巖藻糖基化胞外多糖降解產(chǎn)物對嬰兒腸道菌群的影響

任昕淼，肖夢詩，南世豪，陳偉苗，李 蓉，付曉丹,*，牟海津,*

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003；2.食品科學(xué)與資源挖掘全國重點實驗室，南昌大學(xué)，中國-加拿大食品科學(xué)與技術(shù)聯(lián)合實驗室（南昌），江西省生物活性多糖重點實驗室，江西 南昌 330047；3.中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，山東 青島 266003；4.青島市婦女兒童醫(yī)院，山東 青島 266003）

嬰兒腸道菌群與嬰兒早期發(fā)育和后天疾病風(fēng)險密切相關(guān)。新生兒腸道內(nèi)最初由需氧和兼性厭氧的腸球菌屬（Enterococcus）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）定植，隨后嚴格厭氧的雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、梭菌屬（Clostridium）和擬桿菌屬（Bacteroides）開始定植，并逐步成為腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群[1]。在嬰兒0～2 歲間腸道菌群發(fā)育的窗口期，嬰兒腸道菌群結(jié)構(gòu)受到分娩方式[2]、喂養(yǎng)方式[3]、抗生素的使用[4]、母乳寡糖分泌類型[5]以及各種生存環(huán)境因素的影響。不同腸道微生物譜對嬰幼兒腸道發(fā)育和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用不同，并且影響后天過敏反應(yīng)，肥胖，炎癥性腸病、腸易激綜合征等代謝紊亂疾病的發(fā)生概率[6]。因此，生命早期有益腸道微生物群的構(gòu)建非常重要。

巖藻糖基寡糖有益生[7]、抗癌[8]和免疫調(diào)節(jié)[9]等多種生理活性，在食品和藥品的開發(fā)中受到高度關(guān)注。盡管巖藻糖基化是自然界中最常見的糖基化形式之一，但巖藻糖基寡糖的天然豐度非常低[10]。母乳是巖藻糖基寡糖的來源之一，母乳中大于50%母乳寡糖是巖藻糖基化的，包括2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosylactose，2’-FL）、3-巖藻糖基乳糖等，其中2’-FL在母乳寡糖中占比近30%，是母乳中含量最豐富的寡糖之一[11]。作為嬰兒營養(yǎng)領(lǐng)域新興的功能性成分，2’-FL在構(gòu)建腸道微生物群的重要作用受到廣泛認同。研究表明，配方奶粉中添加2’-FL能夠選擇性增殖嬰兒腸道中雙歧桿菌等有益菌的豐度，與母乳喂養(yǎng)的嬰兒腸道菌群特征相同[12]。腸道有益菌利用益生元產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物，尤其是短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs），是嬰兒腸道重要的營養(yǎng)素。

除了母乳來源，巖藻糖基寡糖還可以從富含巖藻糖的動物、植物和微生物多糖中獲得，例如含巖藻糖的微生物胞外多糖（fucose-containing microbial exopolysaccharides，F(xiàn)cEPS）[13]。細菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）由于其新穎特殊的組成結(jié)構(gòu)和高效便捷的生產(chǎn)工藝，受到不少研究人員的關(guān)注。近幾十年來，不同細菌產(chǎn)生的EPS組成、結(jié)構(gòu)和功能特性也得到了廣泛研究。其中，產(chǎn)FcEPS的細菌有上百余種，克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）、克拉維桿菌（Clavibactersp.）和腸桿菌（Enterobactersp.）是產(chǎn)FcEPS菌種的豐富來源[14]?？死S桿菌和肺炎克雷伯菌產(chǎn)生的EPS中，巖藻糖含量超過30%，是比較理想的巖藻糖基寡糖來源之一[15-16]。

