范麗珊，樊慧杰，李艷榮，肖琪，賈璐，秦劭晨，王利然，肖保國，馬存根，柴智*

1山西中醫(yī)藥大學(xué)多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室/神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西晉中 030619；2山西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，山西太原 030024；3山西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床學(xué)院，山西太原 030012；4復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是全球患病率居第二位的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1-2]，被PD 困擾者約1000 萬[3-4]。PD 是一種以黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元變性、丟失作為病理特征的進(jìn)行性運動障礙。其臨床表現(xiàn)以運動遲緩、靜止性震顫、肌僵直和姿勢步態(tài)障礙等運動癥狀為主，并伴隨一些相應(yīng)的非運動癥狀；非運動癥狀一般出現(xiàn)在運動異常發(fā)生前的前驅(qū)期，早期癥狀包括精神抑郁、睡眠障礙、便秘等[5]。PD 的臨床表現(xiàn)源自基底節(jié)區(qū)運動核的多巴胺能神經(jīng)元支配喪失。PD的潛在誘發(fā)因素較多，遺傳因素和老齡化增大了該病的風(fēng)險。SNCA基因是最早被發(fā)現(xiàn)的PD 遺傳風(fēng)險因素[6]。SNCA編碼的α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)是路易小體的主要蛋白成分，在家族性和散發(fā)性PD患者大腦中均存在，支持了其在PD 中的重要病理作用。α-syn 可以多種形式存在于大腦中，如可溶的、未展開的單低聚合形式，多項研究發(fā)現(xiàn)α-syn能夠在細(xì)胞間傳播[7]。α-syn在細(xì)胞間的傳遞機(jī)制包括胞內(nèi)作用、胞外作用、細(xì)胞外囊泡及隧穿納米管等[8]。外泌體等細(xì)胞外囊泡可在細(xì)胞間傳遞遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)，且對起源細(xì)胞的近端及遠(yuǎn)端產(chǎn)生一定影響。外泌體廣泛存在于多種體液中，且來源于多種細(xì)胞。大腦釋放外泌體的細(xì)胞有神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞等。本文對外泌體在PD發(fā)生中的作用及靶向外泌體作為PD 治療工具的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為PD 的發(fā)病機(jī)制和臨床診治研究提供參考。

1 外泌體的形成及其功能

外泌體產(chǎn)生于大多數(shù)真核細(xì)胞的核內(nèi)體[9-10]。外泌體形成機(jī)制的相關(guān)報道較多，其中被研究最多的是轉(zhuǎn)運依賴途徑所需的核內(nèi)體分選復(fù)合體(endosomal sorting complex required transport，ESCRT)[11]。ESCRT是一個蛋白家族，它通過在多泡體膜上連續(xù)結(jié)合復(fù)合物，介導(dǎo)了一種泛素化途徑，該途徑將泛素化蛋白識別并保留在晚期核內(nèi)體膜上[11]。ESCRT-0 亞基保留泛素化蛋白，隨著ESCRT Ⅰ/Ⅱ?qū)SCRT-0 的下游識別，將會創(chuàng)建一個核內(nèi)體膜內(nèi)陷，開始管腔內(nèi) 囊 泡(intralumenal vesicle， ILV) 的 形 成[11-12]。ESCRT Ⅲ形成螺旋狀結(jié)構(gòu)收縮ILV 頸部，而ATPase酶的VPS4蛋白則負(fù)責(zé)膜的切斷[11]，這導(dǎo)致了多囊泡體(multivesicular bodies，MVBs)的形成。MVBs 可與細(xì)胞質(zhì)膜融合，釋放ILV 作為外泌體進(jìn)入細(xì)胞外空間[13](圖1)。

外泌體能夠在細(xì)胞間傳遞遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)成分，促進(jìn)細(xì)胞間的通信和信息傳遞[14-15]。外泌體直徑通常為40～160 nm[16]，已被證明可在免疫應(yīng)答中發(fā)揮溝通作用，含有MHC Ⅱ類分子的B淋巴細(xì)胞的外泌體可在體外激活T淋巴細(xì)胞[17]。進(jìn)一步研究顯示，樹突狀細(xì)胞的外泌體在免疫反應(yīng)啟動時專門激活T細(xì)胞。除免疫反應(yīng)功能外，還有外泌體傳播致病性朊病毒和淀粉樣蛋白聚集物的報告[18-21]。

