王珍瑜，陸文超，鐘康榮，關永健，汪真，陳超

1.清華大學化學系，北京 100084；2.貴州千鱘生物科技有限公司，貴州 黔東南苗族侗族自治州 556300

鱘魚，又名鱘龍，隸屬于硬骨魚綱輻鰭亞綱硬鱗總目鱘形目，是地球上最原始和最古老的軟骨魚種之一，也是淡水魚中壽命最長、個體最大的魚類［1］。近年來，我國開展了鱘魚養(yǎng)殖，目前，我國已成為世界鱘魚養(yǎng)殖第一大國，其中史氏鱘（Acipenser schrencki）養(yǎng)殖年產量已達2.5 萬t。其頭、脊索、鰭中軟骨占魚體質量的10%左右。鱘魚軟骨中含有豐富的硫酸軟骨素和膠原蛋白，具有很高的營養(yǎng)價值和較強的保健功能，素有“鯊魚翅、鱘魚骨，食之明目壯陽，延年益壽”之說［2-3］。

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是一種酸性粘多糖，結構復雜，主要以與蛋白質結合的蛋白聚糖形式存在［4-5］。硫酸軟骨素作為一種天然的活性成分在醫(yī)藥領域有著廣泛的應用前景［6-7］，探索并開發(fā)硫酸軟骨素具有重要的經濟與社會價值［8-10］。

硫酸軟骨素的提取方法有堿鹽法、堿法、超聲波法、乙酸抽提法和酶解法等［11-12］。常用的硫酸軟骨素提取方法一般需要使用大量的堿液和有機溶劑，提取率相對也比較低。Ⅱ型膠原蛋白是鱘魚軟骨中的主要蛋白，其由3個分子量約為110 kD的α鏈組成。鱘魚軟骨中的膠原蛋白也具有一定的營養(yǎng)價值，但由于其分子量太大且具有三螺旋結構，不易被快速消化吸收，其功效與價值很難被利用。然而，膠原蛋白水解成小分子量肽之后，消化吸收率會得到明顯提高［13］。近年來，研究者也加大了對膠原蛋白肽的提取、分離、純化工藝的研究［14-16］，進而對其生理作用進行探究［17-18］。

本研究在pH 漸變條件下用多酶連續(xù)分步酶解工藝，采用單因素試驗法考察了酶用量、酶解時間、酶解溫度3 個因素對酶解效果的影響。酶解后利用超濾分離即可得到純度較高的硫酸軟骨素和膠原蛋白肽，期望為今后用鱘魚軟骨生產硫酸軟骨素和膠原蛋白肽提供了工藝依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

冷凍鱘魚段由貴州省千鱘生物科技有限公司提供；木瓜蛋白酶240 U·mg-1、堿性蛋白酶100 U·mg-1、菠蘿蛋白酶100 U·mg-1均購自南寧東恒華道生物科技有限責任公司；硫酸軟骨素標準品購自上海阿拉丁生化科技有限公司；鹽酸氨基葡萄糖對照品購自Sigma 公司；對二甲氨基苯甲醛、乙酰丙酮、碳酸鈉、苯酚等試劑皆為分析純。

島津LC-16 液相色譜儀；PL203 型電子天平（梅特勒-托利儀器（上海）有限公司）；島津UV-2600i 紫外分光光度計；TYM-8 電熱恒溫水浴鍋（中國濟南天宇專用設備有限公司）；高速粉碎機（TP-1000C-8，寧波新芝生物科技股份有限公司）；臺式高速冷凍離心機（TGL-16M，長沙易達儀器有限公司）；真空冷凍干燥機（FD-5，上海能共實業(yè)有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料的預處理 鱘魚段解凍后，去肉，取出頭部、脊索、鰭軟骨，投入80~100 ℃水中燙浸5~10 min，取出冷卻至40 ℃以下，剔除頭部、脊索軟骨上殘留的肌肉、脂肪和其他結締組織，用絞肉機絞碎，放入水中攪拌，然后過篩清洗，以除去碎肉和脂肪，瀝干水分后備用。