商業(yè)化的2’-F L 在嬰幼兒配方食品中應(yīng)用有限。目前，嬰幼兒配方食品中以低聚果糖（fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）和低聚半乳糖（galactooligosaccharide，GOS）等普遍商用益生元作為替代母乳寡糖功能的添加物，但GOS和FOS與母乳寡糖的結(jié)構(gòu)差異大，存在功能的局限性。EPS酸解獲得的巖藻糖基寡糖，與巖藻糖基化母乳寡糖具有相似的單糖組成，本研究在體外發(fā)酵過程中，比較3 株雙歧桿菌和2 株乳酸菌對EPS制備的巖藻糖基化胞外多糖降解產(chǎn)物（degradation products of fucosylated exopolysaccharide，DFcP）的利用和代謝偏好，分析DFcP對嬰兒糞便菌群組成和代謝產(chǎn)物SCFAs的影響，旨在為發(fā)掘EPS來源巖藻糖基化碳水化合物作為嬰兒腸道益生元的功能活性及其未來開發(fā)應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長雙歧桿菌嬰兒亞種ATCC 15697（Bifidobacterium longumsubsp.infantisATCC 15697，后稱為嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697）、短雙歧桿菌ATCC 15700（B.breveATCC 15700）、長雙歧桿菌長亞種ATCC BAA-999（B.longumsubsp.longumBAA-999）美國典型培養(yǎng)物保藏中心；干酪乳桿菌ZX147（Lactobacillus caseiZX147）、植物乳桿菌CGMCC 1.19（Lactobacillus plantarumCGMCC 1.19）、乳酸乳球菌M1（Lactococcus lactisM1）和坂崎腸桿菌M1（Enterobacter sakazakiiM1）由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院應(yīng)用微生物學(xué)實驗室提供。2～6 月齡嬰兒糞便由青島婦女兒童醫(yī)院捐贈提供，樣品收集過程符合醫(yī)院倫理要求（審批號QFELL-YJ-2020-27）。

FcEPS由本實驗室提供；2’-FL 美國Layer Origin Nutrition公司；Silica gel 60 F254薄層層析色譜（thin-layer chromatography，TLC）板 德國Merck公司；有機酸標(biāo)準(zhǔn)品（甲酸、乳酸、乙酸、丙酸和丁酸（異丁酸和正丁酸））、內(nèi)標(biāo)異己酸 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FD-1A-50＋真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LAI-3T-N厭氧培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；1260高效液相色譜系統(tǒng)（配有可變波長紫外檢測器）美國Agilent公司；PacBio Sequel II單分子實時測序（single molecule real time sequencing，SMRT）系統(tǒng)美國Pacific Biosciences公司；QuantStudio 3實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Applied Biosystems公司；1510型酶標(biāo)儀、Sorvall Legend Micro 17低溫冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 FcEPS的制備

將接種坂崎腸桿菌M1菌株制備的5 L發(fā)酵液4 000 r/min離心20 min，上清液于55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/4體積，加入4 倍體積的無水乙醇過夜醇沉后4 000 r/min離心20 min，沉淀用超純水復(fù)溶，加入1/5體積的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V），充分振蕩30 min后置于分液漏斗中靜置分層，取水相層再加入1/5體積的Sevag試劑，重復(fù)操作3 次。上層水相進一步冷凍干燥，獲得FcEPS。

1.3.2 DFcP的制備純化和單糖組成測定

10 g FcEPS用1 L 0.2 mol/L HCl溶液溶解，于80 ℃振蕩反應(yīng)4 h后，冷卻后加入6 mol/L NaOH溶液中止酸解反應(yīng)。酸解中和液（pH 6.5）于55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/4體積，加入3 倍體積的95%乙醇溶液，4 ℃醇沉過夜，4 000×g離心20 min收集醇沉上清液，旋蒸濃縮后冷凍干燥獲得粗DFcP。使用乳酸乳球菌M1發(fā)酵脫除可消化性單糖（葡萄糖和半乳糖），發(fā)酵條件如下：粗DFcP質(zhì)量濃度為20 g/L，接菌量為1%，37 ℃培養(yǎng)24 h，獲得脫除半乳糖和葡萄糖的DFcP。

