生物絮團(tuán)濃度和枯草芽孢桿菌添加量對(duì)生物絮團(tuán)主要性能的影響

徐思行,賀 希,陳 菲,俞奇力,羅國(guó)芝 ,,3

(1 上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心,上海 201306;2 杭州蕭山東海養(yǎng)殖有限責(zé)任公司,浙江 杭州 311200;3 上海市水產(chǎn)動(dòng)物良種創(chuàng)制與綠色養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心,上海海洋大學(xué),上海 201306)

生物絮團(tuán)技術(shù)(Biofloc Technology,BFT)通過(guò)添加有機(jī)碳源維持水體碳氮比(C/N)在15以上,促使異養(yǎng)細(xì)菌同化氨氮優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng),和水體中顆粒物結(jié)合形成以微生物為主的生物絮團(tuán)[1]。生物絮團(tuán)既能去除水體氨氮、硝酸鹽氮等無(wú)機(jī)氮,對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物也具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。BFT可以較低成本實(shí)現(xiàn)封閉、高密度水產(chǎn)養(yǎng)殖[2],近年來(lái)受到國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖者的普遍關(guān)注。

碳源種類(lèi)、碳源添加方式、碳源濃度、C/N、鹽度、絮團(tuán)粒徑大小等操作因素對(duì)生物絮團(tuán)性能有明顯影響[3-4],其中生物絮團(tuán)濃度是生物絮團(tuán)養(yǎng)殖過(guò)程中重點(diǎn)控制參數(shù)[5]。絮團(tuán)量太低氨氮處理能力低,生物絮團(tuán)量太高,會(huì)增加系統(tǒng)中的氧氣消耗,且可能會(huì)對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生脅迫[6]。有研究者認(rèn)為生物絮團(tuán)量宜控制在500～600 mg/L[7]?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis,B.subtilis)是水產(chǎn)養(yǎng)殖常用益生菌[8]。已有研究表明,向絮團(tuán)水體中添加B.subtilis可提高生物絮團(tuán)粗蛋白和部分氨基酸組成含量,有利于為養(yǎng)殖對(duì)象提供更好的營(yíng)養(yǎng)[8]。

研究了生物絮團(tuán)濃度(以總懸浮顆粒物濃度表征)與B.subtilis添加量對(duì)生物絮團(tuán)系統(tǒng)中氨氮去除、生物絮團(tuán)營(yíng)養(yǎng)組成的影響,為生物絮團(tuán)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

生物絮團(tuán)已提前培養(yǎng)好且性能良好[8]。使用18個(gè)250 mL錐形瓶并接種100 mL絮團(tuán)。每個(gè)錐形瓶中裝2個(gè)規(guī)格相同的石英砂曝氣石,曝氣石連接一個(gè)100 W空氣泵,維持反應(yīng)器溶氧(DO)大于5 mg/L和生物絮團(tuán)呈懸浮狀態(tài)。試驗(yàn)期間添加適量碳酸氫鈉(NaHCO3)調(diào)整水體堿度在250 mg/L CaCO3左右。

1.2 方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌來(lái)源與添加量

使用的B.subtilis種子液購(gòu)自中國(guó)微生物菌種網(wǎng),試驗(yàn)時(shí)在100 mL 2216E培養(yǎng)液中接入2%種子液,在培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)20 h后,用LB培養(yǎng)基平板計(jì)數(shù)法分別稀釋10、102、103、104、105、106、107倍,用涂布棒快速均勻地將稀釋后的菌液涂布,每個(gè)稀釋倍數(shù)兩個(gè)重復(fù),繼續(xù)培養(yǎng)20 h后用30～300 CFU/mL平板計(jì)數(shù)。根據(jù)菌落數(shù)目和種子液的稀釋倍數(shù)計(jì)算出稀釋后的菌濃度。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

