聯(lián)合二代和三代測序技術(shù)鑒定新冠病毒

林 琦,黃枝妙,曾志偉,陳 煒,陳明建,翁育偉

新型冠狀病毒感染(Coronavirus Disease 2019, COVID-19)是由新型冠狀病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的急性呼吸道傳染病。SARS-CoV-2屬于β屬冠狀病毒,主要通過呼吸道飛沫和密切接觸等途徑傳播[1-3]。隨著全球COVID-19持續(xù)流行,SARS-CoV-2不斷發(fā)生變異并導(dǎo)致其傳播力和致病性發(fā)生改變。目前,Omicron變異株已成為國內(nèi)外主要流行毒株,雖然在流行過程中其致病力明顯減弱,但其潛伏期縮短(2～4 d)、傳播力變強(qiáng)、傳播速度變快,免疫逃逸能力增強(qiáng),對全球COVID-19防控提出了新挑戰(zhàn)[4-5]。

及時(shí)發(fā)現(xiàn)各種SARS-CoV-2的新型變異株,了解其生物學(xué)及流行病學(xué)特征,是當(dāng)前COVID-19防控的重要手段,因此高通量測序技術(shù)大量應(yīng)用于新冠疫情防控工作中。目前,SARS-CoV-2高通量測序主要包括Illumina[6]、Ion Genestudio S5[7]和MGI[8]等二代測序平臺,以及Oxford nanopore[9]和Pacific bioscience[10]等三代測序平臺。其中Illumina和Oxford nanopore使用的更為廣泛。不同測序平臺的測序結(jié)果各有優(yōu)缺點(diǎn),如以O(shè)xford nanopore為代表的三代測序平臺的測序速度快,但其測序的精度尚有不足;而以Illumina為代表的二代測序平臺的測序精度高,但耗時(shí)較長,測序過程相對復(fù)雜[11-12]。在新冠防控工作具體實(shí)踐特別是在新冠疫情處置中,對測序要求既要“快速”又要“精準(zhǔn)”,因此需要兼顧測序的實(shí)效性和精確性。本研究采用三代和二代測序聯(lián)用的方式,測定了福建省2例BQ.1進(jìn)化分支病毒感染的輸入性COVID-19的病毒全基因組序列,并對其進(jìn)行了變異和進(jìn)化分析。在及時(shí)準(zhǔn)確判斷病毒變異類型的前提下,為研判和預(yù)測疫情提供了準(zhǔn)確的病原學(xué)信息。

1 材料與方法

1.1 病例基本信息 病例A和B均為男性,波蘭人,年齡分別為65歲和63歲,同為某船務(wù)代理公司船員。病例A已接種4劑次輝瑞mRNA新冠疫苗,病例B疫苗接種史不詳。兩病例于2022年10月6日從波蘭抵達(dá)上海并隔離,10月16日從上海乘機(jī)抵達(dá)福州市,隨后由專車接往寧德市,入住酒店后均未外出。兩病例10月18日核酸檢測結(jié)果為陽性,均無明顯發(fā)熱、咳嗽、流涕等癥狀。兩病例的鼻咽拭子標(biāo)本被送至福建省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行全基因組測序。

1.2 核酸提取及real-time RT-PCR復(fù)核 使用磁珠法核酸提取試劑盒(貨號:T014,西安天隆)提取陽性病例鼻咽拭子標(biāo)本中的病毒RNA。利用SARS-CoV-2核酸檢測試劑盒(貨號:DA0932,廣州達(dá)安)對提取的RNA進(jìn)行real-time RT-PCR復(fù)核。留取復(fù)核后的陽性核酸于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒全基因組測序 使用二步法長片段新冠病毒全基因組捕獲試劑盒(貨號:BK-WCoV024IITS,杭州柏熠)進(jìn)行病毒全基因組擴(kuò)增,按照Rapid Barcoding Kit(貨號:SQK-RBK004,Oxford Nanopore)操作步驟構(gòu)建三代測序文庫,使用Oxford Nanopore MinION MK1C三代測序儀進(jìn)行測序,采用柏熠新冠病毒全基因組分析系統(tǒng)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和病毒全基因組序列拼接。二代測序采用ULSEN超靈敏度新型冠狀病毒全基因組捕獲試劑盒(貨號:V-090418-1,北京微未來)進(jìn)行病毒全基因組擴(kuò)增,按照Nextera XT DNA Library Preparation Kit(貨號:FC-131-1096,Illumina)操作步驟構(gòu)建二代測序文庫,使用Illumina Miseq二代測序儀進(jìn)行測序,以Wuhan-Hu-1(NC_045512.2)基因組作為參考序列,使用CLC Genomics Workbench軟件(ver.23.0)對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行病毒全基因組序列組裝拼接。