2 外泌體在PD發(fā)生中的作用

2.1 PD細(xì)胞間α-syn的擴(kuò)散 越來越多的證據(jù)顯示，α-syn能夠在細(xì)胞間傳播，已提出了多種促進(jìn)其傳播的機(jī)制，如非經(jīng)典胞外作用、外泌體釋放、胞內(nèi)作用和納米管運輸?shù)?，這些方式都為α-syn在細(xì)胞間的傳遞搭建了橋梁[22]，而α-syn 可傳遞性的發(fā)現(xiàn)也為PD 的發(fā)展提供了關(guān)鍵的視角。根據(jù)PD 病理進(jìn)展的Braak分期假說[23-26]，嗅球和腸道是α-syn傳播的初始來源，注入纖維α-syn進(jìn)入嗅球[27]和腸道[28]的小鼠可發(fā)生跨神經(jīng)元(trans-neuronal)傳遞，傳播病理α-syn到其他大腦區(qū)域。

此外，截尾迷走神經(jīng)切斷和α-syn缺乏的小鼠可阻止這種腸-腦蛋白的傳遞，支持腸道作為α-syn 的最初來源[28]。Arotcarena 等[29]將PD患者含有α-syn的路易小體提取物注射到非人靈長類動物的腸道，也驗證了神經(jīng)毒性的α-syn可從腸道擴(kuò)散到大腦。早期PD 患者的腸道系統(tǒng)中也發(fā)現(xiàn)了錯誤折疊的α-syn[30-32]，進(jìn)一步支持腸道是α-syn 傳播的起始位點。還有研究顯示，肌內(nèi)注射[33]和腹膜內(nèi)注射[34]α-syn 也會引起廣泛的腦部病理變化。上述研究提示，α-syn可從多個外周位點傳播到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

2.2 外泌體和α-syn α-syn的積累是PD的顯著病理特征之一，因此了解其聚集和細(xì)胞間傳遞的機(jī)制可能增進(jìn)對PD病理的理解，從而促進(jìn)更有效的治療方法的開發(fā)。外泌體已被證實可將α-syn轉(zhuǎn)移到正常的神經(jīng)元，并可形成寡聚物而誘導(dǎo)受體細(xì)胞死亡(圖2)。與外泌體相關(guān)的α-syn 寡聚物可使其更容易被細(xì)胞攝取，且具有比游離α-syn寡聚物更強的后續(xù)神經(jīng)毒性[35]。PD模型中外泌體的研究包括對其在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間擴(kuò)散的研究，其中神經(jīng)元間傳遞α-syn研究較多的是相互作用。

在SH-SY5Y 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，野生型α-syn的過度表達(dá)導(dǎo)致其外泌體釋放，在收集的條件培養(yǎng)基中可檢測到單體和寡聚α-syn結(jié)構(gòu)[36]。這一結(jié)果提示，無論是大的α-syn 結(jié)構(gòu)，還是小的α-syn 結(jié)構(gòu)，都能夠在外泌體內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞間傳遞，并可能導(dǎo)致不同的下游過程介導(dǎo)神經(jīng)毒性。

PD的致病因素包括環(huán)境因素，而個人則可能在日常生活中接觸錳元素。近年的研究顯示，PD的風(fēng)險因子錳可在體外上調(diào)含α-syn的外泌體釋放。這些外泌體應(yīng)用于原代小膠質(zhì)細(xì)胞后，通過微泡被內(nèi)吞，可觸發(fā)神經(jīng)炎癥變化，支持α-syn傳遞在小膠質(zhì)細(xì)胞激活中的作用[37]。在人類多巴胺能細(xì)胞模型中，這些外泌體也發(fā)揮了神經(jīng)毒性作用，錳元素被證實能加速α-syn的傳遞，導(dǎo)致在錳暴露的小鼠模型中產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)毒性。

3 外泌體用于PD診治的潛力

外泌體具有用于PD臨床診治的潛力，包括作為治療載體和檢測血清外泌體中特定蛋白的診斷工具的潛力。外泌體具有運輸神經(jīng)毒性蛋白的能力，可通過大腦傳播PD，提示如果細(xì)胞能夠靶向釋放或攝取外泌體，那么其可能成為抑制PD 進(jìn)展的合適靶點。外泌體還被確定為藥物或基因治療的潛在載體，可能用于劫持細(xì)胞間運輸?shù)倪z傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)成分，以達(dá)到治療目的。此外，外泌體是細(xì)胞天然轉(zhuǎn)運機(jī)制的組成部分，有可能避免或減輕細(xì)胞免疫原性反應(yīng)。

