藥用紅樹木欖胚軸抗HBV化學(xué)成分的研究

梁考云, 候師師, 高程海, 劉永宏, 易湘茜

( 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 海洋藥物研究院/廣西海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/藥學(xué)院, 南寧 530200 )

乙型肝炎病毒(HBV)是一種流行性病毒,是引起乙型肝炎(簡稱乙肝)的病原體,屬嗜肝DNA病毒科。全世界目前仍有2.4億HBV感染者,9 300萬為中國感染者,其中2 000萬為乙型肝炎患者。HBV感染引起的乙型肝炎及并發(fā)癥已成為中國面臨的一個(gè)主要公共健康問題。目前,臨床上應(yīng)用于治療乙肝藥物拉米夫定(3TC)和干擾素都具有毒副作用且易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)(鄭慧珂,2012)。因此,開發(fā)抑制HBV復(fù)制新型藥物,成為乙型肝炎治療領(lǐng)域急需解決的難題。

京族是世居廣西的少數(shù)民族,也是中國唯一以海為生的海洋少數(shù)民族(何芳東,2013)。在民族長期發(fā)展過程中,京族成就了具有自己民族特色的用藥體系,其主要偏重于使用海洋來源的中草藥。木欖作為京族傳統(tǒng)海洋藥物,京族醫(yī)書有用其主治乙型肝炎的記錄(寧小清等,2013;張帥等,2016)。依據(jù)京族對(duì)紅樹木欖的傳統(tǒng)藥用,采用現(xiàn)代技術(shù)方法闡明其物質(zhì)基礎(chǔ)具有重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。課題組前期從木欖胚軸中獲得能夠抑制乙型肝炎細(xì)胞的HBV DNA復(fù)制的7個(gè)腈類化合物(Yi et al., 2015)。繼續(xù)深入對(duì)木欖胚軸化學(xué)成分的研究,從中分離得到一個(gè)新生物堿gymnorrhizin A,其對(duì)乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)有抑制作用(陳志勇等,2016)。然而,通過分析木欖胚軸提取物中高效液相色譜譜圖發(fā)現(xiàn)還存在未被報(bào)道的化學(xué)成分,這不利于木欖胚軸在治療乙型肝炎藥物方面的開發(fā)利用。因此,為了全景式闡明木欖胚軸物質(zhì)基礎(chǔ),繼續(xù)以木欖胚軸為研究對(duì)象,挖掘出更多具有抗HBV活性的化合物,豐富海洋來源的具有抗HBV活性的化合物庫,為今后開發(fā)木欖胚軸來源新型抗乙肝藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

WatersE2695半制備高效液相色譜儀(美國Waters公司);半制備HPLC色譜柱為Welch Ultimate XB-C18 [10 mm × 250 mm,5 μm,月旭科技(上海)股份有限公司];分析型HPLC色譜柱為Welch Ultimate XB-C18[4.6 mm × 250 mm,5 μm,月旭科技(上海)股份有限公司];Sepacore中壓制備色譜(瑞士步琦有限公司);EYELA N-1300V-WB小型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司);WFH-203B暗箱式紫外分析儀(杭州奇威儀器有限公司);SW-CJ-2F超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);TAdvanced 96 PCR擴(kuò)增儀(德國Biometra公司);ZWYP-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司);Infinite M200PRO全波長多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司);Light Cycler480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(瑞士Roche公司);HR1500-ⅡB2生物安全柜(青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司)。

柱層析正相硅膠(200～300 目,青島海洋化工廠);薄層硅膠板(煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所);Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱層析色譜(40～70 μm,美國GE Healthcare 公司);胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液、PBS緩沖液、噻唑藍(lán)MTT、胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司);拉米夫定(3TC)(上海麥克林生化科技有限公司);HBV DNA定量測(cè)定試劑盒(湖南圣湘生物科技有限公司)。

