超聲輔助美拉德反應(yīng)對鰱魚酶解產(chǎn)物風(fēng)味特性的影響

王玉婷,肖乃勇,施文正,2

(1 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2 國家淡水水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)分中心,上海 201306)

鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)是中國養(yǎng)殖產(chǎn)量較高的低值淡水魚類,其蛋白質(zhì)豐富、氨基酸種類齊全,具有較高的營養(yǎng)價值[1]。2021年鰱魚總產(chǎn)量為383.66萬t,約占中國淡水養(yǎng)殖魚類總產(chǎn)量的15%[2]。然而,由于刺多、腥味重并且魚體內(nèi)部組織酶活躍,大量滯銷的鰱魚易發(fā)生腐敗變質(zhì),造成了資源的浪費和環(huán)境污染。目前,鰱魚主要以鮮銷和初級加工產(chǎn)品為主(如腌制[3]、魚排[4]和冷凍產(chǎn)品[5]等),但原料魚肉風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)不佳,且在加工、運輸過程中操作不當(dāng)極易造成蛋白質(zhì)的損耗或營養(yǎng)物質(zhì)的流失,利用率低于60%[6],因此開發(fā)淡水魚類深加工新技術(shù)以提高其附加值和營養(yǎng)價值已成為近年來的研究熱點。對于鰱魚的深加工,一般通過溫和的酶解技術(shù)將鰱魚蛋白轉(zhuǎn)化為分子量較小的水解物或多肽,利用率高達(dá)90%[7],它優(yōu)于傳統(tǒng)的堿法或酸法,無有機溶劑的加入[8]。酶解法是一種從食用材料中提取風(fēng)味物質(zhì)的重要技術(shù),但酶解產(chǎn)物一般不具有顯著的風(fēng)味特征。此外,有研究發(fā)現(xiàn)通過深度酶解得到的鰱魚酶解產(chǎn)物大多會產(chǎn)生不好的味道(如魚腥味和苦味)[9]。因此,需要探索一種有效、安全的方法來改善水解物的風(fēng)味特征。

美拉德反應(yīng)是還原糖和蛋白質(zhì)、肽或氨基酸之間一系列復(fù)雜的非酶褐變反應(yīng)[10],在初級階段會形成各種各樣的風(fēng)味物質(zhì)(如糠醛、乙醛和丙酮醛),而類黑精等褐色含氮物質(zhì)來自美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物,決定了食品的色澤和風(fēng)味[11]。這些美拉德反應(yīng)產(chǎn)物是提高多肽或水解物風(fēng)味特性的有效增強劑,在食品領(lǐng)域引起了廣泛關(guān)注[12]。超聲波是一種綠色、安全、高效的加工技術(shù),其強烈的機械作用和空穴效應(yīng)使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)及構(gòu)象發(fā)生改變[13],并且在較好地保留食品自身特性的基礎(chǔ)上,可以提高反應(yīng)產(chǎn)率。Yu等[14]在葡萄糖-甘氨酸模型體系中進(jìn)行超聲輔助美拉德反應(yīng)技術(shù)的研究,可以生成更多的香味化合物,氣味閾值更低,濃度更高。此外,有相關(guān)報道表明,超聲處理也有助于酶解物中更多類型揮發(fā)性化合物的生成。Ong等[15]研究發(fā)現(xiàn)具有更長/更多側(cè)鏈的吡嗪在超聲-美拉德反應(yīng)模型系統(tǒng)中生成量大于熱反應(yīng)。Dong等[16]研究得出經(jīng)過超聲預(yù)處理后貽貝肉水解蛋白的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有豐富的肉類和海鮮風(fēng)味,但苦味較熱處理后的樣品低。目前,關(guān)于以鰱魚酶解產(chǎn)物為基料的風(fēng)味改良技術(shù)的研究較少。因此,尋找改善鰱魚酶解產(chǎn)物風(fēng)味的潛在加工方法是十分必要的。

本研究以鰱魚為原料,采用超聲輔助美拉德反應(yīng)技術(shù)處理鰱魚酶解產(chǎn)物制得超聲-美拉德反應(yīng)產(chǎn)物,以未經(jīng)超聲處理的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和鰱魚酶解產(chǎn)物作為對照,對其進(jìn)行中間產(chǎn)物、褐變程度、熒光強度、游離氨基酸含量、電子舌以及揮發(fā)性成分等指標(biāo)的測定,探索超聲輔助美拉德反應(yīng)對鰱魚酶解產(chǎn)物風(fēng)味的影響,以期為鰱魚資源的高值化利用和淡水魚調(diào)味基料的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鰱,購于上海市浦東新區(qū)南匯新城鎮(zhèn)黃衛(wèi)興水產(chǎn)店;堿性蛋白酶(200 000 U/g)、木瓜蛋白酶(100 000 U/g)、木糖、三氯乙酸(分析純),購于北京索萊寶科技有限公司;2,4,6-三甲基吡啶,購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

H-2050R型高速冷凍離心機,長沙湘儀有限公司;SB-400DTY超聲波多頻清洗機,寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-6型數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋,常州鴻澤實驗科技有限公司;FE28型pH計,梅特勒-托利多儀器上海有限公司;DHG-9003鼓風(fēng)干燥箱,上海向北實業(yè)有限公司;UV-1800PC紫外可見分光光度計,上海美譜達(dá)儀器有限公司;LA-8080超高速氨基酸自動分析儀,日立高新技術(shù)有限公司;5975b熱脫附氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Agilent公司;TS-5000Z電子舌,北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理