1.4 全基因組序列分析 使用SARS-CoV-2分型系統(tǒng)Pangolin(https://pangolin.cog-uk.io/)對測定的病毒全基因序列進(jìn)行分型[13-14];通過在線工具Nextclade(https://clades.nextstrain.org/)對序列拼接結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量檢查;從GISAID(https://www.gisaid.org)上篩選和下載同源序列以及不同Omicron亞分支變異株的代表序列作為參比序列,采用MAFFT軟件(ver.7.0)(https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)進(jìn)行多序列比對,使用MEGA軟件(ver.6.0)的NJ法(Bootstrap=1000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;使用Interactive Tree Of Life (https://itol.embl.de/)對進(jìn)化樹進(jìn)行注釋;使用Nextclade的SARS-CoV-2變異分析模塊對病毒全基因組序列進(jìn)行核苷酸與氨基酸突變分析、ACE2受體親和力及免疫逃逸能力預(yù)測[15]。

2 結(jié) 果

2.1 核酸復(fù)核結(jié)果 Real-time RT-PCR檢測病例A和B的鼻咽拭子核酸提取物,結(jié)果均為SARS-CoV-2核酸陽性,復(fù)核后的Ct值(ORF1ab/N)分別為:27.51/25.41、19.75/18.86,均滿足COVID-19診療方案(第九版)[16]要求的病毒全基因組測序標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 全基因組測序 采用三代測序技術(shù)從病例A的鼻咽拭子標(biāo)本中測得1株SARS-CoV-2全基因組序列,序列長度為28 910 bp,基因組覆蓋度為89.8%(<99.0%),平均測序深度為1 129×,Pangolin分型結(jié)果顯示病例A感染病毒屬于Omicron變異株BQ.1亞分支,但質(zhì)控分析顯示三代測序所獲序列存在基因組覆蓋度不足、因重復(fù)性堿基測序缺失引起的氨基酸翻譯錯(cuò)誤(移碼)等問題(詳見表1)。采用二代測序技術(shù)從兩病例標(biāo)本中測得2株SARS-CoV-2全基因組序列,序列長度分別為29 665 bp和29 682 bp,基因組覆蓋度分別99.3%和99.6%(均>99.0%),平均測序深度分別為2 973×和3 695×,Pangolin分型結(jié)果均為Omicron BQ.1變異株,與三代測序病毒分型結(jié)果一致;質(zhì)控分析顯示二代測序所獲2株SARS-CoV-2全基因組序列的完整度、基因組覆蓋度、測序深度、刺突蛋白(S蛋白)完整性等均較好,氨基酸翻譯正確無移碼,表明二代測序獲得的2株病毒序列均屬于高質(zhì)量序列,詳見表1。

表1 SARS-CoV-2全基因組測序質(zhì)量分析結(jié)果

2.3 全基因組進(jìn)化分析 根據(jù)病毒的分型結(jié)果,從GISAID數(shù)據(jù)庫中篩選并下載同源序列及不同Omicron亞分支的代表性序列作為參比序列,包括:BQ.1、BA.3、BA.4、BA.5、BA.5.1、BA.5.2、BA.5.3、BA.5.3.1、BF.7、XBB等10種Omicron亞分支。以Wuhan-Hu-1(NC_045512.2)作為“樹根”(Root),將篩選出的68條參比序列與2株SARS-CoV-2基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,2株SARS-CoV-2基因組序列(2022XG-2599、2022XG-2600)共同處于Omicron變異株BQ.1進(jìn)化亞分支上,且位于同一進(jìn)化簇,表明2株SARS-CoV-2高度同源,見圖1。

注:●表示武漢參考株序列Wuhan-Hu-1(NC_045512.2);▲表示本研究2株SARS-CoV-2全基因組序列;10種不同的Omicron亞分支序列用不同背景色顯示,亞分支名稱標(biāo)注在環(huán)形進(jìn)化樹外側(cè)。