3.1 作為PD的診斷工具 目前PD的診斷主要依據(jù)其臨床表現(xiàn)[38]；然而，前驅(qū)性非運動癥狀普遍存在，甚至在運動變性發(fā)病前幾十年就已經(jīng)開始[39-40]。PD的早期診斷和治療還缺少可靠的方法，如果能夠減緩或減少引起運動功能障礙的黑質(zhì)紋狀體多巴胺能變性，則有利于延緩PD的進(jìn)展。因此，開發(fā)早期診斷和識別PD的生物標(biāo)志物將是一個重要突破。

α-syn 被認(rèn)為是一種低效的PD 生物標(biāo)志物，盡管其存在于血液和腦脊液中。部分研究顯示，PD患者血液和腦脊液中α-syn水平較高，但也有部分研究的結(jié)論相反。例如，有報道PD 患者腦脊液α-syn 水平低于健康對照組[41-44]；Stuendl 等[45]報道，PD 患者腦脊液樣本中細(xì)胞外囊泡包含的α-syn 水平也較低。檢測血清和血漿α-syn 也被證明難以用作PD 的生物標(biāo)志物。對從PD患者血液或腦脊液中分離的細(xì)胞外囊泡成分的分析顯示，細(xì)胞外囊泡可能成為PD的有效生物標(biāo)志物[46]。Shi 等[47]報道α-syn 可從腦脊液運輸?shù)窖褐校渲幸恍┍话b在細(xì)胞外囊泡中，表達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性L1 細(xì)胞黏附分子；PD 患者血漿中中樞神經(jīng)系統(tǒng)來源的細(xì)胞外囊泡包含的α-syn水平顯著升高，且與PD的嚴(yán)重程度相關(guān)，提示其可能成為PD 的生物標(biāo)志物，且特異度和敏感度較高。Rani等[48]的研究顯示，與健康對照組比較，從PD患者分離的唾液細(xì)胞外囊泡中α-syn 寡聚物水平更高，且α-syn 寡聚物/總α-syn 比值也有所增高。Tau 蛋白是一種參與阿爾茨海默病發(fā)病進(jìn)程的蛋白，從人血漿中分離的中樞神經(jīng)源性細(xì)胞外囊泡中也檢測到Tau 蛋白水平升高；與阿爾茨海默病患者比較，PD患者Tau 蛋白水平顯著升高[47]。與對照組比較，PD患者血漿中樞神經(jīng)源性細(xì)胞外囊泡的DJ-1 蛋白水平以及細(xì)胞外囊泡包含的DJ-1 與中樞神經(jīng)源性總DJ-1的比值顯著升高[49]。Fraser等[50]的研究顯示，尿液細(xì)胞外囊泡中磷酸化Ser(P)-1292 LRRK2 與總LRRK2 的比值升高可預(yù)測LRRK2突變攜帶者患PD的風(fēng)險。

3.2 作為治療載體 Chung 等[51]的研究顯示，外泌體對PD可能具有治療潛力，與其他細(xì)胞間傳遞機(jī)制相比，外泌體可介導(dǎo)更長距離的α-syn 傳遞。目前PD的治療方法側(cè)重于消除癥狀表現(xiàn)，尤其是側(cè)重于運動功能障礙的控制，還缺乏根治PD 的方法。因此，有必要制定新的治療策略控制PD的進(jìn)展。開發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病新藥物的一個主要障礙是藥物跨越血腦屏障的能力有限[52]。外泌體是納米級的細(xì)胞外囊泡，可穿過包括血腦屏障在內(nèi)的細(xì)胞膜，提示其可能成為將藥物輸送到大腦的有效載體[53-54]。使用外泌體進(jìn)行治療的另一個好處是可降低免疫原性。人工外泌體可裝載治療用的活性分子，如藥物化合物、小干擾核糖核酸或蛋白質(zhì)，并將其傳遞到大腦，因此，利用外泌體可能將治療性活性分子介導(dǎo)到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞。已知天然外泌體可將核酸轉(zhuǎn)運至靶細(xì)胞，因此可考慮將其作為修飾的治療性遺傳物質(zhì)的傳遞工具，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，改變PD的預(yù)后或進(jìn)展。