1.2.2 酶解法提取硫酸軟骨素與膠原蛋白肽 鱘魚軟骨稱重，加軟骨5 倍重量的去離子水，用膠體磨磨成漿狀，升溫至100 ℃，保持20~30 min，降溫至25 ℃，加碳酸鈉調pH 至8.5。先加入堿性蛋白酶，控溫酶解一段時間（按單因素實驗梯度設置進行）后，再加入木瓜蛋白酶，控溫酶解一段時間（按單因素實驗梯度設置進行），然后加入菠蘿蛋白酶，控溫酶解一段時間（按單因素實驗梯度設置進行）后，升溫至90~95 ℃滅活，保持20~30 min，降溫至40 ℃以下，過濾，濾液用截留分子量10 000 Da的中空纖維膜超濾，截留部分冷凍干燥后得到鱘魚硫酸軟骨素，透過液冷凍干燥后得到膠原蛋白肽。按照式（1）計算提取率。

式中，Y為提取率，C1為產物中目標物的含量，C0為原料中目標物的含量，W1為產物質量，W0為原料質量。

1.2.3 單因素實驗實驗條件和梯度范圍 對酶解

溫度、酶解時間和酶用量分別進行單因素實驗，堿性蛋白酶酶解溫度選取6 個水平（35、40、45、50、55、60 ℃）；堿性蛋白酶酶解時間選取6 個水平（1、2、3、4、5、6 h）；堿性蛋白酶酶用量選取6 個水平（25、50、100、200、300、400 U·g-1）；木瓜蛋白酶酶解溫度選取6個水平（35、40、45、50、55、60 ℃）；木瓜蛋白酶酶解時間選取6個水平（1、2、3、4、5、6 h）；木瓜蛋白酶酶用量選取6 個水平（30、40、50、60、70、80 U·g-1）；菠蘿蛋白酶酶解溫度選取6 個水平（35、40、45、50、55、60 ℃）；菠蘿蛋白酶酶解時間選取6 個水平（1、2、3、4、5、6 h）；菠蘿蛋白酶酶用量選取6個水平（10、20、30、40、50、60 U·g-1）。

1.2.4 硫酸軟骨素含量檢測 硫酸軟骨素含量參照GB/T 20365-2006 硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測定方法并采用液相色譜法進行含量測定。色譜柱：C18（250 mm×4.6 nm，5 μm）；流動相：乙腈-戊烷磺酸鈉溶液（體積分數）=10∶90進行等度洗脫，流速0.8 mL·min-1，檢測波長為192 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

1.2.5 膠原蛋白肽含量檢測 膠原蛋白肽含量檢測參照GB/T5009.5-2003 中的方法測定。蛋白質的換算系數為6.25。

稱取充分混勻的固體試樣0.2~2.0 g（約當于30~40 mg 氮），精確至0.001 g，至消化管中，再加入0.4 g硫酸銅、6 g硫酸鉀及20 mL硫酸于消化爐進行消化。當消化爐溫度達到420 ℃之后，繼續(xù)消化1 h，此時消化管中的液體呈綠色透明狀，取出冷卻后加入50 mL 水，于自動凱氏定氮儀（使用前加入氫氧化鈉溶液，鹽酸或硫酸標準溶液以及含有混合指示劑A 或B 的硼酸溶液）上實現自動加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數據的過程。

1.2.6 蛋白分子量范圍檢測 蛋白分子量范圍檢測按GB31645-2018 附錄A 方法檢測。色譜柱：TSKgel G2000 SWXL（300 mm×7.8 nm）；流動相：乙腈-水-三氟乙酸（體積分數）=40：60：0.05；進行等度洗脫，流速0.5 mL·min-1，檢測波長為1 220 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

2 結果與分析

2.1 堿性蛋白酶酶解條件的單因素實驗分析

2.1.1 酶解溫度對酶解效果的影響 在堿性蛋白酶用量為200 U·g-1底物，酶解時間為6 h，以酶解后的蛋白分子量范圍為指標，考察酶解溫度對酶解效果的影響，結果如圖1 所示。升高溫度有利于酶解，當溫度為45 ℃時酶解效果最好，溫度繼續(xù)增加對酶解效果的改善有限，因此，綜合考慮選取酶解溫度45 ℃進行優(yōu)化試驗。