2.4 全基因組突變分析 用二代測序結(jié)果進(jìn)行SARS-CoV-2全基因組突變分析。結(jié)果顯示,同Wuhan-Hu-1相比,2022XG-2599(病例A)全基因組序列共有77個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)(不計(jì)缺失/插入突變),其中1個(gè)突變位點(diǎn)位于5′UTR區(qū)域,76個(gè)突變位點(diǎn)位于蛋白編碼區(qū)。蛋白編碼區(qū)核苷酸突變涉及8種病毒蛋白編碼序列,包括2種非結(jié)構(gòu)蛋白、4種結(jié)構(gòu)蛋白和2種輔助蛋白。蛋白編碼區(qū)核苷酸突變導(dǎo)致57個(gè)錯(cuò)義突變和19個(gè)同義突變,主要突變發(fā)生在S蛋白(32個(gè))、ORF1a蛋白(18個(gè))、ORF1b蛋白(10個(gè))和 N蛋白(7個(gè))編碼區(qū)。在2022XG-2599全基因組氨基酸突變中,除S蛋白區(qū)A27S突變和第24-26位氨基酸缺失外,其余突變均屬于Omicron變異株BQ.1亞分支的特征性氨基酸突變(75%以上該型別變異株共有的突變位點(diǎn));同時(shí)S蛋白中的氨基酸突變中有19個(gè)位于受體結(jié)合域(receptor binding domain,RBD)(詳見表2)。2022XG-2600(病例B)序列與2022XG-2599雖然在全基因組長度及覆蓋度上有微小差異(序列長度相差17 bp,覆蓋度相0.3%),但二者共享全部核苷酸與氨基酸突變位點(diǎn)(詳見表2)。

2.5 受體親和力及免疫逃逸能力預(yù)測 通過Nextclade在線預(yù)測本研究2株SARS-CoV-2的RBD氨基酸突變對人體細(xì)胞表面血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensinconverting enzyme 2,ACE2)受體的親和力及逃避中和抗體識別能力(免疫逃逸)的影響。結(jié)果顯示,以O(shè)micron變異株BA.2亞型為參照毒株,2株SARS-CoV-2的ACE2受體親和力評估值均為0.66,即ACE2受體的親和力比BA.2亞型高出約4.6倍(10∧0.66≈4.6);以O(shè)micron變異株BA.2亞型為參照毒株, 2株SARS-CoV-2的中和抗體逃逸能力評估值均為0.63,即只保留了約53.3%(e∧0.63≈0.533)BA.2亞型的抗體中和活性。預(yù)測結(jié)果表明本研究2株SARS-CoV-2較Omicron變異株BA.2亞型可能在ACE2受體親和力和免疫逃逸能力方面均有明顯提升。

3 討 論

本研究聯(lián)合采用Illumina Miseq(二代測序)和Nanopore MinION(三代測序)兩種高通量測序技術(shù),成功自2例COVID-19病例鼻咽拭子標(biāo)本中獲得SARS-CoV-2全基因組序列,分型結(jié)果顯示2株病毒均屬于Omicron BQ.1變異株,為福建省內(nèi)首次鑒定到的BQ.1病例;同時(shí)結(jié)合流行病學(xué)資料,推測兩例病例可能自境外輸入,并暴露于同一傳染源。本研究采用三代測序?qū)?biāo)本進(jìn)行測序,從核酸提取到獲得病毒全基因組序列僅用7 h,能夠初步鑒定出病毒型別屬于Omicron變異株BQ.1進(jìn)化分支,但僅成功測得1例病例病毒序列,且基因組覆蓋度低于99.0%,不能準(zhǔn)確分析病毒全基因組突變情況;采用二代測序則成功獲得兩例病例的病毒基因組序列,且基因組覆蓋度和測序深度均優(yōu)于三代測序,分型結(jié)果與三代測序一致,為后續(xù)基于突變的病毒精準(zhǔn)溯源提供可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ),但耗時(shí)相對較長(20～22 h)。盡管Nanopore三代測序偶爾會出現(xiàn)連續(xù)堿基區(qū)域測序缺失的問題,使其測序準(zhǔn)確度受影響,但由于其耗時(shí)相對較短(6～8 h),因此能夠在疫情暴發(fā)初期迅速鑒別新型變異株,有利于第一時(shí)間發(fā)現(xiàn)感染源[17]。Illumina二代測序雖然耗時(shí)較長,但其測序錯(cuò)誤率相對較低,能夠更準(zhǔn)確分析病毒全基因組的突變情況,有利于精準(zhǔn)分析病毒傳播鏈和研判疫情傳播態(tài)勢。本研究結(jié)合不同測序技術(shù)的優(yōu)點(diǎn),將三代和二代測序技術(shù)聯(lián)用,既滿足了測序的時(shí)效性又解決了測序的準(zhǔn)確性問題,這種測序模式能夠從不同應(yīng)用層面更好地為疫情風(fēng)險(xiǎn)評估、流行病學(xué)監(jiān)測及公共衛(wèi)生決策提供技術(shù)支持。

