段平成，鄭凱，張宇宏，張國(guó)麗 ，孫國(guó)清

1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，棉花教育部工程研究中心，烏魯木齊 830052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院，新疆 石河子 832000

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，但棉花黃萎病為害嚴(yán)重，導(dǎo)致棉花大面積減產(chǎn)和品質(zhì)下降［1］。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起的土傳維管束病害，被稱為棉花的“癌癥”，可造成棉花植株萎蔫甚至枯死，該病原菌寄主廣泛，易變異，危害嚴(yán)重［2］。當(dāng)前生產(chǎn)上采用的化學(xué)防治可以起到一定的防治效果，但是會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重的破壞。隨著人們對(duì)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)愈加重視，在棉花黃萎病的防治方面，亟需尋求一種對(duì)環(huán)境友好的防治方法［3］。已有研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌可作為拮抗菌使用，其對(duì)于動(dòng)植物和自然環(huán)境無(wú)污染，而且防治效果更好。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，通過(guò)基因改良技術(shù)能夠進(jìn)一步增強(qiáng)芽孢桿菌的抗病效果，有效抑制和防治黃萎病的發(fā)生。這種高效的生物防治方法，更安全有效，對(duì)環(huán)境無(wú)污染，具有廣泛的應(yīng)用前景。

本研究擬通過(guò)篩選、開(kāi)發(fā)高效拮抗菌來(lái)防治棉花黃萎病，從而遏制病菌的危害，保護(hù)環(huán)境，以此來(lái)保障我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展［4］。為了尋找最佳的生防菌劑，本研究對(duì)從棉花試驗(yàn)田病圃中鑒定到的高抗棉花植株中獲得的拮抗菌進(jìn)行篩選、鑒定，并對(duì)其防治黃萎病的效果進(jìn)行評(píng)價(jià)［5-7］，以期為棉花黃萎病的防治提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 拮抗菌BJB01 和大麗輪枝菌VD592菌種均來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所。

1.1.2 試驗(yàn)作物 供試棉花品種為‘新陸早36號(hào)’，種子由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 通用細(xì)菌DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根公司；過(guò)氧化氫酶試劑盒、硝酸鹽試劑盒、吲哚乙酸試劑盒、27F/1492R 細(xì)菌通用引物均購(gòu)自索萊寶公司；碘液、甲基紅、氫氧化鈉、3%次氯酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；溴麝香草酚藍(lán)水溶液購(gòu)自雷根生物公司。

