謝文濤， 魚(yú)康康， 程 琦， 李 寧

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科， 上海市傳染病與生物安全應(yīng)急響應(yīng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 國(guó)家傳染病醫(yī)學(xué)中心，上海 200040

肝纖維化是病毒感染、酒精與代謝紊亂等慢性肝損傷導(dǎo)致的肝內(nèi)膠原等細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，引起的肝臟結(jié)構(gòu)及功能異常［1］。肝星狀細(xì)胞（HSC）的活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)?；罨腍SC 是肝纖維化過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)的主要來(lái)源，因而抑制HSC活化是控制肝纖維化的關(guān)鍵。

microRNA（miRNA）通過(guò)表觀遺傳的方式參與基因表達(dá)調(diào)控，在HSC的活化過(guò)程中起重要作用。本課題組既往研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，血清miR-223-3p 的表達(dá)有助于肝硬化無(wú)創(chuàng)診斷；隨著纖維化從S0～S2（早期纖維化）發(fā)展到S3～S4（晚期纖維化），血清miR-223-3p 水平顯著下調(diào)。但miR-223-3p 在HSC 活化中的作用仍不明確。因此，本研究使用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）建立活化的HSC模型，初步闡明了miR-223-3p抑制HSC活化的作用機(jī)制，為肝纖維化的治療提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝星狀細(xì)胞系LX2 來(lái)自復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物系吳健課題組饋贈(zèng)；293T細(xì)胞系由本課題組保存；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA、Pen-Strep Solution購(gòu)自BI公司；定量PCR引物由北京擎科生物有限公司合成；cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑及熒光定量預(yù)混試劑購(gòu)自天根生化科技有限公司；miR-223-3p 模擬物（miR-223-3p）及對(duì)照模擬物（mimic NC）、兔抗微管相關(guān)蛋白1B（microtubuleassociated protein，MAP1B）的商品化siRNA、miR-223-3p定量PCR 引物及內(nèi)參引物均由廣州銳博生物公司合成；TGF-β 購(gòu)自PeproTech 公司；小鼠抗平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體、兔抗Ⅰ型膠原（COLIA1）抗體、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG 購(gòu)自Abcam 公司；小鼠抗GAPDH 單克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司、兔抗MAP1B購(gòu)自Abclonal公司；miRNA 轉(zhuǎn)染試劑INTERFERin 購(gòu)自Polyplus 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑購(gòu)自Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將LX2細(xì)胞及293T細(xì)胞置于5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃恒溫培養(yǎng)，使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基。

1.2.2 HSC 活化模型的建立 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX2細(xì)胞，胰酶消化并計(jì)數(shù)，取適量細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板過(guò)夜，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時(shí)，每孔加入濃度為10 ng/mL的TGF-β，在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)刺激24 h，建立HSC活化模型。

