 氫分子對(duì)小鼠銀屑病樣皮損的組織病理影響Fig. 2 Histopathological effects of hydrogen molecular on psoriasis skin lesions in mice

2.3 氫分子對(duì)銀屑病樣皮損中炎癥因子IL-6、TNF-α和IFN-γ表達(dá)的影響

由免疫組化結(jié)果可以看出，與空白組相比，IMQ 組小鼠皮損的表皮層IL-6、TNF-α 和IFN-γ 表達(dá)顯著升高（圖3A），進(jìn)一步分析其光密度值（圖3B），發(fā)現(xiàn)IMQ 組小鼠皮損中IL-6、TNF-α 和IFN-γ 3 種細(xì)胞因子在表皮表達(dá)水平明顯增加（P<0.01），與IMQ組比較，干預(yù)組小鼠皮損中上述3種炎性細(xì)胞的表達(dá)均減少（P<0.05）。

2.4 氫分子對(duì)銀屑病樣皮損中炎癥因子IL-6、TNF-α和IFN-γ蛋白表達(dá)水平的影響

通過Western blot法分析銀屑病樣皮損中IL-6、TNF-α 和IFN-γ 的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)（圖4），與空白組小鼠相比，IMQ 組小鼠皮損中IL-6、TNF-α 和IFN-γ 這3 種炎癥因子的蛋白表達(dá)水平比空白組明顯升高（P<0.01），而干預(yù)組小鼠皮損中這些炎癥因子的蛋白表達(dá)水平下調(diào)（P<0.05）。

圖4 氫分子對(duì)小鼠皮損中IL-6、TNF-α和IFN-γ的蛋白水平的影響Fig. 4 Effect of hydrogen molecular on the protein levels of IL-6, TNF-α and IFN-γ in mouse skin lesions

2.5 氫分子對(duì)銀屑病樣皮損中IL-6、TNF-α和IFN-γ的mRNA表達(dá)水平的影響

通過RT-qPCR 法測(cè)定銀屑病樣皮損中IL-6、TNF-α和IFN-γ 的mRNA 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)（圖5），與空白組對(duì)比，IMQ 組小鼠皮損中這3 種細(xì)胞因子的mRNA 水平均明顯上升，約為空白組的2~3 倍（P<0.001），而氫分子干預(yù)能抑制IMQ 誘導(dǎo)的小鼠炎癥因子的mRNA 水平的表達(dá)（P<0.05）。結(jié)果提示氫分子可抑制銀屑病樣皮損中IL-6、TNF-α 和IFN-γ的mRNA表達(dá)水平，從而抑制炎癥反應(yīng)。

2.6 氫分子對(duì)小鼠皮損組織中MDA 含量、CAT活力的影響

通過MDA和CAT試劑盒測(cè)定發(fā)現(xiàn)（圖6），IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的CAT 活力下降，MDA 含量增加（P<0.01）。與IMQ 組相較，干預(yù)組小鼠皮損中CAT活力增加（P<0.05），MDA含量降低（P<0.05）。結(jié)果提示氫分子可減輕小鼠銀屑病的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖6 氫分子對(duì)小鼠銀屑病樣皮損氧化指標(biāo)的影響Fig. 6 Effect of hydrogen molecular on oxidation index of psoriatic skin lesions in mice

3 討論

銀屑病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，早期認(rèn)為其發(fā)病與角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte，KC）的異常增殖密切相關(guān)；隨著研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)銀屑病主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)［1］。在遺傳背景下，免疫細(xì)胞可通過分泌炎癥因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、IL-12、IL-17、IL-23和IL-1β等促發(fā)炎癥因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)、形成正反饋炎癥環(huán)路，促進(jìn)和維持其發(fā)病［23-24］。同時(shí)，氧化應(yīng)激也被認(rèn)為是一個(gè)易被忽視的致病因素，先前研究指出氧化應(yīng)激可通過多種途徑促進(jìn)炎癥發(fā)生，氧化應(yīng)激損傷致使體內(nèi)ROS增多，也可促進(jìn)銀屑病發(fā)?。?-8，13-14，25］。雖當(dāng)下銀屑病的治療進(jìn)入了生物制劑發(fā)展的新時(shí)代，但不良反應(yīng)、治療失敗及適應(yīng)癥受限等問題尚未解決，因此，亟需探索一種經(jīng)濟(jì)有效的治療方式。近年來，越來越多的學(xué)者從自然界存在的天然物質(zhì)入手，證明植物抗氧化劑如原花青素［26］、異鼠李素［27］、瑞香素［28］、蘿卜硫素［29］可降低炎癥因子如IL-6、IL-23A、IL-17A、TNF-α 等的表達(dá)，同時(shí)降低MDA、SOD 等的含量，從而減輕小鼠銀屑病樣皮損。此外，研究還發(fā)現(xiàn)包括甲氨蝶呤、環(huán)孢素、生物制劑在內(nèi)的不同的治療方法均對(duì)患者的氧化還原能力有一定影響［14］。因此，免疫和炎癥信號(hào)通路、氧化還原的復(fù)雜相互作用有待進(jìn)一步研究。

