西南地區(qū)六種魔芋屬植物基于cpDNA序列的遺傳多樣性研究

殷 斯, 郝 轉(zhuǎn), 陸飛東, 高 永*

( 1. 曲靖師范學(xué)院 生物資源與食品工程學(xué)院, 云南 曲靖 655011; 2. 渭南師范學(xué)院 環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 渭南 714099 )

探究栽培作物野生資源的遺傳多樣性及遺傳分化機(jī)制對(duì)種質(zhì)資源的收集與品種改良具有重要的應(yīng)用價(jià)值和科研意義。魔芋是天南星科(Araceae)、魔芋屬(AmorphophallusBlume)的多年生草本植物(白立偉等,2016),主要分布于西非、亞洲中南半島、中國(guó)西南山地和東南亞國(guó)家的熱帶及亞熱帶地區(qū),全球約200種,我國(guó)約有20種(劉佩瑛,2004)。魔芋在我國(guó)具有悠久的栽培利用歷史并且野生種質(zhì)資源豐富,其地下球狀塊莖富含葡甘聚糖,具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(李恒和龍春林,1998)。近年來(lái),我國(guó)的魔芋種植面積不斷擴(kuò)大,自2017年起,西南各省的總種植面積已達(dá)到世界第一(Srzednicki &Borompichaichartkul, 2020)。但是,由于長(zhǎng)期無(wú)性繁殖,魔芋種質(zhì)出現(xiàn)了品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低、病害流行等問(wèn)題,因此,要推動(dòng)魔芋產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展,加快野生種質(zhì)資源的收集與遺傳多樣性評(píng)價(jià)已刻不容緩(宣慢,2010)。

20世紀(jì)80年代起,我國(guó)對(duì)魔芋種質(zhì)資源的起源與進(jìn)化、種質(zhì)的親緣關(guān)系和分類(lèi)等進(jìn)行了研究并取得一定的成果(牛義等,2005)。李恒研究整理了中國(guó)魔芋屬植物19種,包括中國(guó)特有的8個(gè)種,后續(xù)又發(fā)現(xiàn)命名了3個(gè)新種(李恒,1988)。一些分子生物學(xué)研究利用ISSR、RAPD、AFLP等分子標(biāo)記,探討了魔芋部分栽培品種之間的親緣關(guān)系(張盛林和孫遠(yuǎn)航,2006;任盤(pán)宇和潘明清,2013;Pan et al., 2015)。但是目前,我國(guó)在魔芋野生資源的親緣關(guān)系特別是分子系統(tǒng)進(jìn)化方面的研究還較為欠缺,各地命名混亂,同種異名和同名異種的現(xiàn)象較為突出,特別是對(duì)野生魔芋資源的遺傳變異缺乏系統(tǒng)研究(牛義等,2005)。

作為西南地區(qū)的特色經(jīng)濟(jì)作物,魔芋具有重要的經(jīng)濟(jì)與生態(tài)價(jià)值(趙培城等,2015)。但環(huán)境污染、生境破壞等人類(lèi)活動(dòng),造成了魔芋野生群體的衰退(牛義等,2005)。作為種質(zhì)資源改良的優(yōu)良材料,加快野生種質(zhì)資源的研究與利用,對(duì)魔芋的品種改良具有重要意義。當(dāng)前對(duì)魔芋野生群體的遺傳背景缺乏了解,給資源保護(hù)和育種工作造成了很大阻礙(Gao et al., 2017)。葉綠體DNA(cpDNA)為單系遺傳,遺傳過(guò)程不經(jīng)歷基因重組,被廣泛地應(yīng)用于植物系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性評(píng)價(jià)等研究中(李婭翔等,2020)。cpDNA 片段trnK-matK、rbcL和trnL在天南星科的系統(tǒng)進(jìn)化研究中,被證明具有通用性好、突變率高的特點(diǎn)(Grob et al., 2002; Sedayu et al., 2010)。破碎生境對(duì)種群動(dòng)態(tài)的影響及演化趨勢(shì)是保育遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題,遺傳多樣性則是推斷物種進(jìn)化潛力的重要指標(biāo)之一(王崢?lè)搴透饘W(xué)軍,2009)。為評(píng)估西南地區(qū)魔芋屬物種野生群體的遺傳多樣性,探究代表物種的系統(tǒng)發(fā)育地位,本研究采用以上3個(gè)cpDNA片段對(duì)西南地區(qū)6種魔芋屬植物的野生群體進(jìn)行遺傳多樣性及種間系統(tǒng)發(fā)育研究,以期為西南地區(qū)魔芋物種的保護(hù)提供指導(dǎo),為今后魔芋的種質(zhì)創(chuàng)新提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019—2021年,本研究采集南方五省(區(qū))(云南、廣西、貴州、湖南、江西)的魔芋屬6個(gè)種,即花魔芋(Amorphophalluskonjac)、東京魔芋(A.tonkinensis)、西盟魔芋(A.krausei)、滇魔芋(A.yunnanensis)、疣柄魔芋(A.paeoniifolius)、東亞魔芋(A.kiusianus)的野生群體。采樣過(guò)程中,隨機(jī)選擇植株,每株樣本間隔至少5 m,采集葉片置于硅膠中干燥保存(表1)。采用植物基因組DNA提取試劑盒(天根,北京)提取魔芋葉片總基因組DNA,1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表 1 本研究的魔芋群體樣本采集地點(diǎn)信息Table 1 Geographic information of Amorphophallus populations collected in this study