實(shí)驗(yàn)用的木欖胚軸樣品于2019年5月采自廣西北侖河口紅樹林自然保護(hù)區(qū)(108°12′E、21°36′N),經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院高程海研究員鑒別為紅樹科(Rhizophoraceae)木欖屬(Bruguiera)木欖(B.gymnorhiza)的胚軸,標(biāo)本保藏于廣西中醫(yī)藥大學(xué)海洋藥物研究院,標(biāo)本編號(hào)為GXIMD M20190517。

1.2 提取分離

木欖胚軸新鮮樣品(濕重約62.0 kg),使用95%工業(yè)酒精(料液比1∶3)浸泡提取3次,每次7 d,過濾取濾液,將濾液合并,減壓濃縮得到浸膏狀提取物。依次使用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,分別依次萃取3次,濃縮后得到石油醚部位(127.20 g)、乙酸乙酯部位(178.06 g)、正丁醇部位(626.00 g)和水部位(1 214.00 g)。

1.3 抗HBV 活性部位篩選

通過檢測(cè)體外HepG2.2.15細(xì)胞上清液中分泌的HBV DNA的含量,以抑制HBV DNA分泌能力大小,來確定木欖胚軸不同提取部位的抗HBV活性。步驟如下。(1)各部位藥液配制:精密稱取各部位粗提物1 mg,使用適量DMSO溶解后,加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基稀釋成500、250、125 μg·mL-1濃度藥液待用。(2)細(xì)胞毒性評(píng)價(jià):采用MTT法檢測(cè)木欖胚軸粗提物和各萃取部位對(duì)細(xì)胞的毒性作用,篩選出活性實(shí)驗(yàn)給藥濃度。將處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2.2.15細(xì)胞以每孔5 000個(gè)接種于96孔板待其貼壁,加入各萃取部位不同濃度藥液,同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(Control)和拉米夫定(3TC)陽性組。培養(yǎng)72 h后吸棄上清液,加入5 mg·mL-1MTT溶液50 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄舊液每孔加DMSO 100 μL,充分振勻。測(cè)490 nm 波長下OD值,計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率 (%)=(OD實(shí)驗(yàn)組A490值/OD陰性對(duì)照孔A490值)×100。(3)抗HBV活性評(píng)價(jià):利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(QPCR),取對(duì)數(shù)生長期HepG2.2.15細(xì)胞,以每毫升5×105個(gè)的細(xì)胞密度接種于24 孔板上,24 h貼壁后,實(shí)驗(yàn)組更換含藥培養(yǎng)液,陰性組加入完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)。第6天收集細(xì)胞上清液,按照病毒DNA制備試劑盒的操作步驟獲得高純度的HBV DNA,運(yùn)用乙型肝炎核酸定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液HBV DNA水平。HBV DNA 抑制率(%)=(陰性對(duì)照孔HBV DNA拷貝數(shù)-實(shí)驗(yàn)孔HBV DNA拷貝數(shù))/陰性對(duì)照孔HBV DNA拷貝數(shù)×100。

