張笑天，王智，朱鵬宇，魏霜，付偉，黃春蒙，李志紅，王慧煜，焦悅

1.中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，北京 100193；

2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；

3.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣州 510623；

4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100122

基因編輯技術(shù)是采用位點特異性核酸酶剪切DNA，造成靶位點產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂（double strand breaks，DSB），從而誘導細胞對DSB進行非同源末端修復（non-homologous end joining，NHEJ）或同源重組（homologous recombination，HR），利用修復過程中的誤差而使基因組發(fā)生突變的技術(shù)［1］。突變類型包括單核苷酸或多核苷酸的插入、缺失、替換等。目前，以RNA 介導的成簇規(guī)則間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR-associated protein）［2］作為基因組編輯工具占據(jù)較高比例。其中，由Cas9 核酸酶和單向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）構(gòu)成的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)是較為常用的基因編輯系統(tǒng)。自基因編輯技術(shù)出現(xiàn)以來，大量由基因編輯技術(shù)定點修飾基因組所得的新性狀作物不斷出現(xiàn)，如強耐旱性玉米［3］、高油酸低亞油酸大豆［4-5］、高花青素含量的紫番茄［6］、抗除草劑水稻［7-9］等，這其中離不開對基因編輯產(chǎn)品的有效檢測，從而判斷基因編輯產(chǎn)品的成功與否。

對基因編輯產(chǎn)品的有效檢測方法是基因編輯產(chǎn)品研發(fā)與監(jiān)管的基礎(chǔ)，而基因編輯由于無外源基因插入，其與親本的差異多為靶位點處的單堿基或多堿基的插入、缺失、替換以及以上3 種類型的混合發(fā)生。常規(guī)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法與策略并不適用于這類產(chǎn)品的檢測，因此對基因編輯產(chǎn)品檢測方法的研究具有重要意義。為了對基因編輯產(chǎn)品進行有效檢測，研究者們提出了許多方法，如以T7 內(nèi)切酶1（T7E1）、Surveyor 核酸酶為主流的錯配酶切割法（enzyme mismatch cleavage，EMC）［10］和高分辨率溶解曲線法（high resolution metting analysis，HRMA）［11］；許文濤教授團隊開發(fā)的基于快速多重連接酶擴增反應（multiplex ligation probe amplification，MLPA）的基因編輯豬檢測方法與橫向流動核酸生物傳感器（lateral flow nucleic acid biosensor，LFNAB）相結(jié)合，取得了良好的檢測效果［12］。寡核糖核酸（oligoribonucleotide，ORN）探針對相應序列有一定的封閉作用，F(xiàn)ujita等［13］基于此開發(fā)了一種寡核糖核酸干擾的PCR（ORNi-PCR）對編輯THYN1基因的細胞進行靈敏度檢測，發(fā)現(xiàn)最低可檢測到1個堿基的突變；Takeshi等［14］同時使用3 條引物結(jié)合毛細管電泳開發(fā)了一種簡單的基于PCR 的競爭性PCR，從而實現(xiàn)了對基因編輯細胞的檢測。除以上方法外，實時熒光定量PCR 是轉(zhuǎn)基因檢測較為常用的方法，研究人員也開發(fā)了一種基于Taqman探針法的雙探針，通過在編輯位點及其附近區(qū)域設(shè)計不同熒光標記探針對基因編輯產(chǎn)品進行檢測，該方法已證明可應用于多種作物的檢測，靈敏度高且能檢測到單堿基突變［15］。以上方法中，EMC、基于競爭式或封閉式PCR、以及MLPA 的檢測方法均操作簡單，其中EMC 敏感度較低無法檢測單堿基突變［16-17］，其余方法均需二次操作才可得到結(jié)果，HRMA 具有高通量特點，但對于大片段缺失的檢測具有一定局限性［18］。相比來看，實時熒光PCR 無需二次操作且能實現(xiàn)對基因編輯產(chǎn)品的高靈敏特異性鑒定，具有廣泛的應用前景。

本研究在靶位點處設(shè)計1 條Taqman 引物探針，并在其兩側(cè)設(shè)計引物，使用水稻PLD基因作為內(nèi)參基因，對編輯Os11N3基因的水稻進行檢測，結(jié)合本實驗室研發(fā)的植物基因組直提試劑盒，建立了一種基因編輯水稻位點特異性檢測方法，以期為基因編輯產(chǎn)品的檢測和監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻Os11N3（OsSWEET14）基因在根、莖、葉中均有表達，抑制其表達可使水稻對水稻白葉枯黃單胞菌Xoo（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）產(chǎn)生抗性［18］。利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)對日本晴水稻的Os11N3基因進行了編輯，選取其中突變體19OSH-24、19OSH-32、19OSH-110、19OSH-105作為實驗材料。