FcEPS和DFcP的單糖組成通過1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（5-methyl-2-phenyl-4H-pyrazol-3-one，PMP）柱前衍生法測定。2 mg樣品溶于2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液中，于110 ℃水解6 h后，按照范斌等[17]的PMP衍生方法和高效液相色譜參數(shù)進行單糖組成測定。

1.3.3 益生菌的體外純培養(yǎng)

MRS肉湯培養(yǎng)基（含有0.5 g/L半胱氨酸鹽酸鹽）用于體外培養(yǎng)3 株雙歧桿菌（嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697、短雙歧桿菌ATCC 15700、長雙歧桿菌BB536）和2 株乳桿菌（干酪乳桿菌ZX147和植物乳桿菌CGMCC 1.19）。無糖MRS培養(yǎng)基為空白組（CK組），其中酵母提取物和蛋白胨質(zhì)量濃度分別調(diào)整為2.5 g/L和5 g/L。將DFcP和2’-FL以質(zhì)量分數(shù)1%分別添加到無糖MRS培養(yǎng)基中作為DFcP組和2’-FL組，每組設(shè)置3 個平行（n=3）。各菌株接種上述培養(yǎng)基，37 ℃體外培養(yǎng)48 h。在體外純培養(yǎng)的0、12、24、36 h和48 h收集發(fā)酵樣品。樣品冷凍離心后，上清液用于測定DFcP消耗量和SCFAs產(chǎn)量，沉淀用磷酸鹽緩沖液渦旋復(fù)溶，酶標(biāo)儀測定OD600nm評價菌株生長情況。

1.3.4 糞便菌群的體外厭氧發(fā)酵

用無菌的糞便收集管收集4 名健康嬰兒（2～6 月齡）的糞便，于－80 ℃保存。糞便菌群活化和體外發(fā)酵的模擬腸道培養(yǎng)基根據(jù)Fu Xiaodan等[18]的方法配制。發(fā)酵前，嬰兒糞便用無菌磷酸鹽緩沖液混勻稀釋，4 ℃靜置15 min，上清液用模擬腸道培養(yǎng)基進行一次活化。體外發(fā)酵時，將DFcP、2’-FL以質(zhì)量分數(shù)1%添加到裝有50 mL模擬腸道培養(yǎng)基的厭氧瓶中，無糖模擬腸道培養(yǎng)基為空白組（CK組）。4 名嬰兒的活化糞便菌液以體積分數(shù)2.5%接種到以上培養(yǎng)基中，37 ℃體外發(fā)酵72 h。在0、12、36 h和72 h收集所有組的發(fā)酵產(chǎn)物，樣品冷凍離心后，上清液用于測定寡糖的消耗量和SCFAs產(chǎn)量，沉淀用于DNA提取和16S rRNA基因擴增。

1.3.5 SMRT

36 h糞便發(fā)酵液冷凍離心，用DNA提取試劑盒提取菌體沉淀的DNA，利用PacBio公司的sequel II平臺進行全長16S rRNA基因測序（北京百邁客生物科技有限公司）。用于擴增16S rRNA 全長V1～V9區(qū)的引物為27 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’），PCR產(chǎn)物進行純化、定量并均一化形成測序文庫（SMRT Bell），用PacBio Sequel測序儀進行測序。PacBio Sequel的下機數(shù)據(jù)通過subreads進行校正得到循環(huán)共識測序（circular consensus sequencing，CCS）序列（SMRT Link,version8.0），然后使用lima（v1.7.0）軟件，通過barcode序列識別不同樣品的CCS并去除嵌合體，得到高質(zhì)量的CCS。Uparse（v7.0.1001）將具有大于97%相似性的序列修剪分配給相同的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）。Silva數(shù)據(jù)庫（http://www.arb-silva.de/）基于mothur算法用于注釋生物分類信息。

使用實時PCR（real-time PCR）對CK組、DFcP組、2’-FL組36 h糞便發(fā)酵液（n=4）中雙歧桿菌和乳桿菌進行絕對定量。標(biāo)準(zhǔn)品為短雙歧桿菌ATCC 15700和植物乳桿菌CGMCC 1.19的基因組DNA。以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對數(shù)（lg（copies/μL））作為橫坐標(biāo)，以real-time PCR過程中到達熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)（Ct值）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進行絕對定量計算。反應(yīng)條件、引物序列和計算方法如Gopalsamy等[19]所述。