皮膚是人體最大的免疫器官，從免疫方面來說，樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）是固有免疫和適應(yīng)性免疫間的紐帶，參與抗原提呈和T 淋巴細(xì)胞的激活與分化，并通過促炎因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，形成正反饋環(huán)路，從而增強(qiáng)炎癥過程［5］。皮膚中免疫細(xì)胞通過分泌IFN-γ、TNF-α、IL-1β 和IL-6，與漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells，pDC）分泌的IFN-α共同激活并刺激髓樣樹突狀細(xì)胞（myeloid dendritic cells，mDC），激活的mDC 又可分泌TNF-α、IL-12、IL-23等多種炎性因子并誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的分化和成熟，活化的T 淋巴細(xì)胞可分泌IFN-γ、TNF-α、IL-17A 等［30-31］。其中，IFN-γ、TNF-α 作為重要的免疫調(diào)節(jié)因子，已證實(shí)參與銀屑病的發(fā)病，且TNF-α 還可增加其他促炎因子（如白介素家族IL-6、IL-17等）的產(chǎn)生［31-32］。Young等［33］指出TNF-α可導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞中ROS 的形成，從而進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生。而IL-6水平的升高不僅可促進(jìn)KC 的增殖和Th17 細(xì)胞的分化，而且對(duì)Treg的分化有抑制作用［24］。炎癥因子是評(píng)估銀屑病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，本研究證實(shí)了氫分子干預(yù)可抑制炎癥因子IL-6、TNF-α 和IFN-γ 的表達(dá)，與前人的研究結(jié)果相一致［16，34-35］。

目前的研究表明氫分子可通過清除多余的ROS 和增強(qiáng)抗氧化酶的表達(dá)，進(jìn)一步改善氧化應(yīng)激［36］。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)之間的一種失衡狀態(tài)，ROS是一類重要的氧化應(yīng)激產(chǎn)物，包括羥自由基、過氧化物、超氧陰離子等，適量的ROS 在角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖分化、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。ROS產(chǎn)生過多則會(huì)導(dǎo)致過氧化產(chǎn)物如MDA、4-羥基-2-壬烯醛等產(chǎn)生，對(duì)機(jī)體造成損傷［37］。體內(nèi)消除ROS 的抗氧化體系包括酶系和非酶系，其中SOD、CAT是主要的酶系，這些酶可降低ROS 對(duì)機(jī)體的破壞作用。皮膚暴露于外界壞境中，不斷受到內(nèi)源性及外源性ROS的攻擊引起皮膚損傷。當(dāng)皮膚損傷時(shí)，炎癥就會(huì)產(chǎn)生，當(dāng)炎癥得到適當(dāng)調(diào)節(jié)時(shí)，就會(huì)啟動(dòng)皮膚自愈。目前，越來越多的研究結(jié)果認(rèn)為ROS 參與了自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展［12，38］。其中，研究者指出在銀屑病患者和健康對(duì)照組之間，存在抗氧化酶的不平衡，且最新研究指出銀屑病的氧化還原失衡不僅存在于皮膚細(xì)胞、血漿和血細(xì)胞中，還存在于唾液中，而抗氧化劑對(duì)銀屑病的治療有積極影響［8，27］。MDA是過氧化產(chǎn)物之一，CAT是主要的抗氧化酶之一［39］。既往銀屑病與氧化應(yīng)激相關(guān)研究中，Sikar等［40］發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損MDA含量明顯升高，且與PASI 評(píng)分呈一定相關(guān)性。Kadam等［9］指出銀屑病患者血清中CAT 活力降低。氫分子治療銀屑病的研究于2015 年后被陸續(xù)報(bào)道，研究人員給予銀屑病患者吸入氫氣、口服富氫水、靜脈滴注富氫氯化鈉溶液（0.9%）、氫水沐浴等的方式發(fā)現(xiàn)氫可以降低MDA 含量，增加對(duì)氧磷酶-1（paraoxonase-1，PON-1）活性，對(duì)銀屑病的治療具有積極意義［15-17，19，34-35］。本研究結(jié)果也表明氫分子可降低MDA 含量，增加CAT 活力。因此，我們認(rèn)為不同作用方式的氫分子均可能具有提高抗氧化能力和抑制炎癥因子表達(dá)的作用。

本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究氫分子對(duì)小鼠銀屑病樣皮損的作用，初步證實(shí)氫分子能抑制銀屑病樣皮損的形成，降低炎癥因子IL-6、TNF-α 和IFNγ 的表達(dá)，降低過氧化產(chǎn)物MDA 含量，增加抗氧化酶CAT 活力，為氫分子治療銀屑病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。論文不足之處在于未進(jìn)一步深入探究其可能涉及的免疫通路及氧化還原與免疫炎癥信號(hào)通路的交叉點(diǎn)，在后續(xù)的研究中將進(jìn)一步完善。