為驗證本方法對單堿基突變的檢測能力，研究還合成了9 種不同序列的質(zhì)粒作為實驗材料，模擬不同單堿基的突變情況。

1.2 DNA的提取

取約2 cm 的新鮮水稻葉片放入2 mL 離心管中研磨儀1 500 r·min-1，1 min 研磨2 次后，使用3 種不同方法提取水稻葉片基因組，每種提取方法重復3次。

1.2.1 CTAB 法提取水稻葉片基因組 水稻葉片基因組參照參考文獻中的CTAB 法［19-20］并進行了改動，首先配制2% CTAB 緩沖液（1 L）：20 g CTAB、81.82 g NaCl 加無菌水充分溶解后加入0.5 mol·L-1EDTA-Na240 mL、1 mol·L-1Tris-HCl 20 mL。向研磨好的水稻葉片中加入700 μL 2%CTAB緩沖液，蛋白酶K 4 μL，水浴20 min后加入等體積氯仿抽提，取上清液使用預冷的無水乙醇沉淀20 min，棄上清后75%乙醇清洗2次并晾干，最后加入80 μL ddH2O 溶解，并使用Nanodrop 1 000 對其濃度（ng·μL-1）、A260/A280、A260/A230進行測定。

1.2.2 試劑盒法提取水稻葉片基因組 水稻葉片基因組提取參照天根植物基因組提取試劑盒（DP305）說明書進行提取，并使用Nanodrop 1 000對其濃度（ng·μL-1）、A260/A280、A260/A230進行測定。

1.2.3 植物基因組直接提取試劑盒提取水稻葉片基因組 使用本實驗室研發(fā)的植物基因組直提試劑盒。向研磨好的水稻樣品中加入120 μL 提取液，95 ℃金屬浴15 min，離心后取上清5 μL，加入ddH2O稀釋10倍后使用［21］，并使用Nanodrop 1 000對其濃度（ng·μL-1）、A260/A280、A260/A230進行測定。

1.3 qPCR擴增

反應體系（總體積20 μL）為：2×Taqman Gene Expression Master Mix 10 μL，正、反向引物（10 μmol·L-1）各1 μL，模板（植物基因組40 ng）1 μL，ddH2O 補齊至20 μL。qPCR 使用ABI 7500 Fast 實時熒光定量PCR儀完成，擴增程序為：94 ℃預變性15 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環(huán)。

1.4 引物探針設(shè)計篩選

研究選取水稻PLD基因作為內(nèi)參基因，使用標準SN/T 1204-2016中PLD基因引物探針進行擴增，靶位點序列及探針設(shè)計位置如圖1 所示，在靶位點上下游設(shè)計多對通用引物，并于sgRNA 和PAM 序列前后20 bp 左右設(shè)計多條探針進行篩選。最終使用引物探針序列見表1。

表1 熒光定量PCR所用引物探針Table 1 Primers and probes used in fluorescent quantitative PCR

圖1 靶位點探針設(shè)計位置Fig. 1 Position of the target site probe

1.5 特異性驗證

為驗證檢測方法的特異性，選取突變體19OSH-24、19OSH-32、19OSH-110、19OSH-105以及日本晴作為模板進行擴增。

1.6 靈敏度驗證

使用pUC57 為骨架合成質(zhì)粒對該方法能否檢測到單堿基突變進行驗證，合成質(zhì)粒圖譜及序列見圖2。

圖2 質(zhì)粒圖譜及插入序列Fig. 2 Plasmid map and insertion sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 3種基因組提取方法對比

研究比較了CTAB 法、天根試劑盒法和植物基因組直提試劑盒法（以下簡稱直提法）對水稻葉片基因組進行提取的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CTAB法相比，直提法所得基因組濃度、質(zhì)量及基因組的量均低于CTAB 法；與試劑盒法相比，直提法提取基因組濃度較高，基因組的量也較多，但質(zhì)量較低。

由表2 可知，CTAB 法所得基因組A260/A280在1.9~2.0 之間，基因組純度較高；天根試劑盒法所得基因組A260/A280低于1.8，在1.52~1.54 之間，所得基因組純度略低，而直提試劑盒法所得基因組A260/A280最高0.85，遠低于1.8，基因組純度較低。3種提取方法中直提法所得基因組A260/A230小于1，提示其污染比較嚴重。結(jié)合基因組濃度，CTAB法所得基因組濃度、質(zhì)量最好，天根試劑盒法基因組濃度最低、質(zhì)量居中，直提法基因組濃度居中，質(zhì)量最低。