1.4 化學(xué)成分分離

取正丁醇萃取物(626.0 g)經(jīng)硅膠拌樣,采用硅膠柱色譜分離,以CHCl3-MeOH系統(tǒng)(10∶0、10∶1、5∶1、20∶7、0∶10,V∶V) 梯度洗脫,收集到13個(gè)組分[Z(1);Z2(2～3);Z3(4～8);Z4(9);Z5(10～20);Z6(21～28);Z7(29～33);Z8(34～37);Z9(38～43);Z10(44～57);Z11(58～63);Z12(64～82);Z13(83)]。組分Z3經(jīng)硅膠柱色譜分離,以氯仿-甲醇系統(tǒng)(10∶0、10∶1、10∶2、10∶4、10∶10、0∶10,V∶V)系統(tǒng)洗脫,得6個(gè)組分(d1～d6),其中d3經(jīng)半制備HPLC(MeOH∶H2O = 10∶90,V∶V)純化后得化合物7(2.3 mg,tR= 13.56 min)、化合物8(1.6 mg,tR= 19.18 min)、化合物4(1.1 mg,tR= 21.89 min)。組分Z4經(jīng)硅膠柱色譜分離,以氯仿-甲醇系統(tǒng)(10∶0、10∶1、10∶2、10∶4、10∶8、0∶10,V∶V)梯度洗脫,得7個(gè)組分(e1～e7),其中組分e4經(jīng)半制備HPLC純化后,在梯度MeOH∶H2O = 20∶80(V∶V)處得化合物10(3.2 mg,tR= 21.52 min),在MeOH∶H2O = 40∶60(V∶V)處得化合物11(2.4 mg,tR= 30.52 min)。組分Z6在放置過程中出現(xiàn)白色結(jié)晶,多次重結(jié)晶后,經(jīng)半制備HPLC分析為較純單體,得化合物5(10.2 mg)。組分Z10經(jīng)Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠柱層析色譜,以甲醇為洗脫溶劑,流經(jīng)薄層板合并后得11個(gè)組分(a1～a11),其中組分a4經(jīng)半制備HPLC(MeOH∶H2O = 95∶5,V∶V)純化后,得化合物1(10.09 mg,tR= 7.08 min)、化合物2(9.14 mg,tR= 17.32)、化合物6(6.64 mg,tR= 9.79 min),組分a5經(jīng)半制備HPLC(MeOH∶H2O = 95∶5,V∶V)純化后,得化合物3(4.23 mg,tR= 13.05 min)。組分Z13(濕重15 g)經(jīng)大孔樹脂柱色譜(流動(dòng)相分別為水、50%甲醇、100% 甲醇,依次沖5個(gè)柱體積),得3個(gè)組分(b1～b3),其中組分b3經(jīng)半制備HPLC(MeOH∶H2O = 80∶20,V∶V)純化后得化合物9(2.01 mg,tR= 23.45 min)。

1.5 單體化合物抗HBV 活性評(píng)價(jià)

使用MTT實(shí)驗(yàn)方法,以每孔5 000個(gè)HepG2.2.15細(xì)胞鋪于96孔板,貼壁后,將分離得到的單體化合物稀釋成100 μg·mL-1,同時(shí)使用100 μg·mL-1拉米夫定(3TC)作為陽性對(duì)照,另設(shè)陰性對(duì)照組。與給藥72 h后,酶標(biāo)儀下490 nm處測(cè)定OD值,并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(OD實(shí)驗(yàn)組A490值/OD陰性對(duì)照孔A490值)×100。

使用實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)方法,將每孔50萬個(gè)HepG2.2.15細(xì)胞鋪于24孔板,貼壁后,將分離得到的單體化合物稀釋成100 μg·mL-1,同時(shí)使用100 μg·mL-1拉米夫定(3TC)作為陽性對(duì)照,另設(shè)陰性對(duì)照組。使用乙型肝炎核酸定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)第6天細(xì)胞上清液中HBV DNA的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 活性部位篩選結(jié)果

高濃度藥物作用于細(xì)胞,會(huì)引起細(xì)胞變形、死亡,從而導(dǎo)致乙肝病毒標(biāo)志物分泌量減少,對(duì)藥物抗乙肝病毒作用的判定產(chǎn)生影響(劉建京和林秀玉,1995)。因此,需確定對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞基本無毒性的藥物劑量進(jìn)行乙肝病毒實(shí)驗(yàn)。采用MTT方法測(cè)定木欖胚軸粗提物和不同萃取部位對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響,確保后續(xù)抗HBV活性實(shí)驗(yàn)在基本無毒的條件下進(jìn)行。由表1可知,與陰性對(duì)照組相比,粗提物和其他部位在500、250 μg·mL-1濃度下對(duì)細(xì)胞增殖均有顯著抑制作用(P<0.05),水部位對(duì)細(xì)胞的增殖無抑制作用。粗提物和其他部位在125 μg·mL-1下對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞無毒副作用,后續(xù)活性實(shí)驗(yàn)可使用125 μg·mL-1或者更低量為給藥濃度。