1.1.4 試驗(yàn)培養(yǎng)基配方 LB 培養(yǎng)基：10 g 胰蛋白胨，5 g酵母膏，10 g NaCl，1 000 mL ddH2O（若配制為固定培養(yǎng)基需加入15 g瓊脂）；葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基：0.5 g 葡萄糖，0.5 g 蛋白胨，0.5 g K2HPO4，100 mL ddH2O；牛奶固體培養(yǎng)基：取50 mL脫脂牛奶，再稱1.5 g瓊脂溶于50 mL ddH2O中，將兩液分開(kāi)滅菌，滅菌取出后將兩液倒在一起混勻；淀粉固體培養(yǎng)基：1 g 胰蛋白胨，0.5 g 酵母膏，1 g NaCl，2 g 淀粉，100 mL ddH2O，8 g 瓊脂；葡萄糖液體培養(yǎng)基：1 g胰蛋白胨，0.5 g酵母膏，1 g NaCl，2 g葡萄糖，100 mL ddH2O，8 g 瓊脂；木糖液體培養(yǎng)基：1 g 胰蛋白胨，0.5 g 酵母膏，1 g NaCl，2 g 木糖，100 mL ddH2O，8 g 瓊脂；檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基：0.5 g NaCl，0.02 g 硫酸鎂，0.1 g 硫酸二氫銨，0.1 g磷酸氫二鉀，0.5 g 檸檬酸銨，8 g 瓊脂，100 mL ddH2O，0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液4 mL；YEB液體培養(yǎng)基：2.5 g 胰蛋白胨，5 g 酵母膏，5 g NaCl，2 g 葡萄糖，500 mL ddH2O；PDA 固體培養(yǎng)基：5 g 馬鈴薯浸膏，2.5 g胰蛋白胨，2.5 g葡萄糖，5 g NaCl，7.5 g瓊脂，500 mL ddH2O。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 致病菌的生理生化分析 利用從新疆石河子棉花重病田里篩選獲得的菌株，用LB固體培養(yǎng)基做平板劃線對(duì)提取到的菌株做活性鑒定；再選取活性強(qiáng)的單菌落大量搖菌，做革蘭氏染色試驗(yàn)與生理生化分析。根據(jù)芽孢桿菌可能對(duì)大麗輪枝菌產(chǎn)生作用的生化方式，選取乙酰甲基甲醇試驗(yàn)（VP試驗(yàn)）、葡萄糖利用試驗(yàn)、木糖利用試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)、淀粉分解試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、過(guò)氧化氫分解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)（MR試驗(yàn)）、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)以及鹽濃度存活測(cè)試作為生理生化試驗(yàn)項(xiàng)目。其中吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、過(guò)氧化氫分解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)由于涉及危險(xiǎn)化學(xué)品的使用，故選用由索萊寶公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)；VP試驗(yàn)、葡萄糖利用試驗(yàn)、木糖利用試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)、淀粉分解試驗(yàn)、MR 試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)以及鹽濃度存活測(cè)試，通過(guò)對(duì)相應(yīng)培養(yǎng)基的配制來(lái)進(jìn)行生理生化測(cè)試［3］。

1.2.2 拮抗菌BJB01的生長(zhǎng)曲線 將提取到活性強(qiáng)并純化后的BJB01 菌液1 000 μL 加入50 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中，每隔2 h 測(cè)一次OD600值；當(dāng)出現(xiàn)衰退現(xiàn)象后每隔6~8 h 測(cè)1 次。匯總每個(gè)生長(zhǎng)階段的結(jié)果并制作菌株生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 拮抗菌株分子生物學(xué)鑒定 使用通用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取拮抗菌BJB01 DNA，采用27F/1492R細(xì)菌通用引物對(duì)菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將產(chǎn)物送北京擎科生物公司測(cè)序。測(cè)序所得結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，并構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 菌株拮抗效果初篩 將大麗輪枝菌VD592

菌種接種于PDA 培養(yǎng)基上，置于27 ℃恒溫光培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。5 d 后取出，挑取在LB 固體培養(yǎng)基上的拮抗菌單菌落接種于PDA 培養(yǎng)基4 個(gè)角落，后繼續(xù)置于27 ℃恒溫光培養(yǎng)箱培養(yǎng)3~5 d。培養(yǎng)完成后觀察抑菌圈的大小，并按公式（1）計(jì)算抑菌率［7］。

1.2.5 溫室盆栽防效試驗(yàn) 設(shè)置3 種濃度梯度的拮抗菌液，即OD600為0.1、0.6、1.0，分別做浸種處理12 h，在27 ℃恒溫溫室種植，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，后于棉花長(zhǎng)出2~4 片真葉時(shí)接種大麗輪枝菌進(jìn)行侵染，并在接菌后第7天進(jìn)行二次接種以確保發(fā)病率。全部接種完成后，于第14 天進(jìn)行防效數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。統(tǒng)計(jì)病值，0 級(jí)：0 片真葉被感染；1 級(jí)：1 片真葉被感染；2 級(jí)：2 片真葉被感染；3 級(jí)：3 片真葉被感染；4 級(jí)：4 片真葉及以上被感染或感染后死亡。統(tǒng)計(jì)完成后根據(jù)對(duì)應(yīng)病級(jí)的數(shù)量計(jì)算感病情況，以此確定防效［3，8-10］。同時(shí)使用菌拌土與噴灑菌劑的方式進(jìn)行防效測(cè)試，試驗(yàn)重復(fù)3 次，試驗(yàn)方法按如下步驟進(jìn)行。①菌拌土處理，利用濃度為OD=0.6 的BJB01 芽孢桿菌均勻拌土（微生物菌劑10 mL·kg-1土），再種植棉花（20 盆），在棉花長(zhǎng)出2 片真葉時(shí)接種黃萎病病原菌。②噴灑菌劑處理，直接種植棉花（分兩組，一組20盆），后接種芽孢桿菌，設(shè)置2組芽孢桿菌噴灑時(shí)間（分別選擇棉花長(zhǎng)出兩片真葉后的第7、14 天接種），噴灑時(shí)使用噴壺均勻噴灑在棉花種植土壤上，同樣也在棉花長(zhǎng)出2 片真葉時(shí)接種黃萎病病原菌。按公式（2）~（4）測(cè)試計(jì)算溫室防效。