1.2 PCR擴(kuò)增和測(cè)序

利用已發(fā)表的引物對(duì)trnK-matK、rbcL和trnL 3個(gè)cpDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表2)。PCR擴(kuò)增體系總體積為30 μL,包含20～50 ng DNA模板,正、反向引物(10 μmol·L-1),2×PCR StarMix(GenStar)和ddH2O等。反應(yīng)程序:預(yù)變性,95 ℃,5 min;35個(gè)擴(kuò)增循環(huán),95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s;終延伸,72 ℃,7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),合格產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

表 2 cpDNA片段擴(kuò)增所用引物序列Table 2 Primer sequences used in the amplification of cpDNA fragments

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Lasergene軟件的Seqman工具對(duì)3個(gè)cpDNA片段進(jìn)行拼接(DNAStar Inc., Madison, WI, USA);使用MEGA v7.0的Clustal W算法對(duì)所有樣本的DNA序列進(jìn)行比對(duì),將同一個(gè)體的3個(gè)cpDNA片段序列串聯(lián)作為一個(gè)整體進(jìn)行分析(Kumar et al., 2016)。在遺傳多樣性評(píng)估時(shí),將連續(xù)多堿基的插入/缺失突變視為單突變事件(Simmons &Ochoterena, 2000)。為減少誤差,樣本量少于3個(gè)的群體(KZSMY、GXKK)不用于群體遺傳多樣性分析。采用Arlequin軟件評(píng)估6個(gè)物種間的遺傳分化系數(shù)(FST),并用1 000次模擬運(yùn)算評(píng)估顯著性(Excoffier &Lischer, 2010)。

為評(píng)估魔芋6個(gè)物種之間的親緣關(guān)系及系統(tǒng)進(jìn)化地位,本研究使用IQ-TREE 1.6.12對(duì)cpDNA單倍型序列進(jìn)行核酸替代模型檢測(cè),構(gòu)建最大似然法(maximum likelihood,ML)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),運(yùn)行1 000次bootstrap檢測(cè)顯著性(Nguyen et al., 2014)。此外,采用SplitsTree 4.14.6對(duì)所有單倍型序列構(gòu)建Neighbor-Net樹(shù),評(píng)估魔芋種間的網(wǎng)狀進(jìn)化關(guān)系(Huson &Bryant, 2006)。

2 結(jié)果與分析

2.1 cpDNA序列擴(kuò)增

對(duì)來(lái)源于28個(gè)野生群體的170個(gè)樣本分別進(jìn)行cpDNA序列擴(kuò)增,3個(gè)cpDNA片段的電泳檢測(cè)結(jié)果表明,PCR目的產(chǎn)物條帶清晰,符合測(cè)序要求(圖1)。