1.3.6 TLC

純培養(yǎng)和糞便發(fā)酵過程中碳水化合物利用TLC進行評價。使用正丁醇-乙酸-水（3∶2∶1，V/V）溶液作為流動相，苯胺-二苯胺試劑（4 mL苯胺、4 g二苯胺、200 mL丙酮和30 mL 85%磷酸溶液）作為顯色劑。

1.3.7 SCFAs的測定

使用配備紫外檢測器（G1314F，210 nm）的1260高效液相色譜系統(tǒng)測定純培養(yǎng)和糞便發(fā)酵過程中SCFAs產(chǎn)量。色譜柱為Shodex RSpak KC-811色譜柱（8.0 mm×300 mm，6 μm）。流動相為HClO4溶液（pH 2.1），流速為0.8 mL/min。乳酸、甲酸、乙酸、丙酸和丁酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，異己酸作為內(nèi)標(biāo)，所有標(biāo)準(zhǔn)品濃度為10 mmol/L。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 FcEPS和DFcP的單糖組成

如圖1 所示，從阪崎腸桿菌中提取的FcEPS由巖藻糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖組成（（32.81±0.01）%、（32.14±0.01）%、（17.91±0.04）%、（12.49±0.04）%、（4.64±0.03）%），巖藻糖含量豐富。DFcP由巖藻糖（（36.64±0.02）%）、葡萄糖（（35.84±0.02）%）和半乳糖（（21.88±0.01）%）組成，比例約為3∶3∶2，同時含有少量的甘露糖（（3.57±0.01）%）和鼠李糖（（2.08±0.00）%）。與FcEPS單糖組成相比，DFcP中巖藻糖的物質(zhì)的量占比增加。購買的母乳來源巖藻寡糖2’-FL是一種由乳糖和巖藻糖通過α-(1,2)-鍵形成的三糖（Fucα1-2Galβ1-4Glc），由葡萄糖、半乳糖和巖藻糖以1∶1∶1的比例組成。2’-FL作為母乳中含量最豐富的巖藻糖基寡糖，目前已經(jīng)作為食品添加劑應(yīng)用于嬰幼兒配方食品中。DFcP的單糖組成結(jié)果顯示，從細菌EPS酸解獲得DFcP與2’-FL單糖組成相似，是獲得巖藻糖基化碳水化合物的新型來源。

圖1 FcEPS和DFcP的單糖組成液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of monosaccharide composition of FcEPS and DFcP

2.2 DFcP對典型益生菌增殖和SCFAs水平的調(diào)控

2.2.1 益生菌對DFcP的利用水平

圖2顯示各菌株以DFcP為唯一碳源時的生長情況（OD600nm）和碳源的消耗利用情況（TLC）。DFcP促進嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697、短雙歧桿菌ATCC 15700和植物乳桿菌CGMCC 1.19的增殖，純培養(yǎng)12～48 h內(nèi)OD600nm值均顯著高于CK組（P＜0.05）。TLC顯示2 株雙歧桿菌能夠快速利用DFcP糖組分，而植物乳桿菌CGMCC 1.19對DFcP的利用率較低。長雙歧桿菌BB536和干酪乳桿菌ZX147基本不利用DFcP。所有利用DFcP的菌株中，僅嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697表現(xiàn)出對巖藻糖的快速利用，而其余菌株均無法有效利用巖藻糖。2’-FL于發(fā)酵48 h被嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697完全利用，OD600nm值顯著高于CK組和DFcP組，接近葡萄糖的促生長能力，但其余4 株益生菌基本不利用2’-FL生長增殖，TLC圖譜中2’-FL點基本沒有變化。已有體外純培養(yǎng)驗證了2’-FL不增殖大部分乳桿菌和雙歧桿菌，但選擇性促進嬰兒雙歧桿菌增殖的能力，與本研究單菌體外厭氧發(fā)酵的結(jié)果相同[7]。Matsuki等[20]發(fā)現(xiàn)，能夠利用母乳寡糖強烈增殖的菌株中存在ABC轉(zhuǎn)運蛋白和巖藻糖苷酶基因，表明不同菌株間識別轉(zhuǎn)運含巖藻糖基化碳水化合物的基因和巖藻糖苷酶基因的差異，導(dǎo)致菌株對DFcP不同的利用偏好，使母乳巖藻糖基寡糖表現(xiàn)出特殊的益生活性。DFcP表現(xiàn)出與2’-FL類似的選擇性益生效果，有更廣譜的益生活性。