1.2.3 過(guò)表達(dá)miR-223-3p 在細(xì)胞加入TGF-β 刺激8 h 后，將細(xì)胞分為miR-223-3p mimic 組及mimic NC對(duì)照組，使用不含胎牛血清及抗生素的DMEM 培養(yǎng)基配制轉(zhuǎn)染體系，分別轉(zhuǎn)染miR-223-3p 及mimic NC，轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L，轉(zhuǎn)染試劑為INTERFERin?；24 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)并換用新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集蛋白及RNA。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)LX2 細(xì)胞的α-SMA、COLIA1、MAP1B 及miR-223-3p 的mRNA 表達(dá) 細(xì)胞根據(jù)以上方式處理后，提取總RNA 并定量，分別使用天根生化的cDNA 第一鏈合成試劑盒及增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得mRNA及miRNA 的cDNA，使用天根生化熒光定量預(yù)混試劑盒（SYBR Green）及增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒（SYBR Green）進(jìn)行熒光定量PCR。α-SMA 正向引物為：5′-AAGTACCCGATAGAACATGGC-3′，反向引物 為：5′-CTCTTCAGGGGCAACACGAA-3′；COLIA1正向引物為：5′-GAGGGCCAAGACGAAGACATC-3′，反向引物為：5′-CAGATCACGTCATCGCACAAC-3′；MAP1B 的正向引物為：5′-GTCCACCTCGCCTAGCCTG-3′，反向引物為：5′-CCTTGCCTTCCTTCTTAATGACT-3′；GAPDH正向引物為：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，反向引物為：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算LX2 細(xì)胞中各組mRNA 及miRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 Western Blot 法 檢 測(cè)LX2 細(xì) 胞 中α-SMA、COLIA1 及MAP1B 的蛋白表達(dá) 用裂解液提取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，將蛋白濕轉(zhuǎn)到NC 膜上。用1×TBST配置的5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗GAPDH（1∶10 000）抗體、鼠抗α-SMA（1∶2 000）抗體、兔抗COLIA1（1∶2 000）抗體及兔抗MAP1B（1∶2 000）抗體。4 ℃搖床過(guò)夜，1×TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000）或HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000），室溫孵育1 h。1×TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL發(fā)光液于Tanon4600化學(xué)發(fā)光儀器上檢測(cè)化學(xué)發(fā)光并拍照。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光驗(yàn)證過(guò)表達(dá)miR-223-3p 對(duì)HSC活化標(biāo)志物的影響 將miR-223-3p mimic轉(zhuǎn)染至LX2細(xì)胞，48 h 后固定、封閉，后使用α-SMA 及COLIA1 一抗孵育，PBS 洗滌后孵育相應(yīng)熒光二抗，PBS 洗滌后，最后使用DAPI 染細(xì)胞核并制片，至熒光顯微鏡下觀察，放大20倍后制圖。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證MAP1B是miR-223-3p 的靶基因 采用microT-CDS、miRDB 和TargetScan三個(gè)在線軟件預(yù)測(cè)miR-223-3p 的靶基因，選取交叉部分有146 個(gè)潛在靶基因，在146 個(gè)潛在靶基因與活化的HSC中表達(dá)上調(diào)的基因中取交集，得到15個(gè)潛在靶基因，MAP1B 在其中表達(dá)水平最高。在Sac1 與Xho1酶切位點(diǎn)之間將MAP1B 3′UTR 與miR-223-3p 的相互作用序列連接至pGL3載體，作為MAP1B-WT質(zhì)粒；將MAP1B 3′UTR 片段點(diǎn)突變后同樣按照以上方式連接至pGL3 載體，作為MAP1B-Mutant 質(zhì)粒。將MAP1BWT 載體或MAP1B-Mutant 載體、pRL-TK 內(nèi)參質(zhì)粒與miR-223-3p或mimic NC 共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后按照雙熒光素酶試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 活化的HSC中miR-223-3p表達(dá)下調(diào) 對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE67664 數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，篩選在HSC 活化前后差異明顯的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-223-3p 在HSC 活化后表達(dá)量明顯下降（圖1a）；通過(guò)10 ng/mL 的TGF-β 刺激肝星狀細(xì)胞系LX2，Western Blot 結(jié)果顯示，TGF-β能夠上調(diào)HSC活化標(biāo)志物α-SMA（t=35.25，P<0.001）、COLIA1（t=8.64，P<0.01）的蛋白表達(dá)，證實(shí)TGF-β 能夠誘導(dǎo)HSC 活化（圖1b）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與靜息狀態(tài)相比，活化狀態(tài)的HSC 內(nèi)miR-223-3p表達(dá)量顯著下降（t=9.12，P<0.001）（圖1c）。

圖1 miR-223-3p在HSC活化后表達(dá)下降Figure 1 miR-223-3p expression decreased during HSC activation

2.2 過(guò)表達(dá)miR-223-3p 能夠抑制HSC 活化 使用TGF-β 刺激LX2 細(xì)胞8 h 后，將miR-223-3p mimic 及mimic NC 轉(zhuǎn)染至LX2 細(xì)胞，72 h 后提取細(xì)胞蛋白及RNA 或24 h 后轉(zhuǎn)鋪至12 孔板做免疫熒光實(shí)驗(yàn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，上調(diào)miR-223-3p 表達(dá)后，HSC 活化標(biāo)志物α-SMA（t=8.35，P<0.01）、COLIA1（t=12.23，P<0.01）的mRNA 水平明顯下降（圖2a、b）；Western Blot 及免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，HSC 活化標(biāo)志物α-SMA（t=16.24，P<0.001）、COLIA1（t=20.90，P<0.001）蛋白表達(dá)水平明顯降低（圖2c、3）。

圖2 miR-223-3p對(duì) HSC活化的影響Figure 2 Effect of miR-223-3p on the activation of HSC

圖3 細(xì)胞免疫熒光驗(yàn)證過(guò)表達(dá)miR-223-3p對(duì)HSC活化標(biāo)志物的影響Figure 3 Effect of overexpression of miR-223-3p on hepatic stellate activation markers verified by cellular immunofluorescence