2.2 基于cpDNA的物種遺傳變異與遺傳多樣性

經(jīng)樣本間的序列拼接和比對(duì),得到的3個(gè)葉綠體片段trnK-matK、rbcL和trnL的序列長(zhǎng)度分別為719、1 312、315 bp。將同一個(gè)體的3條序列串聯(lián)進(jìn)行整體分析,序列總長(zhǎng)度為2 346 bp。在所有樣本序列中檢測(cè)到128個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),其中插入/缺失突變位點(diǎn)78個(gè),共得到57個(gè)單倍型。遺傳多樣性分析表明,群體遺傳多樣性較低,核苷酸多樣性(用π表示)在0～0.009 31之間。在部分群體只有一個(gè)單倍型(26個(gè)群體中的12個(gè)),群體DW(疣柄魔芋)和NJZ(疣柄魔芋)具有最高的群體單倍型多樣性(Hd=1.0)。在物種水平,每個(gè)物種的單倍型數(shù)量從4到14不等,其中疣柄魔芋和東京魔芋的遺傳多樣性較高(表3)。在花魔芋、東京魔芋、西盟魔芋和滇魔芋的種內(nèi)群體間發(fā)現(xiàn)了共享單倍型,但6個(gè)物種之間沒(méi)有共有單倍型存在。物種間的兩兩遺傳分化表明,花魔芋和滇魔芋兩個(gè)物種間的遺傳分化系數(shù)最高(FST=0.942),而花魔芋和西盟魔芋的遺傳分化系數(shù)最低,FST為0.481(表4)。

2.3 魔芋屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

為評(píng)估魔芋屬各物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載的21個(gè)魔芋物種的cpDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析(表5),根據(jù)BIC(Bayesian information criterion)評(píng)分,HKY+F+R2模型被檢測(cè)為最優(yōu)核酸替換模型。最大似然樹(shù)表明,27個(gè)魔芋物種聚成3個(gè)主要分支,即非洲分支、東南亞分支和東亞大陸分支。本研究關(guān)注的6個(gè)物種則以較高的支持率分別被劃分在東亞大陸分支和東南亞分支,疣柄魔芋列入東南亞分支。東亞大陸分支又進(jìn)一步分化為兩支(分支A和分支B),分支A包含花魔芋和西盟魔芋,分支B由東亞魔芋、滇魔芋和東京魔芋構(gòu)成 (圖2)。Neighbor-Net網(wǎng)狀進(jìn)化分析的結(jié)果與ML樹(shù)基本一致, 支持東亞魔芋、滇魔芋和東京魔芋構(gòu)成一個(gè)分支且花魔芋與西盟魔芋的親緣關(guān)系較近的結(jié)論(圖3)。

M表示DL2000 Marker。M indicates DL2000 Marker.圖 1 部分樣本3個(gè)cpDNA片段 [rbcL (A)、trnL (B)、trnK-matK (C)]擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Electrophoretograms of amplification products of three cpDNA fragments [rbcL (A), trnL (B) and trnK-matK (C)]

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性與遺傳分化不僅能反映物種遺傳變異的高低,還能在一定程度上推斷群體的演化機(jī)制,為制定保護(hù)措施提供依據(jù)(王崢?lè)搴透饘W(xué)軍,2009)。本研究檢測(cè)到西南地區(qū)魔芋屬的6個(gè)物種存在低水平的群體遺傳多樣性,造成此現(xiàn)象的主要原因可能是植物的自身散布能力有限,西南山地的生境阻隔造成了群體遺傳多樣性降低(Gao et al., 2015)。我國(guó)西南山地的多種植物,如苦苣苔、胡黃連等, 也被報(bào)道由于隔離造成了低水平的群體遺傳多樣性(Gao et al., 2015; 李國(guó)棟等,2016; Wang et al., 2017)。此外,近年來(lái)西南地區(qū)野生魔芋的生境由于人為破壞呈破碎化狀態(tài),加劇了種群衰退和地理隔離,這是群體遺傳多樣性降低的人為因素(賀水蓮等,2016)。針對(duì)該情況,可根據(jù)魔芋的遺傳分化格局,確定核心種質(zhì)資源,通過(guò)建立群體種源保護(hù)地、種質(zhì)資源圃等多種措施來(lái)進(jìn)行保育(臧潤(rùn)國(guó)等,2016)。在物種水平上,滇魔芋的遺傳多樣性在6個(gè)物種中最低,預(yù)示著該物種適應(yīng)環(huán)境變化的能力較其他物種更弱,后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其野生群體的保護(hù)。