HBV-DNA為乙肝病毒復(fù)制的基礎(chǔ),也是檢測(cè)乙肝病毒復(fù)制的直接指標(biāo),研究表明慢性HBV感染的傳染性強(qiáng)弱跟HBV DNA水平密切相關(guān),同時(shí)HBV DNA復(fù)制水平會(huì)變化,乙肝疾病的病理現(xiàn)象也會(huì)變化。乙肝病毒DNA定量檢測(cè)是最直接檢測(cè)其是否發(fā)生復(fù)制的方法(王光彥等,2022)。現(xiàn)今可通過檢測(cè)給藥后HBV DNA復(fù)制水平來判斷是否具有抗HBV活性。木欖胚軸粗提物及萃取部位對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清HBV DNA影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示,與陰性對(duì)照組相比,石油醚部位未表現(xiàn)出抑制細(xì)胞上清HBV DNA水平作用。木欖粗提物、水部位、正丁醇部位均使細(xì)胞上清HBV DNA的水平顯著降低(P<0.05)。正丁醇部位抑制HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBV DNA具有極顯著作用(P<0.01),抑制效果強(qiáng)于木欖胚軸粗提物,因此選擇木欖胚軸正丁醇部位作為研究對(duì)象,進(jìn)行物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

2.2 化學(xué)成分結(jié)構(gòu)鑒定(具體結(jié)構(gòu)見圖2)

化合物1白色結(jié)晶。ESI-MSm/z: 244.7 [M+H]+,分子式: C9H12N2O6。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)δH: 11.31 (1H, s, H-3), 7.89(1H, d,J= 8.07 Hz, H-6), 5.78 (1H, d,J= 5.46 Hz, H-1′), 5.65 (1H, d,J= 8.04 Hz, H-5), 4.02 (1H, t,J= 5.34 Hz, H-2′), 3.96 (1H, t,J= 4.53 Hz, H-3′), 3.84 (1H, q,J= 3.44 Hz, H-4′), 3.62 (1H, dt,J=3.06, 12.11 Hz, H-5′), 3.55 (1H, dt,J= 3.01, 12.20 Hz, H-6′);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δC: 150.8(C-2), 163.2 (C-4), 101.8 (C-5), 140.8 (C-6), 87.7 (C-1′), 69.9 (C-2′), 73.6 (C-3′), 84.9 (C-4′), 60.9 (C-5′)?；衔锊ㄗV數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Wang et al., 2010)具體報(bào)道基本一致,故鑒定為尿嘧啶。

與陰性對(duì)照組比較,*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。C為粗提物; Z為正丁醇部位; S為水部位; SY為石油醚部位。下同。Compared with Control, * indicates significant differences(P<0.05), ** indicates extremely significant differences(P<0.01). C is crude extract; Z is n-butanol extract; S is water extract; SY is petroleum ether extract. The same below.圖 1 木欖胚軸各提取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清HBV DNA影響Fig. 1 Effects of each extract of Bruguiera gymnorhiza on HBV DNA of HepG2.2.15 cell supernatant

表 1 木欖胚軸粗提物及各萃取部位對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effects of crude extracts and extracted parts of hypocotyl of Bruguiera gymnorhiza on proliferation of HepG2.2.15 cells

化合物2白色粉末。ESI-MSm/z: 243.1 [M+H]+,分子式: C10H14N2O5。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)δH: 11.27 (1H, s, H-3), 7.70 (1H, d,J= 1.51 Hz, H-6 ), 6.17 (1H, dd,J= 6.13, 7.63 Hz, H-1′), 4.24 (1H, dt,J= 2.98, 2.98, 5.86 Hz, H-3′), 3.76 (1H, q,J= 3.72, 3.72, 3.73 Hz, H-4′), 3.56 (2H, m, H-5′), 2.07 (2H, m, H-2′), 1.77 (3H, d,J= 1.18 Hz, -CH3);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δC: 150.5 (C-2), 163.8 (C-4), 109.4 (C-5), 136.2 (C-6), 83.7 (C-1′), 70.4 (C-3′), 87.3 (C-4′), 61.3 (C-5′), 12.3 (5-CH3)?；衔锊ㄗV數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(姚成芬等,2018)具體報(bào)道基本一致,故鑒定為胸腺嘧啶。