溫室盆栽防效試驗(yàn)后需從侵染過(guò)的健康未感病植株根部提取菌株，對(duì)得到的菌株提取基因組DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并將產(chǎn)物送樣測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)以確認(rèn)是否為同一種菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的鑒定

2.1.1 拮抗菌種生理生化及革蘭氏染色鑒定 研究用到的拮抗菌種BJB01，是從大田健康棉花植株的下胚軸中分離到的47 種菌中，經(jīng)過(guò)篩選后獲得的活性最強(qiáng)的菌株。

先對(duì)該菌進(jìn)行革蘭氏染色，染色發(fā)現(xiàn)為藍(lán)紫色，即其為革蘭氏陽(yáng)性菌。再針對(duì)該菌進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，進(jìn)行反復(fù)多次測(cè)試后，發(fā)現(xiàn)該菌的VP試驗(yàn)、葡萄糖利用試驗(yàn)、木糖利用試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)、淀粉分解試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、過(guò)氧化氫分解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽(yáng)性，MR 試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)為陰性。并且該菌在鹽濃度為5%、7%時(shí)板上有明顯的大量菌落存活，而超過(guò)10%時(shí)未發(fā)現(xiàn)明顯的菌落。

2.1.2 拮抗菌生長(zhǎng)曲線 通過(guò)繪制拮抗菌BJB01的生長(zhǎng)曲線可進(jìn)一步確定該菌在不同利用情況下獲得最佳濃度的菌液的培養(yǎng)時(shí)間。由圖1 分析發(fā)現(xiàn)，該菌在14 h后生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，在24 h后培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分耗盡，相應(yīng)的菌濃度隨之下降，但在測(cè)試時(shí)間內(nèi)菌不會(huì)消亡。

圖1 BJB01生長(zhǎng)曲線Fig. 1 BJB01 growth curve

2.1.3 拮抗菌的分子生物學(xué)鑒定 圖2 觀察到BJB01 的菌落呈乳白色、橢圓形，邊緣整齊，向上凸起，表面光滑不透明。將提取到的BJB01 菌種涂布后進(jìn)行16S rRNA 測(cè)序，測(cè)序得到的16S rRNA 拼接結(jié)果在NCBI 系統(tǒng)上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，利用MEGA-X 中的NJ 法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖3），發(fā)現(xiàn)該菌與貝萊斯芽孢桿菌相似度極高，為99.71%，由此可確定該菌為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus belleiensis）。

圖2 BJB01的菌落圖Fig. 2 Colony map of BJB01

圖3 BJB01分子進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 BJB01 molecular evolutionary tree

2.2 平板對(duì)峙結(jié)果

將接菌后的PDA 平板在27 ℃恒溫光培養(yǎng)箱培養(yǎng)21 d 后的結(jié)果如圖4 所示。圖4A 顯示，直接接種大麗輪枝菌VD592 第25 天長(zhǎng)滿整個(gè)PDA 平板，與圖4A 對(duì)照相比，圖4B 的抑菌圈明顯擴(kuò)大，表明BJB01對(duì)大麗輪枝菌VD592具有明顯的拮抗效應(yīng)。結(jié)合圖4的對(duì)峙情況和表1的結(jié)果分析，在接菌第21 天時(shí)，抑菌圈增大速度較快，因此可得到貝萊斯芽孢桿菌BJB01 在此時(shí)對(duì)大麗輪枝菌VD592的抑制效果最強(qiáng)。