圖2 DFcP或2’-FL作為唯一碳源對益生菌生長的影響Fig.2 Effect of DFcP and 2’-FL as sole carbon source on the growth of probiotics

2.2.2 菌株SCFAs產(chǎn)生水平

在體外發(fā)酵48 h后，各菌株SCFAs的產(chǎn)生情況如表1所示。益生菌代謝產(chǎn)物SCFAs積累量與寡糖底物的消耗利用度密切相關(guān)。DFcP 顯著增加了嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697、短雙歧桿菌ATCC 15700和植物乳桿菌CGMCC 1.19的產(chǎn)酸量，總酸濃度分別為（49.23±0.12）、（69.32±3.82）mmol/L和（51.99±6.22）mmol/L，但不能促進長雙歧桿菌BB536和干酪乳桿菌ZX147產(chǎn)酸，2 株菌的總酸產(chǎn)量均低于10 mmol/L。與DFcP組相比，2’-FL顯著促進嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697產(chǎn)生乳酸（（20.22±0.10）mmol/L）（P＜0.05），表明乳酸鹽是嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697代謝2’-FL和DFcP的差異SCFAs。SCFAs的產(chǎn)生水平進一步驗證了短雙歧桿菌ATCC 15700和植物乳桿菌CGMCC 1.19對DFcP的偏好利用。另外，DFcP促進2 株益生菌產(chǎn)丁酸（（2.15±0.19）mmol/L和（3.81±0.45）mmol/L），丁酸鹽主要為腸上皮細胞提供能量，是維持腸屏障功能完整和健康的關(guān)鍵物質(zhì)[21]。觀察到乙酸是益生菌利用DFcP和2’-FL的主要產(chǎn)物，在總SCFAs中占比最高，大于40%。據(jù)報道，乙酸鹽是降低腸道內(nèi)的pH值，抑制特定病原菌的繁殖重要貢獻者，是嬰兒腸道早期最重要的SCFAs之一[22]。綜合5 株益生菌底物利用和代謝產(chǎn)酸的結(jié)果，DFcP促進嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697，短雙歧桿菌ATCC 15700和植物乳桿菌CGMCC 1.19的增殖和SCFAs的產(chǎn)生，具有與2’-FL相似的選擇性益生活性。

表1 益生菌SCFAs的產(chǎn)生濃度Table 1 Concentrations of SCFAs produced by probiotics cultured in MRS medium with DFcP and 2’-FL as sole carbon sourcemmol/L

2.3 DFcP對嬰兒糞便菌群的調(diào)控作用

2.3.1 嬰兒糞便菌群對DFcP的利用水平

通過體外厭氧發(fā)酵，探究DFcP對2～6 月齡嬰兒腸道菌群及其代謝產(chǎn)物的影響。通過TLC法評價體外嬰兒4 個糞便菌群樣本發(fā)酵過程中DFcP的消耗情況。如圖3所示，36 h后DFcP中巖藻糖和小分子糖組分被充分利用，僅剩余少量大分子質(zhì)量糖點，而2’-FL的利用程度略低于DFcP，在TLC圖譜中觀察到2’-FL點顏色明顯轉(zhuǎn)淺，但36 h未被菌群完全利用，比較單菌和糞便菌群的TLC結(jié)果，DFcP的益生選擇性弱于2’-FL，因此在相同底物濃度下，菌群表現(xiàn)出對DFcP的偏好利用。根據(jù)TLC圖中2’-FL和DFcP的位置，推測DFcP位于2’-FL上方的兩個寡糖點聚合度≤3，而位于2’-FL下方的寡糖點聚合度≥3，表明DFcP聚合度小，容易被菌群攝取利用。