2.3 驗(yàn)證MAP1B 是miR-223-3p的靶基因 通過(guò)在線軟件預(yù)測(cè)miR-223-3p 的靶基因，結(jié)果顯示，miR-223-3p與MAP1B 3′UTR存在互補(bǔ)位點(diǎn)（圖4a）；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-223-3p使得轉(zhuǎn)染MAP1B-WT 質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性明顯下降（t=9.52，P<0.001），但對(duì)轉(zhuǎn)染MAP1B-Mutant質(zhì)粒細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)明顯影響（P>0.05）（圖4b）。將siMAP1B 及siNC 轉(zhuǎn)染至LX2 細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siMAP1B能成功抑制LX2細(xì)胞MAP1B的表達(dá)（t=6.28，P<0.001），HSC 活化標(biāo)志物α-SMA（t=7.23，P<0.001）、COLIA（t=4.00，P<0.01）蛋白表達(dá)水平明顯降低（圖5a）；TGF-β 刺激LX2 細(xì)胞8 h 后，將miR-223-3p mimic及mimic NC 轉(zhuǎn)染至LX2細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA及蛋白，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-223-3p 的LX2 上MAP1B的mRNA表達(dá)（t=5.95，P<0.01）及蛋白表達(dá)（t=11.12，P<0.001）水平均顯著降低（圖5b、c）。

圖5 抑制MAP1B對(duì)HSC活化的影響Figure 5 Effect of MAP1B inhibition on HSC activation

3 討論

HSC 的活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。既往研究［4］報(bào)道了自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激、膽固醇代謝及表觀遺傳學(xué)等多種途徑和介質(zhì)調(diào)控HSC的激活。損傷的上皮細(xì)胞、纖維化的組織微環(huán)境、免疫和系統(tǒng)代謝失調(diào)、腸道生物失調(diào)和肝炎病毒產(chǎn)物的旁分泌信號(hào)也可以直接或間接地誘導(dǎo)HSC的激活［5］。

近年來(lái)，許多研究［6］表明miRNA 在肝纖維化的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，miRNA 可影響肝纖維化形成的不同階段，包括HSC 的激活、增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)沉積。本課題組發(fā)現(xiàn)miR-29抑制HSC激活，被鑒定為抗纖維化miRNA［7］。與miR-29 類似，miR-19b 在激活的HSC 中顯著下調(diào)，通過(guò)抑制TGF-βRⅡ的表達(dá)，影響HSC 活化［8-9］；miR-21 通過(guò)激活PTEN/Akt 信號(hào)通路增強(qiáng)HSC 活性［10］；TGF-β 誘導(dǎo)miR-199 表達(dá)上調(diào)［11］。miR-223-3p的表達(dá)與肝纖維化的發(fā)展有關(guān)［12］，在乙型肝炎相關(guān)肝纖維化中，血清miRNA 從早期肝纖維化（S0～S2）至晚期肝纖維化（S3～S4）呈逐漸下降的趨勢(shì)［2］。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-223-3p 在活化的HSC 內(nèi)表達(dá)下降，并確定過(guò)表達(dá)miR-223-3p可抑制HSC活化標(biāo)志物α-SMA和COLIA1的表達(dá)。為了進(jìn)一步研究miR-223-3p調(diào)控HSC 活化的機(jī)制，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)MAP1B為miR-223-3p 的靶基因。過(guò)表達(dá)miR-223-3p 可降低MAP1B的mRNA及蛋白表達(dá)，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)，miR-223-3p 能夠與MAP1B mRNA 靶向結(jié)合。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，抑制MAP1B 的表達(dá)可以抑制HSC 活化標(biāo)志物α-SMA 和COLIA1 的表達(dá)。MAP1B是一種微管相關(guān)蛋白，是一種主要的細(xì)胞骨架蛋白，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，包括基于肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分子運(yùn)輸、自噬和癌癥［13-14］。已有研究報(bào)道了自噬對(duì)HSC 激活的重要作用，HSC 內(nèi)脂滴耗竭是HSC 活化的重要特征［5］，而自噬驅(qū)動(dòng)HSC 內(nèi)的脂質(zhì)在溶酶體內(nèi)降解［15-16］，通過(guò)Atg7 敲除鼠，證明了抑制自噬減少纖維化的形成和細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生［15］。自噬也被報(bào)道調(diào)節(jié)胚胎、肺和腎成纖維細(xì)胞纖維化基因的表達(dá)［15］。MAP1B 對(duì)HSC 活化的影響可能與自噬相關(guān)，后續(xù)需實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行深入探究。

總之，miR-223-3p 可明顯抑制TGF-β 誘導(dǎo)的HSC活化，這一作用可能通過(guò)靶向抑制MAP1B 實(shí)現(xiàn)，但MAP1B如何調(diào)控HSC活化，仍需進(jìn)一步探究。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：謝文濤負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作，撰寫(xiě)論文；魚(yú)康康負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，指導(dǎo)并修改論文；程琦負(fù)責(zé)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，修改論文；李寧負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，指導(dǎo)撰寫(xiě)論文并定稿。