圖1 酶解溫度對堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig. 1 Effect of hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis of alkaline protease

2.1.2 酶解時間對酶解效果的影響 在堿性蛋白酶用量為200 U·g-1底物，酶解溫度為45 ℃，以酶解后的蛋白分子量范圍為指標，考察酶解時間對酶解效果的影響，結果如圖2所示。當酶解時間超過2 h后，隨著時間的增加，酶解效果增加緩慢，綜合考慮時間因素，選擇酶解時間為2 h進行優(yōu)化實驗。

圖2 酶解時間對堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis time on enzymatic hydrolysis of alkaline protease

2.1.3 酶用量對酶解效果的影響 在酶解溫度為45 ℃，酶解時間為2 h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察堿性蛋白酶用量對酶解效果的影響，其結果如圖3 所示。酶用量在100 U·g-1以下時，隨著酶用量的增大，酶解效果逐漸提高，之后再增大酶用量對酶解效果影響很小。綜合考慮，選擇酶用量為100 U·g-1作為最佳酶用量條件。

圖3 酶用量對堿性蛋白酶酶解效果的影響Fig. 3 Effect of enzyme dosage on enzymatic hydrolysis of alkaline protease

2.2 木瓜蛋白酶酶解條件的單因素實驗分析

以堿性蛋白酶酶解后（酶用量100 U·g-1底物，酶解時間2 h，酶解溫度45 ℃）的液體為原料，分別通過改變酶解溫度、酶解時間和酶用量3個單因素來研究木瓜蛋白酶酶解條件對酶解效果的影響。

2.2.1 酶解溫度對酶解效果的影響 在木瓜蛋白

酶用量為50 U·g-1底物，酶解時間為6 h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察酶解溫度對酶解效果的影響，其結果如圖4 所示。隨著溫度的增加，酶解效率呈先增大后減小的趨勢，當溫度達到50 ℃時，酶解效果最好，故選擇酶解溫度為50 ℃進行優(yōu)化實驗。

圖4 酶解溫度對木瓜蛋白酶酶解效果的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis of papain

2.2.2 酶解時間對酶解效果的影響 在木瓜蛋白酶用量為50 U·g-1底物，酶解溫度為50 ℃，以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察酶解時間對酶解效果的影響，其結果如圖5所示。當酶解時間為2 h時，酶解效果最好，分子量小于10 000 Da的蛋白占比達到79%，隨著時間的增加，結果在79%上下浮動，因此，選擇酶解時間為2 h作為最佳酶解時間。

圖5 酶解時間對木瓜蛋白酶酶解效果的影響Fig. 5 Effect of hydrolysis time on enzymatic hydrolysisof papain

2.2.3 酶用量對酶解效果的影響 在酶解溫度為50 ℃，酶解時間為2 h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察木瓜蛋白酶用量對酶解效果的影響，結果如圖6 所示。當酶用量達到50 U·g-1，再增加酶的用量對酶解效果的提高很小，因此選擇酶用量為50 U·g-1作為最佳酶用量條件。

圖6 酶用量對木瓜蛋白酶酶解效果的影響Fig. 6 Effect of enzyme dosage on enzymatic hydrolysis of papain

2.3 菠蘿蛋白酶酶解條件對酶解效果的影響

以堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后（堿性蛋白酶用量100 U·g-1底物，酶解時間2 h，酶解溫度45 ℃；木瓜蛋白酶用量50 U·g-1底物，酶解時間2 h，酶解溫度50 ℃）的液體為原料，分別通過改變酶解溫度、酶解時間和酶用量3 個單因素來研究菠蘿蛋白酶酶解條件對酶解效果的影響。