圖3 體外嬰兒糞便菌群發(fā)酵中DFcP和2’-FL的消耗利用情況Fig.3 Consumption and utilization of DFcP and 2’-FL by in vitro infant fecal flora

2.3.2 嬰兒糞便菌群SCFAs的產(chǎn)生情況

如圖4所示，DFcP組的總SCFAs濃度隨發(fā)酵時間的延長而增加，且產(chǎn)酸量顯著高于2’-FL組（P＜0.05）（圖4A）。母乳喂養(yǎng)的嬰兒中，琥珀酸鹽、甲酸鹽、乳酸鹽和乙酸鹽是生命早期（0～6 月齡）腸道主要的SCFAs，其中腸道甲酸鹽的增加和菌群對巖藻糖的代謝利用有關(guān)，乳酸鹽是各種SCFAs的中間代謝產(chǎn)物，乙酸鹽在嬰兒腸道中占比最高，而丙酸鹽和丁酸鹽則在嬰兒8 個月大后才開始增加[23]。DFcP組總SCFAs濃度為（34.57±5.99）mmol/L，其中，乳酸鹽、甲酸鹽和乙酸鹽分別占比27.4%、33.1%和39.5%（圖4B～D）。在2’-FL組中也觀察到高水平的甲酸鹽和乙酸鹽（41.8%和36.8%）含量，表明巖藻糖的代謝提高了菌群甲酸的產(chǎn)量。兩種巖藻糖基化碳水化合物能夠促進嬰兒腸道菌群產(chǎn)生與母乳喂養(yǎng)嬰兒（2～6 月齡）腸道類似的SCFAs譜，且由于菌群對DFcP的消耗利用度更高，DFcP對菌群產(chǎn)酸促進作用優(yōu)于2’-FL。

圖4 DFcP和2’-FL對糞便菌群SCFAs產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of DFcP and 2’-FL on the production of SCFAs by infant fecal flora in vitro

2.3.3 DFcP對嬰兒糞便菌群結(jié)構(gòu)的影響

通過16S rRNA測序檢測36 h發(fā)酵過程中糞便菌群組成的變化，α和β多樣性分析結(jié)果如圖5所示。在嬰兒糞便體外發(fā)酵36 h后，與CK組相比，DFcP組和2’-FL組均未觀察到Chao指數(shù)的顯著差異（P＞0.05），但2’-FL組的Chao指數(shù)顯著高于DFcP組，表明2’-FL組物種豐富度更高（P＜0.05）（圖5A）。與CK組和DFcP組相比，2’-FL組Shannon指數(shù)顯著升高（P＜0.05），表明2’-FL組微生物多樣性有所降低（圖5B）。主成分分析（principal component analysis，PCA）顯示CK組、2’-FL組和DFcP組的菌群組成存在顯著差異（ANOSIM檢驗，R2=0.845，P=0.001）。β多樣性分析結(jié)果表明，2’-FL和DFcP顯著改變了糞便菌群組成，與2’-FL相比，DFcP組與CK組間距離更遠，兩組間菌群組成的差異更大。

圖5 體外發(fā)酵36 h嬰兒糞便菌群多樣性分析Fig.5 Chao index,Shannon index and PCA plot of infant fecal flora at 36 h of in vitro fermentation

門水平上（圖6A），嬰兒糞便菌群發(fā)酵的優(yōu)勢菌門是變形菌門（Proteobacteria），其次為厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度小于1%。變形菌門和厚壁菌門在嬰兒腸道中占主導(dǎo)地位，厚壁菌門在母乳喂養(yǎng)嬰兒糞便中的比例更高，變形菌門在配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒中占比更高[24]。與CK組和2’-FL組相比，DFcP組中變形菌門顯著降低（P＜0.001），厚壁菌門豐度顯著增加（P＜0.001），而2’-FL和CK組間無顯著差異。