化合物3白色粉末。ESI-MSm/z: 268.1 [M+H]+,分子式: C10H13N5O4。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)δH: 8.35 (1H, s, H-8), 8.13 (1H, s, H-2), 7.34 (2H, s, NH2), 5.87 (1H, d,J=6.24 Hz, H-1′), 4.61 (1H, m, H-2′), 4.14 (1H, dd,J=4.97, 2.95 Hz, H-3′), 3.96 (1H, m, H-4′), 3.67 (1H, dd,J=12.19, 3.66 Hz, H-5′), 3.55 (1H, dd,J=12.17, 3.66 Hz, H-5′);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δC: 152.4 (C-2), 149.1 (C-4), 119.4 (C-5), 156.2 (C-6), 139.9 (C-8), 87.9 (C-1′), 73.4 (C-2′), 70.7 (C-3′), 85.9 (C-4′), 61.7 (C-5′)。化合物波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Kun et al., 1991)具體報(bào)道基本一致,故鑒定為腺嘌呤核苷。

化合物4黃色粉末。ESI-MSm/z: 238.2 [M+H]+,分子式: C11H11NO5。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)δH: 6.76 (1H, t,J=1.55 Hz, 3-H), 6.58 (2H, d,J=1.49 Hz, 1, 4-H), 6.05 (1H, s, 6-H), 3.41 (3H, s, 12-CH3), 2.89 (2H, d,J=10.83 Hz, 8-CH2);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δC: 114.9 (C-1), 152.3 (C-2), 112.0 (C-3), 109.8 (C-4), 72.9 (C-5), 177.6 (C-7), 41.3 (C-8), 134.0 (C-9), 131.8(C-10), 169.0 (C-11), 51.1(C-12)。化合物波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Wang et al., 2014)具體報(bào)道基本一致,故鑒定為oryzalactam。

化合物5無色針狀結(jié)晶。ESI-MSm/z: 235.2 [M-H]ˉ,分子式: C10H20O6。1H NMR (500 MHz, MeOH-d4)δH: 3.91 (1H, d,J=9.90 Hz, 3′-H), 3.87 (1H, dt,J=3.35, 1.65Hz, 5′-H), 3.76 (3H, m, 1′, 4′-H), 3.67 (2H, m, 6′-H), 3.51 (2H, m, 1-CH2), 1.56 (2H, dqd,J=8.60, 6.64, 2.50 Hz, 2-CH2), 1.40 (2H, m, 3-CH2), 0.94 (3H, t,J=7.38 Hz, 4-CH3);13C NMR (125 MHz, MeOH-d4)δC: 61.6 (C-1), 33.3 (C-2), 20.5 (C-3), 14.3 (C-4), 63.5 (C-1′), 101.6 (C-2′), 70.6 (C-3′), 71.6 (C-4′), 71.1 (C-5′), 65.2 (C-6′)?；衔锊ㄗV數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(An et al., 2006)具體報(bào)道基本一致,故鑒定為正丁基-O-D-吡喃果糖苷。

化合物6白色粉末。ESI-MSm/z: 227.2 [M-H]ˉ,分子式: C10H12O6。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)δH: 7.85 (1H, d,J= 8.09 Hz, H-4), 6.15 (1H, m, H-7), 5.63 (1H, d,J= 8.08 Hz, H-3), 4.23(1H, dq,J= 3.10, 3.21, 6.34 Hz, H-9), 3.78 (1H, q,J= 3.58 Hz, H-11), 3.55 (2H, m, H-11), 2.08 (2H, m, H-8);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δC: 163.2 (C-2), 101.8 (C-3), 140.6 (C-4), 150.5 (C-6), 84.1 (C-7), 39.7 (C-8), 70.4 (C-9), 87.4 (C-10), 61.3 (C-11)?；衔锊ㄗV數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Watanadilok et al., 2001)具體報(bào)道基本一致,故鑒定為nortetillapyrone。