根據(jù)體內(nèi)和體外研究結(jié)果，從血液中分離出來的人體外泌體負(fù)載飽和多巴胺溶液，可通過轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的相互作用穿過血腦屏障，將多巴胺傳遞到大腦[55]。在小鼠模型中，負(fù)載多巴胺的外泌體顯示出比全身靜脈注射多巴胺更好的治療效果和更低的毒性。Haney 等[56]研究了由神經(jīng)元吸收的載有過氧化氫酶的外泌體對PD神經(jīng)炎癥衰減的治療作用，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶被外泌體攝取后釋放到神經(jīng)元中，可在體外和體內(nèi)PD 模型中發(fā)揮抗氧化作用，促進(jìn)神經(jīng)元存活并緩解神經(jīng)炎癥。Kojima 等[57]還對可將外泌體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞的設(shè)備進(jìn)行了研究，這些設(shè)備在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生外泌體，可將治療性過氧化氫酶mRNA傳遞到大腦。

間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體已被認(rèn)為是治療疾病的有效工具[58]，在PD、多發(fā)性硬化和骨關(guān)節(jié)炎等多種疾病中顯示出有益的效果[59-60]。在6-OHDA小鼠PD模型中，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體被證實可有效地拯救多巴胺能神經(jīng)元[61]，還可攜帶miRNAs，并與神經(jīng)元細(xì)胞相互作用，減輕小鼠PD模型中的神經(jīng)炎癥和促進(jìn)神經(jīng)再生。雖然還需要深入研究并加強臨床試驗進(jìn)一步驗證外泌體對PD的治療作用，但越來越多的證據(jù)支持將外泌體從各種類型細(xì)胞分離出來，將其修飾后可到達(dá)特定的大腦區(qū)域，這可能對PD治療具有良好的應(yīng)用前景[62]。

4 總結(jié)及展望

外泌體相關(guān)研究在過去十年中進(jìn)展迅速，其可通過攜帶蛋白質(zhì)、mRNA 或miRNA 等成分，影響受體細(xì)胞中的基因表達(dá)和蛋白活性[63-64]，也可通過自身的運輸功能促進(jìn)錯誤折疊蛋白的傳播。作為α-syn在大腦中傳遞的載體，外泌體在PD的發(fā)生和進(jìn)展中起到了重要作用。此外，外泌體也為開發(fā)新的治療和診斷工具提供了潛在目標(biāo)(圖3)。

圖3 外泌體在神經(jīng)病理學(xué)和臨床應(yīng)用中的潛在作用Fig.3 Potential roles of exosomes in neuropathology and clinical practice

未來，外泌體可能作為診斷工具，用于檢測包裹的生物標(biāo)記物，或作為藥物、基因治療藥物的前瞻性載體遞送到特定腦區(qū)或細(xì)胞類型，用于PD的治療。然而，盡管外泌體存在明顯的優(yōu)勢，也有其局限性。例如，分離和純化外泌體的程序需要改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化；分離的部分外泌體可能被其他類似外泌體的細(xì)胞外囊泡或蛋白污染。另一個挑戰(zhàn)是對一種通用的外泌體標(biāo)記缺乏普遍共識。為了確定可能的不良反應(yīng)，應(yīng)進(jìn)一步研究不同來源外泌體的差異反應(yīng)性，以確定用于特定治療的外泌體的最佳細(xì)胞來源[65]。此外，還需要更多研究確定膜標(biāo)記物如何將外泌體靶向特定細(xì)胞類型，以及外泌體的含量對終末靶標(biāo)的影響。了解細(xì)胞間外泌體是如何靶向的，可為外泌體抑制劑的發(fā)展提供參考?？傊陙碛嘘P(guān)外泌體與PD和其他神經(jīng)退行性疾病的相關(guān)研究已引起業(yè)界關(guān)注，但在外泌體調(diào)控疾病的作用機(jī)制方面仍有部分核心問題有待解答。隨著對外泌體和其他細(xì)胞外囊泡的進(jìn)一步研究，以及實驗技術(shù)的進(jìn)步，操縱它們在細(xì)胞間傳遞和治療PD的能力有望逐步提高，這將推進(jìn)對PD發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識和診斷、治療方法的革新。