表 3 西南地區(qū)魔芋屬6個(gè)物種的cpDNA序列遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of six Amorphophallus species from Southwest China surveyed for cpDNA sequences

表 4 西南地區(qū)魔芋屬6個(gè)物種的種間遺傳分化系數(shù)(FST)Table 4 Genetic differentiation coefficient (FST) among six Amorphophallus species from Southwest China

表 5 本研究下載的魔芋cpDNA序列NCBI GenBank登錄號(hào)Table 5 Accession numbers of cpDNA sequences downloaded from NCBI GenBank in this study

系統(tǒng)發(fā)育分析表明魔芋屬物種按照地理分布形成3個(gè)主要分支,而東亞大陸的類(lèi)群則進(jìn)一步分化為兩支(Claudel et al., 2017)。目前對(duì)魔芋東亞大陸類(lèi)群分化為兩支的原因尚未有明確結(jié)論,兩個(gè)分支之間存在地域重疊,魔芋屬早期演化的快速擴(kuò)張可能導(dǎo)致了該分化格局(Claudel et al., 2017)。形態(tài)學(xué)研究認(rèn)為,東亞大陸兩個(gè)類(lèi)群間的果實(shí)顏色存在差異,可能與吸引相應(yīng)昆蟲(chóng)進(jìn)行種子散播有關(guān)(Claudel et al., 2017)。鑒于此,生態(tài)適應(yīng)可能也是東亞大陸類(lèi)群的分化機(jī)制之一。細(xì)胞學(xué)研究也為推斷該屬的演化歷史提供了一些佐證(張風(fēng)潔,2014)。學(xué)者認(rèn)為2n=26是魔芋屬的原始核型,2n=24和2n=28由減數(shù)分裂過(guò)程配子丟失或增加1條染色體造成,而2n=39則可能是由未正常減數(shù)分裂的配子(n=2x=26)與正常減數(shù)分裂的配子(n=x=13)雜交形成(Zhao et al., 2021)。針對(duì)本研究的物種,東南亞分支的疣柄魔芋和A.commutatus的染色體數(shù)量分別為2n=28和2n=26,東亞大陸分支的花魔芋、西盟魔芋、滇魔芋和謝君魔芋的染色體數(shù)目均為2n=26(張風(fēng)潔,2014)。目前染色體核型研究涉及的魔芋物種較少,后續(xù)需要解析更多物種的染色體組型,以期更深入了解魔芋屬的演化歷史及規(guī)律。

本研究鑒定了西南地區(qū)魔芋代表物種間的親緣關(guān)系,雖然我國(guó)魔芋栽培面積位居世界第一,但育種資源狹窄,當(dāng)前品種已不能滿足種植產(chǎn)業(yè)的需要。要解決魔芋的良種問(wèn)題,雜交育種不失為一種可行的解決方案。目前已有一些研究開(kāi)展了魔芋的種間雜交實(shí)驗(yàn),但需要注意因遠(yuǎn)緣雜交成功率低、子代不育等造成經(jīng)濟(jì)損失(劉二喜等,2020)。根據(jù)本研究得出的魔芋屬物種的親緣關(guān)系合理選擇雜交親本組合,可為今后魔芋的種質(zhì)創(chuàng)新、雜交育種及雜種優(yōu)勢(shì)群的構(gòu)建提供理論依據(jù)。

綜上所述,為對(duì)我國(guó)西南地區(qū)的魔芋野生資源進(jìn)行遺傳評(píng)價(jià),研究利用3個(gè)cpDNA標(biāo)記分析了魔芋屬6個(gè)物種的遺傳多樣性與遺傳分化,鑒定了各物種之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。研究結(jié)果表明,生境隔離和人為干擾可能導(dǎo)致了魔芋野生群體的遺傳多樣性降低,東亞大陸類(lèi)群分化為兩支可能與早期演化的快速擴(kuò)張和生態(tài)適應(yīng)相關(guān)。魔芋屬種間的親緣關(guān)系鑒定可為后續(xù)的野生資源利用奠定理論基礎(chǔ)。