2.3.1 酶解溫度對酶解效果的影響 在菠蘿蛋白酶用量為30 U·g-1底物，酶解時間為6 h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察酶解溫度對酶解效果的影響，其結果如圖7 所示。隨著溫度的增加，酶解效率呈先增大后減小的趨勢，當溫度達到50 ℃時，效果最好，故最佳溫度選擇50 ℃。

圖7 酶解溫度對菠蘿蛋白酶酶解效果的影響Fig. 7 Effect of hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis of bromelain

2.3.2 酶解時間對酶解效果的影響 在菠蘿蛋白酶用量為30 U·g-1底物，酶解溫度為50 ℃，以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察酶解時間對酶解效果的影響，結果如圖8 所示。隨著酶解時間的延長，酶解效果總體上呈升高的趨勢，考慮到2 h與6 h時的效果僅相差2%，綜合考慮后選擇酶解時間為2 h進行優(yōu)化實驗。

圖8 酶解時間對菠蘿蛋白酶酶解效果的影響Fig. 8 Effect of hydrolysis time on enzymatic hydrolysisof bromelain

2.3.3 酶用量對酶解效果的影響 在酶解溫度為50 ℃，酶解時間為2 h，以酶解后的蛋白分子量分布為指標，考察菠蘿蛋白酶用量對酶解效果的影響，結果如圖9 所示。當酶用量為30 U·g-1時，酶解效果最好，分子量小于10 000 Da的蛋白占比達到89%，隨著酶用量的增加，酶解效果變化不明顯，因此，選擇酶用量以30 U·g-1作為最佳條件。

圖9 酶用量對菠蘿蛋白酶酶解效果的影響Fig. 9 Effect of enzyme dosage on enzymatic hydrolysis of bromelain

2.4 驗證試驗

綜合考慮單因素實驗得到的最佳工藝參數及操作的可行性，確定連續(xù)分步酶解工藝制備硫酸軟骨素與膠原蛋白肽的最佳工藝參數為：堿性蛋白酶用量為100 U·g-1底物，酶解溫度45 ℃，酶解時間2 h；木瓜蛋白酶用量為50 U·g-1底物，酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h；菠蘿蛋白酶用量為30 U·g-1底物，酶解溫度50 ℃，酶解時間2 h。最佳條件下制備的鱘魚硫酸軟骨素的提取率為85%，純度93%，膠原蛋白肽的提取率為82%，純度為90%。

3 討論

本研究以養(yǎng)殖鱘魚軟骨為原料，用pH漸變條件下多酶連續(xù)分步酶解工藝，可實現同時制備高純度的鱘魚硫酸軟骨素與膠原蛋白肽。最佳條件下制備的鱘魚硫酸軟骨素的提取率為85%，純度93%，膠原蛋白肽的提取率為82%，純度為90%。

鱘魚軟骨中含有豐富的硫酸軟骨素和膠原蛋白，具有很高的應用價值。傳統方法提取硫酸軟骨素一般需采用大量的堿液和有機溶劑，提取率相對較低。因此，對現有方法進行改良十分必要。周暢等［19］利用響應面方法優(yōu)化鰩魚硫酸軟骨素提純工藝，結果表明，最優(yōu)提取工藝為堿液濃度2.3%、提取溫度43 ℃、酶添加量0.7%時，硫酸軟骨素提取率為43.32%。與之相比，本文制備的鱘魚硫酸軟骨素的提取率為85%，純度93%，本工藝大大提高了硫酸軟骨素的提取率。胡藝等［20］通過酸溶-胃蛋白酶從鱘魚軟骨中提取的膠原蛋白，相對于加入NaOH 浸泡去除非膠原成分、滅酶活以及加入冰醋酸透析，本文則減少了堿液使用量、且不需要有機溶劑的參與。

綜上，本試驗為鱘魚養(yǎng)殖及其副產物的加工提供了一條新的路徑，與現有生產工藝相比，操作簡單，減少了堿液使用量且不需要有機溶劑的參與，大大提高了硫酸軟骨素和膠原蛋白肽的提取率，為硫酸軟骨素與膠原蛋白肽的生產方法提供了新的思路與技術數據。