B.subtilis添加量分別為104CFU/mL(A)、105CFU/mL(B)和106CFU/mL(C),每種添加量設(shè)置300 mg/L和600 mg/L生物絮團(tuán)濃度,分別用A-300、A-600、B-300、B-600、C-300、C-600表示,每組3個(gè)平行。添加10 mg/L氨氮(38.46 mg/L氯化銨)至錐形瓶中,再添加葡萄糖使水體溶解有機(jī)碳(dissolved organic carbon,DOC)與總氮比為15。每間隔0.5 h進(jìn)行主要水質(zhì)指標(biāo)連續(xù)監(jiān)測(cè)。總氨氮降至0.5 mg/L以下時(shí)視為試驗(yàn)結(jié)束。取試驗(yàn)結(jié)束時(shí)絮團(tuán),測(cè)定絮團(tuán)營(yíng)養(yǎng)組成和主要氮素代謝功能基因拷貝數(shù)。

1.2.3 主要水質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

1.2.4 氨氮去除效率

TAN去除效率按下式計(jì)算:

R= (Ci-Ce)/Ci×100%

(1)

式中:R為T(mén)AN的去除效率(%);Ci為初始的TAN質(zhì)量濃度(mg/L);Ce為終末的TAN質(zhì)量濃度(mg/L)。

1.2.5 生物絮團(tuán)性能指標(biāo)

將取得的生物絮團(tuán)在65℃條件下烘干至恒重,用碳氮元素分析儀(Elmenter Vario Max,德國(guó))測(cè)定碳、氮元素質(zhì)量。生物絮團(tuán)粗蛋白含量用測(cè)得的氮素乘以6.25估算[9],粗灰分含量用稱重法測(cè)定,總脂肪含量用氯仿-甲醇法測(cè)定,氨基酸相對(duì)含量用氨基酸分析儀測(cè)定(氨基酸分析儀L-8800,日立公司)。生物絮團(tuán)沉降性能用5 min絮團(tuán)沉降體積(Bioflocs volume index in 5 minutes,FVI-5)表征,具體測(cè)試方法為:使用英霍夫式(Imhoff)錐形管從生物絮團(tuán)反應(yīng)器中取100 mL混合均勻的水樣(含絮團(tuán)),靜置5 min后,讀取沉淀絮團(tuán)的體積,單位為mL/L。

1.2.6 絮團(tuán)相關(guān)功能基因拷貝數(shù)

從反應(yīng)器中取50 mL混合均勻的水樣,0.22 μm無(wú)菌微孔濾膜過(guò)濾,將截留了絮團(tuán)的濾膜剪碎放進(jìn)5 ml無(wú)菌離心管,零下80 ℃冰箱中保存,送上海微基生物有限公司采用Real-time PCR對(duì)ureC、AOB、nxrA、Hao進(jìn)行基因拷貝數(shù)測(cè)定,所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 ureC、AOB、nxrA、Hao基因引物Tab.1 The Gene Primers of ureC,AOB,nxrA and Hao

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì),用Origin 8.5進(jìn)行相關(guān)圖表繪制。試驗(yàn)數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)形式表示,采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件Tukey方法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行組間多重比較分析,顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 各處理組的主要水質(zhì)指標(biāo)情況

各試驗(yàn)組溶氧、水溫、pH和堿度等指標(biāo)差異不顯著(表2)(P>0.05)。

表2 試驗(yàn)期間各組主要水質(zhì)指標(biāo)平均值和范圍Tab.2 Mean values and ranges of primary water quality parameters in experiment groups during the experimental period

表3 不同處理組絮團(tuán)粗蛋白、粗脂肪、粗灰分含量和C/NTab.3 Crude protein,crude ash,crude fat content and C/N of bioflocs

8 h內(nèi)各組氨氮去除率均在99%以上(圖1)。

圖2 各組生物絮團(tuán)的硝化功能基因拷貝數(shù)Fig.2 Copies of ureC,amoA,nxrA and Hao in bioflocs of the experiment groups

2.2 生物絮團(tuán)硝化作用功能基因拷貝數(shù)