化合物7無色粉末。ESI-MSm/z: 169.1 [M+H]+,分子式: C9H12O3。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)δH: 5.86 (1H, d,J=1.97 Hz, H-9), 4.92 (1H, ddd,J=11.67, 6.18, 1.58 Hz, H-6), 3.75 (1H, m, H-4), 3.58 (3H, s, CH3), 2.75 (1H, ddd,J=14.23, 4.73, 2.16 Hz, H-2 ), 2.33 (1H, tdd,J=14.00, 5.60, 1.98 Hz, H-2), 2.04 (1H, dtd,J=12.34, 3.87, 2.03 Hz, H-5), 1.19 (3H, m, H-5, H-3);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 172.4 (C-1), 34.7 (C-2), 23.7 (C-3), 79.4 (C-4), 42.3 (C-5), 65.1 (C-6), 173.0 (C-8), 111.9 (C-9), 51.3 (CH3)。化合物波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Otsuka et al., 1993)具體報(bào)道基本一致,故鑒定為(4R,6S)-4-methoxy-2,3-dihydroaquilegiolide。

化合物8無色粉末。 ESI-MSm/z:155.1 [M+H]+,分子式: C8H10O3。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)δH: 5.86 (1H, d,J=1.92 Hz, H-9), 5.04 (1H, m, H-6), 4.12 (1H, p,J=2.87 Hz, H-4), 2.64 (2H, m, H-2), 2.48 (1H, dd,J=6.32, 3.17 Hz, H-5), 1.96 (1H, ddq,J=13.37, 5.30, 2.38 Hz, H-3), 1.46 (1H, tdd,J=13.34, 5.20, 2.34 Hz, H-3), 1.31 (1H, td,J=11.95, 2.39 Hz, H-5);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δC: 173.1 (C-1), 32.7 (C-2), 40.3 (C-3), 63.9 (C-4),22.5 (C-5), 78.7 (C-6), 111.4 (C-7), 173.4 (C-8)?；衔锊ㄗV數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Otsuka et al., 1993)具體報(bào)道基本一致,故鑒定為(4R,6S)-2-dihydromenisdaurilide。

化合物9黃色油狀物。ESI-MSm/z: 305.2 [M-H]-,分子式: C15H14O7。1H NMR (500 MHz, DMSO-d6)δH: 6.24 (2H, s, H-2′, 6′), 5.88 (1H, d,J=2.34 Hz, H-6), 5.69 (1H, d,J=2.26 Hz, H-8), 4.42 (1H, d,J=7.04 Hz, H-2), 3.78 (1H, ddd,J=12.44, 7.48, 5.04 Hz, H-3), 2.61 (1H, m, H-4), 2.34 (1H, m, H-4);13C NMR (125 MHz, DMSO-d6)δC: 81.0 (C-2), 66.3 (C-3), 27.4 (C-4), 156.4 (C-5), 95.0 (C-6), 156.2 (C-7), 93.8 (C-8), 155.3 (C-9), 98.9 (C-10), 129.8 (C-1′), 106.0 (C-2′, C-6′), 145.6 (C-3′, C-5′), 132.5 (C-4′)?；衔锊ㄗV數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(肖云川等,2015)具體報(bào)道基本一致,故鑒定為沒食子兒茶素。