2022年7月,尼日利亞首次報(bào)道了Omicron變異株BQ.1亞型感染病例,之后BQ.1便在歐洲和北美迅速擴(kuò)散,BQ.1是Omicron變異株BA.5分支在人群流行過程中變異產(chǎn)生的亞分支,該變異株在S蛋白的一些關(guān)鍵抗原位點(diǎn)上發(fā)生突變,這些突變賦予其免疫逃逸優(yōu)勢,使其具有較高的再感染和疫苗突破潛力,可能會導(dǎo)致全球范圍內(nèi)的感染和死亡病例數(shù)量激增,將對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成新的威脅[18-19]。WHO將BQ.1變異株定義為VUMs(Currently circulating variants under monitoring)[20],WHO的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[21],2023年第3～7周,BQ.1系列變異株在所有VUMs中的周流行率為20.03%～36.40%,已累計(jì)在133個(gè)國家檢測到。BQ.1變異株的S蛋白在BA.5變異株基礎(chǔ)上新增K444T和N460K特征性突變位點(diǎn),本研究2株BQ.1變異株在RBD區(qū)均含有這2個(gè)突變位點(diǎn),有研究顯示[22],K444T和N460K的組合突變拓展了氫鍵相互作用的網(wǎng)絡(luò),可能有利于對中和抗體的抵抗,從而增強(qiáng)了其免疫逃避能力。RBD是介導(dǎo)S蛋白與ACE2受體結(jié)合和誘導(dǎo)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生中和抗體的重要結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域突變可能會導(dǎo)致病毒免疫逃逸能力增強(qiáng)和影響疫苗免疫效果[23-24]。本研究2株BQ.1變異株在RBD區(qū)包含19個(gè)氨基酸突變,其中K417N、L452R、S477N、N501Y等是WHO定義的MOI(Mutation of Interest)位點(diǎn),對其人群適應(yīng)性具有重要作用[25-26]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[27],Omicron變異株可能通過RBD區(qū)氨基酸殘基組合的趨同突變來逃避抗體的中和作用,同時(shí)又保持足夠的ACE2結(jié)合能力,如N460K、F486V與N460K組合、L452R與F486S/V組合、K444N/T與F486V組合等。本研究2株BQ.1變異株在RBD區(qū)出現(xiàn)了K444T、L452R、N460K、F486V等熱點(diǎn)突變,這些突變的不同組合可能對變異株的免疫逃避能力和ACE2受體親和力產(chǎn)生趨同作用。這與在線軟件預(yù)測的2株BQ.1變異株的ACE2受體親和力及免疫逃逸能力結(jié)果一致,表明變異株的生物學(xué)特性可能發(fā)生較明顯變化,需給予持續(xù)監(jiān)測。當(dāng)前SARS-CoV-2疫苗保護(hù)效力及BQ.1變異株可能導(dǎo)致突破性感染和再感染風(fēng)險(xiǎn)還需要進(jìn)一步研究。

當(dāng)前我國疫情防控已進(jìn)入新階段,隨著入境政策的優(yōu)化調(diào)整,更多SARS-CoV-2新型變異株將持續(xù)輸入國內(nèi)并引起本土流行傳播,通過對具有代表性的新冠病毒感染者樣本進(jìn)行病毒全基因組測序和突變分析,可以動態(tài)監(jiān)測本土流行的變異株組成和分布,及時(shí)發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外重點(diǎn)關(guān)注變異株,評估變異株的傳播力、致病力和免疫逃逸能力等變化和風(fēng)險(xiǎn)研判,為本土新增SARS-CoV-2變異株的大規(guī)模傳播提供早期預(yù)警。本研究采用二代和三代測序技術(shù)聯(lián)用進(jìn)行病毒基因組測序,兼顧了準(zhǔn)確性和時(shí)效性,可為SARS-CoV-2變異監(jiān)測工作及制定疫情防控策略提供技術(shù)參考與支持。

利益沖突：無