圖6 體外發(fā)酵36 h嬰兒糞便菌群組成分析Fig.6 Compositional analysis of infant fecal flora at 36 h of in vitro fermentation

如圖6B所示，屬水平上，菌群具有高豐度的兼性厭氧菌，腸桿菌屬（Escherichia）和腸球菌屬的相對豐度和大于81%，乳桿菌屬（Lactobacillus）和雙歧桿菌屬豐度較低。與CK組相比，乳桿菌屬和腸球菌屬的豐度在DFcP組中顯著增加（P＜0.05），腸桿菌屬的豐度顯著降低（P＜0.001）。與2’-FL組相比，DFcP組中腸桿菌屬和梭菌屬的豐度顯著降低（P＜0.001），腸球菌屬的豐度顯著增加（P＜0.001），乳桿菌屬的豐度上調(diào)（圖6C）。雙歧桿菌屬在CK組中檢測不到，但在2’-FL和DFcP組中以較低豐度存在。Kuang等[25]比較了中國和其他5 個國家的嬰兒糞便菌群組成，美國、加拿大等國家的嬰兒主要腸型是A型（放線菌門優(yōu)勢），以雙歧桿菌為代表的放線菌門豐度極高，而中國嬰兒的腸型均為P型（變形菌門優(yōu)勢）。同時，與新生兒相比，2 月齡中國嬰兒的腸道微生物群顯著富集了韋榮氏球菌屬（Veillonella）、梭菌屬、鏈球菌屬、糞桿菌屬和乳桿菌屬等微生物，而雙歧桿菌僅在兩月齡嬰兒腸道中初步定植（相對豐度＜2%）。雙歧桿菌的豐度與嬰兒腸型有關(guān)，本研究4 個嬰兒糞便樣本中變形菌門和厚壁菌門是主要優(yōu)勢菌門，以雙歧桿菌為代表的放線菌門占比較低。表2顯示2’-FL和DFcP組中雙歧桿菌屬和乳桿菌屬的絕對定量結(jié)果，與CK組相比，2’-FL和DFcP組顯著增加了雙歧桿菌和乳桿菌屬的絕對豐度，與菌群相對豐度的分析結(jié)果相符。DFcP顯著改變了嬰兒糞便菌群組成，上調(diào)乳桿菌屬和雙歧桿菌屬等有益菌屬的豐度，表明DFcP顯著改變了糞便菌群組成。

表2 體外發(fā)酵36 h嬰兒糞便菌群中乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的16S rDNA拷貝數(shù)Table 2 Number of 16S rDNA copies from Lactobacillus and Bifidobaterium in infant fecal flora at 36 h of in vitro fermentation

通過線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）effect size（LEfSe）比較CK組、2’-FL組和DFcP組的菌群組成，并顯示了物種的LDA評分（圖6D）。DFcP組和2’-FL組中均有2 個物種豐度差異大（P＜0.05）。相比于2’-FL組，DFcP組腸球菌屬和乳桿菌屬豐度較高，菌群中高豐度的腸球菌屬主要由共生菌糞腸球菌組成，乳桿菌屬主要由發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌組成，糞腸球菌和乳桿菌作為乳酸菌，其代謝產(chǎn)生的乳酸、乙酸等SCFAs能夠降低糞便的pH值，促進嬰兒腸道鈣、鎂、鐵和銅等離子吸收并抑制腸道病原體的生長定植[26-27]。腸桿菌屬和梭菌屬在2’-FL組中顯示出更高的豐度。梭菌屬在嬰兒腸道中與腸球菌科、乳桿菌科共生，其代謝產(chǎn)物，例如丁酸、膽汁酸、吲哚乙酸等有利于腸道健康和免疫[28]。