表2 3種基因組提取方法耗時、濃度、質(zhì)量Table 2 Time-consuming, concentration and quality of three genome extraction methods

直提法所得基因組雖然在濃度和質(zhì)量上各有不足，但其操作簡單，縮短了提取所需的時間，整個過程只需35 min，且通過PLD擴增曲線可以看出（圖3），直提法提取基因組的質(zhì)量和基因組濃度均可滿足檢測需要，所以直提法在快速通關(guān)等實際場景中具有應用價值。

2.2 特異性評價

為驗證檢測體系的特異性，選取了突變體19OSH-24、19OSH-32、19OSH-110、19OSH-105，并用親本日本晴水稻作為對照進行檢測。實驗結(jié)果如圖4所示，4個突變體和親本日本晴內(nèi)參基因PLD均擴增良好，在靶位點處只有未編輯過的野生型得到了有效擴增，與圖5中的測序結(jié)果一致。這說明本研究所建立的檢測方法具有一定的特異性。

圖4 特異性評價熒光擴增曲線Fig. 4 Fluorescence amplification curve of specific evaluation

圖5 水稻基因組測序結(jié)果Fig. 5 Sequencing results of rice genome

2.3 靈敏度評價

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)編輯所產(chǎn)生的突變具有隨機性和不確定性。為驗證本研究所建立方法是否能夠有效區(qū)分單堿基突變與未經(jīng)編輯的野生型，研究設(shè)計了圖2所示的9種不同質(zhì)粒，其中一種質(zhì)粒所含序列為野生型靶點片斷和PLD片斷，其余質(zhì)粒含有與靶位點存在1個堿基差異的片斷和PLD片斷。實驗結(jié)果如圖6所示，雖然突變體質(zhì)粒有少量的擴增但仍與WT擴增曲線有明顯區(qū)別，突變體質(zhì)粒相對表達量為0.001~0.123 5，表明本研究創(chuàng)建的體系能夠有效區(qū)分單堿基突變與野生型。

圖6 靈敏度評價熒光擴增曲線Fig. 6 Fluorescence amplification curve of sensitivity evaluation

3 討論

本研究建立了一種基于qPCR 對基因編輯水稻的檢測體系。首先，該體系與EMC、雙探針法、封閉性PCR、競爭性PCR、HRMA 等均有良好特異性，能夠?qū)⒒蚓庉嫯a(chǎn)品與其親本進行明顯區(qū)分。其次，本研究所建立的方法具有較高靈敏度，目前主流基因編輯檢測方法EMC 可對較長片段的插入、缺失進行檢測，與之相比，本體系可將單個核苷酸的插入、缺失、替換與親本野生型進行區(qū)分［16，22］，具有良好的靈敏度，且減少了檢測中假陰性出現(xiàn)的概率。在檢測大片段缺失方面，本體系內(nèi)參基因選擇了水稻PLD基因，避免了大片段缺失造成雙探針法［15］無法檢測到內(nèi)參基因而影響判斷的問題，彌補了HRMA 對100 bp 以上缺失檢測的局限性［17］。同時，本方法也可通過使用384 孔板達到HRMA 高通量檢測的目的。在操作時間與流程上，與基于封閉性PCR［13］和競爭性PCR［14］相比，本體系只需要對提取的基因組進行qPCR，通過Ct值和熒光曲線即可判斷編輯位點是否發(fā)生突變，不需要對PCR 產(chǎn)物進行毛細管電泳或瓊脂糖凝膠電泳等二次處理，一定程度上節(jié)省了成本和時間。此外，在基因組的提取上，采用本實驗室自行研發(fā)的植物基因組直接提取試劑盒，縮短了基因組提取所需時間，所得基因組雖然在提取質(zhì)量和濃度上與CTAB 法相比有一定差距，但完全可以滿足檢測需要，且大大節(jié)約了時間。綜上，本研究所建立的針對水稻Os11N3靶位點的檢測方法特異性強，可同時區(qū)分到1個堿基的突變，操作簡單，可行性強，具有耗時短、成本低的特點，在條件不同的各實驗室內(nèi)均可開展，在基因編輯產(chǎn)品育種過程篩選以及基因編輯產(chǎn)品的定性檢測中具有一定的推廣應用價值。