各組絮團(tuán)amoA、ureC,Hao拷貝數(shù)隨B.subtilis添加量升高而顯著升高。B.subtilis添加量為104CFU/mL的A-300和A-600組nxrA基因拷貝數(shù)高于添加量為105CFU/mL和106CFU/mL組(P<0.05)。絮團(tuán)懸浮物質(zhì)量濃度為600 mg/L各基因拷貝數(shù)高于生物絮團(tuán)質(zhì)量濃度為300 mg/L組,但差異不顯著。

標(biāo)有不同字母表示組間有顯著性差異(P<0.05),標(biāo)有相同字母表示組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)

2.3 生物絮團(tuán)營(yíng)養(yǎng)組成

B.subtilis添加量為105CFU/mL的試驗(yàn)組絮團(tuán)粗脂肪含量高于其他兩組。B.subtilis添加量為106CFU/mL試驗(yàn)組粗蛋白含量高于其他兩組(P<0.05)。B.subtilis添加量對(duì)絮團(tuán)粗脂肪、粗蛋白、C/N影響顯著(P<0.05),絮團(tuán)濃度對(duì)生物絮團(tuán)粗脂肪、粗灰分、粗蛋白、C/N影響不顯著(P>0.05)。

絮團(tuán)濃度對(duì)Ser、Glu、Gly、Met、His、Pro含量影響不顯著 (P>0.05),對(duì)其余氨基酸含量影響顯著(P<0.05)。B.subtilis添加量對(duì)Ser、Glu、Gly、Ala、Tyr、Lys含量影響不顯著,對(duì)其余氨基酸影響顯著(P<0.05)。B.subtilis添加量為106CFU/mL組(C-300,C-600)的絮團(tuán)氨基酸含量高于B.subtilis添加量為104CFU/mL組(A-300,A-600)(表4)。

表4 各組生物絮團(tuán)17種氨基酸相對(duì)含量(%干重)Tab.4 The contents of 17 amino acids in the bioflocs of the experimental groups (Dry weight %)

除Ser、Gly、Lys、His以外,B.subtilis添加量為105CFU/mL組(B-300,B-600)的絮團(tuán)氨基酸含量均高于B.subtilis添加量為104CFU/mL組(A-300,A-600)。

3 討論

3.1 絮團(tuán)濃度和枯草芽孢桿菌添加量對(duì)絮團(tuán)氨氮去除速率的影響

生物絮團(tuán)系統(tǒng)中滯留了絕大部分未被養(yǎng)殖對(duì)象利用的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),再加上絮團(tuán)的絮狀結(jié)構(gòu)[4],可為多種微生物的生長(zhǎng)提供適宜環(huán)境,進(jìn)而為無(wú)機(jī)氮的多種代謝通路提供可能性[11]。生物絮團(tuán)系統(tǒng)中的氨氮可被異養(yǎng)同化為有機(jī)氮,也可能會(huì)被自養(yǎng)硝化或異養(yǎng)硝化成硝酸鹽氮[1];產(chǎn)生的硝酸鹽氮可能被反硝化為氮?dú)狻⑼癁橛袡C(jī)氮或異化還原成氨氮[12];水體中的亞硝酸鹽氮可能來(lái)源于不完全硝化、不完全反硝化、硝酸鹽異化還原(DNRA)等過(guò)程[4]。因此,生物絮團(tuán)可能同時(shí)具有高效的氨氮同化、自養(yǎng)硝化、反硝化等功能。在按照C/N=15補(bǔ)充有機(jī)碳源的條件下,各組添加的10 mg/L氨氮均在3～ 9 h降至0.5 mg/L以下(圖1a),說(shuō)明本試驗(yàn)使用的生物絮團(tuán)氨氮處理能力良好[13-15]。試驗(yàn)過(guò)程匯總亞硝酸鹽氮濃度的增加可能是因?yàn)榘l(fā)生了不完全的硝化過(guò)程、不完全的反硝化過(guò)程或/和不完全的DNRA過(guò)程[4,16]。A-300組硝酸鹽氮濃度增加,但總氮濃度降低(圖1c、d),這說(shuō)明A-300組可能有較明顯的硝化過(guò)程和反硝化過(guò)程。A-600組硝酸鹽氮濃度降低但總氮濃度增加(圖1c、d),這說(shuō)明可能發(fā)生了明顯的同化過(guò)程。