化合物10無色粉末。ESI-MSm/z: 411.2 [M+H]+,分子式: C20H26O9。1H NMR(500 MHz, MeOH-d4)δH: 6.97 (1H, d,J=2.07 Hz, H-2′), 6.93 (1H, m, H-5′), 6.91 (1H, s, H-2),6.76 (2H, ddt,J=14.21, 7.87, 1.70 Hz, H-6, 6′), 6.65 (1H, dd,J=8.19, 1.23 Hz, H-5), 4.80 (1H, m, H-7), 4.47 (1H, d, 5.84 Hz, H-7′), 4.18 (1H, m, H-8), 3.78 (3H, s, OCH3), 3.72 (3H, s, OCH3′), 3.56 (1H, m, H-8′), 3.39 (1H, dd,J=11.94, 5.37 Hz, H-9), 3.27 (1H, m, H-9′), 1.80 (s, 1H), 1.25(d,J=6.75 Hz, 2H), 1.19(s, 2H);13C NMR (125 MHz, MeOH-d4)δC: 132.4 (C-1), 110.3 (C-2), 147.5 (C-3), 147.4 (C-4), 117.2 (C-5), 119.2 (C-6), 72.6 (C-7), 85.8 (C-8), 60.5 (C-9), 136.5 (C-1′), 110.8 (C-2′), 150.1 (C-3′), 145.8 (C-4′), 114.4 (C-5′), 119.3 (C-6′), 73.7 (C-7′), 76.0 (C-8′), 62.8 (C-9′), 55.1 (OCH3), 54.9 (OCH3′)?；衔锊ㄗV數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(Greca et al., 1998)具體報(bào)道基本一致,故鑒定為1- (4-hydroxy-3-methoxy)-phenyl-2- [4-(1,2,3-trihydroxypropyl)2-methoxy]-phenoxy-1,3-propandiol。

化合物11黃色粉末。ESI-MSm/z: 551.5 [M-H]-,分子式: C27H36O12。1H NMR(500 MHz, MeOH-d4)δH: 6.57 (1H, s, H-2′), 6.43 (2H, s, H-2, 6), 4.38 (1H, d,J=6.63 Hz, H-7), 4.21 (1H, d,J=7.55 Hz, H-1″), 3.84 (6H, m, 3′, 5′-CH3), 3.74 (6H, s, 3, 5-CH3), 3.64-3.16 (9H, 3′, H-9, 9′, 2"～5"), 2.71 (1H, dd,J=15.20, 4.59 Hz, H-7′), 2.63 (1H, dd,J=15.16, 11.56 Hz, H-7′), 2.05 (1H, dddd,J=10.70, 6.80, 4.08, 2.64 Hz, H-8), 1.70 (1H, m, H-8′);13C NMR (125 MHz, MeOH-d4)δC: 138.9(C-1), 134.4 (C-4), 149.0 (C-3, 5), 106.9 (C-2, 6), 43.0 (C-7), 46.7 (C-8), 70.9 (C-9), 56.8 (3, 5-OCH3), 130.1 (C-1′), 107.8 (C-2′), 148.6 (C-3′), 139.4 (C-4′), 147.6 (C-5′), 126.4 (C-6′), 33.9 (C-7′), 40.5 (C-8′), 66.0 (C-9′), 56.6 (3′-OCH3), 105.5 (C-1″), 75.0 (C-2″), 78.0 (C-3″) , 71.3 (C-4″), 67.0 (C-5″), 60.0 (5″-OCH3)?；衔锊ㄗV數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(吳兆圓和李蓉濤,2011)具體報(bào)道基本一致,故鑒定為 (-)-南燭木樹脂酚-9-O-β-D-木吡喃糖苷。

2.3 單體化合物抗HBV活性結(jié)果

在給藥濃度100 μg·mL-1條件下,與陰性對(duì)照組相比,化合物1和化合物10作用下HepG2.2.15細(xì)胞的存活率分別降低了14.05%、11.10%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余化合物對(duì)細(xì)胞增殖無明顯抑制作用,即表明對(duì)細(xì)胞本身無毒副作用,結(jié)果如表2所示。后續(xù)可以選擇化合物2-9和11在給藥濃度100 μg·mL-1條件下,進(jìn)行抗HBV活性實(shí)驗(yàn)。

圖 2 木欖胚軸的正丁醇部位獲得的單體化合物結(jié)構(gòu)式Fig. 2 Structures formula of monomer compounds from the n-butanol extract of Bruguiera gymnorhiza hypocotyl

由圖3可知,與陰性對(duì)照組相比,化合物4能降低HepG2.2.15細(xì)胞上清HBV DNA水平,但不顯著(P>0.05),其抑制率為23.59%,其他化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA水平無明顯降低作用(P>0.05)。