發(fā)酵上清液中SCFAs含量與微生物菌群組成的相關(guān)性如圖7所示，腸球菌屬、乳桿菌屬和雙歧桿菌屬與SCFAs的產(chǎn)生呈正相關(guān)（圖7A）。Spearman相關(guān)性系數(shù)證實所有SCFAs與乳桿菌屬的豐度均呈顯著正相關(guān)，與腸桿菌屬的豐度呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），且雙歧桿菌屬和腸球菌屬的豐度與SCFAs的產(chǎn)生呈正相關(guān)（圖7B）。其中，乳酸的產(chǎn)生與腸球菌屬的增加呈顯著正相關(guān)（R=0.503，P=0.03）。雙歧桿菌屬和乳桿菌屬是腸道中的代表性有益菌，而腸球菌屬則屬于典型的乳酸菌，其代謝寡糖產(chǎn)生的乳酸等SCFAs，降低了嬰兒腸道pH值，提高了嬰兒腸道病原體的定植抗性[29]。

圖7 體外發(fā)酵36 h SCFAs含量與嬰兒糞便菌群的相關(guān)性分析Fig.7 Correlation between SCFA concentration and infant gut microbiota at 36 h of in vitro fermentation

通過京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路功能預(yù)測分析了DFcP組和CK組之間腸道菌群在功能上的差異（圖8）。DFcP組和CK組之間豐度前20的功能基因差異主要富集在代謝通路、環(huán)境信息處理和遺傳信息處理中。在KEGG代謝通路代謝二級水平上，DFcP組和CK組之間腸道菌群的功能存在顯著差異，DFcP組中碳水化合物代謝、核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、萜類和聚酮類代謝、其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成等功能基因的相對豐度顯著高于CK組（P＜0.05）。DFcP顯著增加了菌群中與碳水化合物吸收和代謝相關(guān)的功能基因豐度，從而影響了其他輔因子和維生素代謝、氨基酸代謝和能量代謝等功能基因的豐度變化，表明DFcP對嬰兒糞便菌群功能基因的顯著調(diào)節(jié)。

圖8 體外發(fā)酵36 h嬰兒糞便菌群代謝通路富集分析Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis of functional differences in infant fecal microbiota between DFcP and control groups at 36 h of in vitro fermentation

3 結(jié)論

本實驗通過體外模擬發(fā)酵體系評估EPS來源的DFcP對嬰兒糞便來源菌群的益生活性。DFcP與母乳寡糖2’-FL單糖組成相似，對嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697、短雙歧桿菌ATCC 15700和植物乳桿菌CGMCC 1.19具有顯著的益生作用，并促進3 株益生菌SCFAs積累（（49.23±0.12）、（69.32±3.82）mmol/L和（51.99±6.22）mmol/L ）。2’-FL對嬰兒雙歧桿菌ATCC 15697的顯著增殖效果也再次得到驗證。在嬰兒糞便菌群體外發(fā)酵過程（0～72 h）中，DFcP組產(chǎn)生的SCFAs主要是甲酸、乙酸和乳酸。2’-FL和DFcP組中與巖藻糖代謝相關(guān)的甲酸鹽占比大于30%，表明巖藻糖基化碳水化合物的代謝促進了甲酸的產(chǎn)生。TLC表明DFcP被菌群快速利用，總SCFAs產(chǎn)量顯著高于2’-FL組（P＜0.05）。DFcP和2’-FL組的菌群組成變化表明兩者對嬰兒腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，DFcP提高了菌群厚壁菌門的豐度，顯著上調(diào)乳酸菌腸球菌屬和乳桿菌屬的相對豐度，并增加了雙歧桿菌屬的豐度。與商業(yè)化的嬰兒益生元2’-FL相比，EPS制備的DFcP也顯示出對嬰兒腸道菌群的調(diào)控作用和作為新型益生元的潛力，為進一步開發(fā)新型巖藻寡糖資源提供了新的落腳點，為進一步評價不同結(jié)構(gòu)巖藻糖基化碳水化合物在調(diào)節(jié)生命早期腸道菌群建立及腸道健康發(fā)展過程中的作用提供了新的理論基礎(chǔ)。