芽孢桿菌具有良好的水質(zhì)凈化能力,能夠有效修復(fù)受污染水體,在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中,常用芽孢桿菌去除水體中氨氮[17]。Oliveira等[18]在活性污泥中加入芽孢桿菌能夠優(yōu)化活性污泥的菌群結(jié)構(gòu),提高了水處理性能。劉屬彬等[19]研究了B.subtilis在養(yǎng)殖廢水和模擬廢水去除氨氮的效果,表明B.subtilis是凈化水質(zhì)的良好微生物。本研究中B.subtilis添加量對(duì)生物絮團(tuán)去除氨氮的效率有顯著影響,添加量為106CFU/mL的組的TAN去除速率顯著高于B.subtilis添加量為104CFU/mL和105CFU/mL (P<0.05)。這說(shuō)明本研究構(gòu)建的生物絮團(tuán)反應(yīng)環(huán)境能夠滿足B.subtilis生長(zhǎng)需求。后續(xù)應(yīng)開(kāi)展關(guān)于更高B.subtilis添加量對(duì)生物絮團(tuán)TAN去除效率影響的研究。生物絮團(tuán)附著的微生物能夠有效去除水體中的氨氮、硝酸氮等,絮團(tuán)濃度越高,附著的微生物數(shù)量越多,氨氮處理能力越強(qiáng)。本研究中絮團(tuán)質(zhì)量濃度為600 mg/L處理組的氨氮處理效率明顯高于絮團(tuán)質(zhì)量濃度為300 mg/L的處理組,這和Chen等[20]和Luo 等[21]的研究結(jié)果相同。

3.2 絮團(tuán)濃度和枯草芽孢桿菌添加量對(duì)氮素代謝相關(guān)功能基因的影響

3.3 絮團(tuán)濃度和草芽孢桿菌添加量對(duì)絮團(tuán)營(yíng)養(yǎng)組成的影響

生物絮團(tuán)優(yōu)勢(shì)菌群的組成情況會(huì)影響絮團(tuán)營(yíng)養(yǎng)組成,這可能是因?yàn)椴煌?xì)菌分泌的胞外聚合物性質(zhì)不同,導(dǎo)致絮團(tuán)營(yíng)養(yǎng)成分組成的差異[26-28]。本研究中B.subtilis添加量為106CFU/mL時(shí),生物絮團(tuán)中各氨基酸濃度高于B.subtilis添加量分別為104CFU/mL和105CFU/mL的試驗(yàn)組。其可能原因是B.subtilis添加量為106CFU/mL時(shí),B.subtilis添加劑在絮團(tuán)中富集生長(zhǎng),形成優(yōu)勢(shì)菌,影響了絮團(tuán)營(yíng)養(yǎng)成分。生物絮團(tuán)水體中異養(yǎng)細(xì)菌含量的提高,水體中氨氮、硝酸鹽氮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠更加高效地被生物絮團(tuán)利用[29-30],與本研究結(jié)果一致。研究方案設(shè)計(jì)時(shí)考慮到實(shí)際操作成本,本研究沒(méi)有設(shè)計(jì)更高濃度的B.subtilis添加量,這不排除添加量越高、粗蛋白提高效果越明顯的可能性,需要進(jìn)一步確認(rèn)。

4 結(jié)論

添加枯草芽孢桿菌能夠提高生物絮團(tuán)中各氨基酸含量和粗蛋白含量以及氨氮去除效率。在按照C/N=15補(bǔ)充有機(jī)碳源條件下,生物絮團(tuán)質(zhì)量濃度為600 mg/L時(shí)添加106CFU/mL枯草芽孢桿菌,可取得較好的生物絮團(tuán)氨氮去除速率和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。