表1 菌株平板對(duì)峙結(jié)果Table 1 The results of the strain plate confrontation

2.3 溫室盆栽防效試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)平板對(duì)峙試驗(yàn)中第21 天達(dá)到最大抑菌效果的結(jié)果，于接菌第21 天進(jìn)行溫室防效結(jié)果統(tǒng)計(jì)，并針對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。圖5 左圖為棉花健康植株，右圖為棉花感染大麗輪枝菌VD592后的感病植株。溫室抑菌試驗(yàn)生防效果試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 溫室防效結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of greenhouse control effect results

圖5 溫室棉花植株感病效果示意圖Fig. 5 Diagram of disease susceptibility effect of different plants in greenhouse

由表2 可知，比較不同芽孢桿菌浸種處理種子得到的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)直接對(duì)種子接菌的防效較為突出，菌拌土與菌液噴灑的防護(hù)效果較低。分析3 種接菌濃度處理結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)浸種用的菌液濃度即OD600值接近0.6時(shí)，菌的拮抗效果最優(yōu)，且溫室防效大于60%。

前期溫室驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)束后，利用溫室防效試驗(yàn)對(duì)OD600=0.6 時(shí)得到的最優(yōu)菌株進(jìn)行防效驗(yàn)證。根據(jù)表3 的測(cè)試結(jié)果可知，該濃度下的溫室防效依舊最佳為85.91%。

表3 最優(yōu)菌株溫室防效結(jié)果統(tǒng)計(jì)表able 3 Statistical table of optimal strains in greenhouse control effect

注：表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

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3 討論

本研究利用LB 液體培養(yǎng)基對(duì)拮抗菌進(jìn)行反復(fù)的純化培養(yǎng)，并做稀釋涂布以觀察菌落特征，觀察發(fā)現(xiàn)菌落為乳白色、不透明、圓形、表面干燥、邊緣不整齊、有褶皺、菌落中間凹陷。將菌株進(jìn)行大量培養(yǎng)并進(jìn)行生理生化鑒定，然后將該菌提取DNA送樣進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，將得到的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該菌與貝萊斯芽孢桿菌相似度達(dá)99.71%，初步鑒定該菌為貝萊斯芽孢桿菌［11-13］。

平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)于第21 天拮抗效果更為明顯；通過(guò)連續(xù)48 h測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，可以得到最佳的菌株培養(yǎng)時(shí)間，避免因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間不足或培養(yǎng)時(shí)間超時(shí)導(dǎo)致菌株失效，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)14 h 后菌的活性濃度達(dá)到最佳狀態(tài)，可以利用該濃度下的菌液進(jìn)行種子處理［14］。

通過(guò)大量溫室防效測(cè)試分析，當(dāng)使用的BJB01菌液濃度接近OD600=0.6 時(shí)進(jìn)行浸種處理的防效最佳，為89.35%，大于60%，符合防效有效值，表明BJB01 的防效明顯。同時(shí)，根據(jù)平板對(duì)峙的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)于侵染V. dahlia21 d 后，芽孢桿菌對(duì)V.dahliae的拮抗效果達(dá)到最佳。將獲得的最優(yōu)菌株進(jìn)行再次防效測(cè)試，BJB01 的最優(yōu)菌株防效為85.91%，測(cè)試結(jié)果表明獲得的最優(yōu)菌株可以有效防治黃萎病的發(fā)生。試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)使用菌拌土與噴灑菌劑的方式，抗病率較低，不如對(duì)種子進(jìn)行浸種處理防效高。本研究得到了拮抗菌BJB01對(duì)棉花黃萎病防效較好，后續(xù)有望用于生物菌劑的開(kāi)發(fā)，為黃萎病的防治提供了更安全有效且環(huán)境友好的防治方法。