3 討論與結(jié)論

京族俗稱紅樹為“海欖山”。由于解放前京族聚集區(qū)缺乏純凈飲用水,又長期以魚蝦蟹等為主要食物,因此,肝炎一直是京族的易發(fā)疾病?！昂焐健蹦緳炀哂星鍩峤舛竟π?京族用其主治乙型肝炎。木欖胚軸屬可再生生物資源,采摘不會(huì)破壞生態(tài)環(huán)境和紅樹資源,本研究發(fā)現(xiàn)紅樹木欖胚軸的正丁醇萃取部位具有抗HBV活性,從而驗(yàn)證了京族傳統(tǒng)用藥的科學(xué)性。從活性部位正丁醇萃取相中獲得了11個(gè)化合物,包括4個(gè)首次從藥用紅樹木欖中獲得,即oryzalactam (4)、正丁基-O-D-吡喃果糖苷 (5)、(4R,6S)-4-methoxyl-2,3-dihydroaquilegiolide (7)和(4R,6S)-2-dihydromenisdaurilide (8),豐富了木欖的化學(xué)成分。從木欖中獲得的主要有二萜、三萜、酚類、含硫化合物、生物堿類等結(jié)構(gòu)類型(高程海等,2022)。獲得的化合物4為生物堿類化合物,化合物5為糖苷類化合物, 化合物7和化合物8為內(nèi)酯類化合物,同時(shí)擴(kuò)大了木欖的化合物結(jié)構(gòu)類型。

圖 3 化合物2-9和11對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞產(chǎn)生HBV DNA的抑制作用Fig. 3 Inhibitory effects of compounds 2-9, and 11 on production of HBV DNA in HepG2.2.15 cells

表 2 單體化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的作用Table 2 Effects of monomer compounds on proliferation of HepG2.2.15 cells

研究同時(shí)還獲得4個(gè)生物堿類化合物尿嘧啶(1)、胸腺嘧啶(2)、腺嘌呤核苷(3)和oryzalactam (4)。生物堿是天然產(chǎn)物的重要組成部分,對(duì)多種病毒表現(xiàn)出抑制活性,如甲型流感病毒、HBV、HCV、HSV、HIV、寨卡病毒、柯薩奇病毒和煙草花葉病毒(王宏等,2022)。研究首次報(bào)道了生物堿oryzalactam (4)具有抗乙型肝炎病毒活性,也具有強(qiáng) ABTS+和 DPPH自由基清除能力(Wang et al., 2014)。因此,猜測(cè)oryzalactam抗HBV活性與其強(qiáng)抗氧化活性有著一定聯(lián)系,可能是發(fā)揮抗氧化活性的基團(tuán)協(xié)同或拮抗了一些生理因子,有利因子的表達(dá)水平增強(qiáng),從而在非細(xì)胞毒性濃度下表征出抑制HBV的活性。梁曉蓮等(2021)研究表明,生物堿發(fā)揮抗HBV活性機(jī)制為直接抑制HBV DNA和HBV cccDNA產(chǎn)生,而其他生物堿如槐定堿等是通過介導(dǎo)的蛋白激酶(p38 MAPK)水平降低,間接發(fā)揮抗HBV活性,本研究中生物堿化合物4的強(qiáng)抗氧化活性拮抗HBV DNA因子的表達(dá)水平,進(jìn)而體現(xiàn)出較為顯著的抗HBV活性,符合以上猜測(cè)。本研究目前關(guān)于木欖胚軸化學(xué)成分中抗HBV活性方面研究較少,后續(xù)將根據(jù)化合物4的紫外吸收波長等關(guān)鍵信息,借助高效液相色譜方法,定向獲得更多化合物4的同系物科研工作奠定基礎(chǔ),為研制海洋來源的新型抑制HBV復(fù)制的藥物提供先導(dǎo)化合物,來提升紅樹木欖胚軸的藥用價(jià)值。