白鰱魚經(jīng)過宰殺、清洗、去頭、去內(nèi)臟、去皮等工序,取可食用部位魚肉用絞肉機絞碎,用密封袋分裝后置于-18 ℃冰箱冷凍,待用。

1.3.2 樣品的制備

參照王紫薇[17]和劉偉[18]的方法進(jìn)行超聲-美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的制備并略做修改。酶解產(chǎn)物取冷凍碎魚肉4 ℃下自然解凍,與蒸餾水(1∶3,w/v)混合均質(zhì)后轉(zhuǎn)移至100 mL錐形瓶中,按照酶添加量5 000 U/g加入木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶(復(fù)配比1∶3),密封后水浴55 ℃酶解4 h,待水解反應(yīng)結(jié)束后,迅速置于95℃水浴中滅酶15 min,4℃條件下以5 000 r/min(離心半徑r=10 cm)離心20 min,取上清液制得鰱魚酶解產(chǎn)物。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物:將酶解產(chǎn)物與3%添加量的木糖混合,調(diào)pH至6,置于90℃烘箱中反應(yīng)90 min,制得美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。超聲-美拉德反應(yīng)產(chǎn)物:將酶解產(chǎn)物與3%添加量的木糖混合,在320 W超聲功率下處理30 min,其他操作同上,制得超聲-美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。

1.3.3 美拉德反應(yīng)中間產(chǎn)物的測定

參照于珍等[19]的方法并略做修改。各樣品溶液用蒸餾水稀釋50倍,用紫外分光光度計在294 nm處測定吸光度,表示中間產(chǎn)物量的變化。

1.3.4 美拉德反應(yīng)褐變程度的測定

參照于珍等[19]的方法并略做修改。各樣品溶液用蒸餾水稀釋2倍,以420 nm處測定的吸光度表示美拉德反應(yīng)晚期階段的褐變程度。

1.3.5 內(nèi)源性熒光強度的測定

在激發(fā)波長為260 nm時測量樣品的熒光光譜,掃描波長范圍為200～460 nm,狹縫為5.0 nm。

1.3.6 游離氨基酸的測定

根據(jù)陳實等[20]的方法并略做修改。將5 mL樣液裝與5 mL 15%的三氯乙酸溶液混合,漩渦混勻后冰浴靜置2 h,在4 ℃、10 000 r/min(離心半徑r=10 cm)下離心15 min后,過濾。取5 mL上清液,將pH用3 mol/L NaOH調(diào)至2,并定容到10 mL,經(jīng)0.22 μm的膜過濾后,轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中上機待測。

1.3.7 揮發(fā)性風(fēng)味成分的測定

參考唐翠翠等[21]的方法并略做修改。將5 mL樣液裝于15 mL頂空瓶中,再加入20 μL 2,4,6-三甲基吡啶(100 mg/L,溶劑甲醇)作為內(nèi)標(biāo)。將老化后的3個規(guī)格為2.9 mm×5 mm,孔徑1 mm的Mono Trap RCC18(GL sciences 公司,日本)固定在頂空瓶上方,60℃水浴條件下萃取40 min,將吸附子裝入襯管中進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件:DB-5MS 彈性毛細(xì)管柱(60 m×0.32 mm,1 μm);載氣為He,流速1.0 mL/min;升溫程序:起始柱溫40 ℃,保持2 min;以4 ℃/min的速率升至160 ℃,不保持;最后以10 ℃/min的速率升至250 ℃,保持5 min。采用不分流模式,汽化室溫度240 ℃。

MS條件:電子電離源;電子能量 70 eV,離子源溫度 200 ℃;傳輸線溫度280℃;質(zhì)量掃描范圍35～450 m/z。熱脫附器條件:不分流模式,起始溫度60 ℃,以 180 ℃/min 的速率升至240 ℃,保持6 min。冷卻型進(jìn)樣口條件:液氮制冷,起始溫度-40 ℃,平衡30 s,以 12 ℃/s的速率升至270 ℃,保持15 min。通過NIST 2005和Wiley質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索對揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜分析,得到正反匹配度均大于800的物質(zhì)。并計算其保留指數(shù)(RI)。

1.3.8 氣味活性值(OAV)

未知揮發(fā)性化合物質(zhì)量濃度以及每種化合物的氣味活度值(odor activity value,OAV)的計算公式如下,當(dāng)OAV≥1時,表明該化合物對樣品的整體風(fēng)味有貢獻(xiàn)[22]。(1)

(1)

式中:C為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量濃度,μg/kg;T為氣味閾值,μg/kg。

1.3.9 電子舌的測定

使用味覺分析系統(tǒng)進(jìn)行電子舌測試。50 mL樣品置于食品杯中,測定其酸味、苦味、澀味、咸味、鮮味、豐富性(新鮮的回味)、回味B(收斂的回味)和回味A(新鮮的回味)。每個樣品測定4次。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

每個試驗均重復(fù)3次,采用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,Origin 2021軟件作圖,采用SPSS 23.0進(jìn)行試驗結(jié)果的顯著性分析及鄧肯多重比較(P<0.05),結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 中間產(chǎn)物及褐變程度的變化

美拉德反應(yīng)在中期階段會形成無色化合物(酮、醛和醇類等),并在294 nm處具有較強吸收峰,通常在顏色形成之前而產(chǎn)生,其微小增量即可使吸光度劇烈增加,因此在294 nm處可間接反映中間產(chǎn)物的生成情況;而在晚期階段會發(fā)生褐變反應(yīng)形成棕色的類黑素等物質(zhì),并可在420 nm處測出[23]。從圖1中可以看到不同處理組之間存在顯著差異(P<0.05)。與酶解產(chǎn)物相比,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在294 nm和420 nm處的吸光度明顯更高,吸光度的增加表明中間產(chǎn)物和褐變化合物的形成[24]。由于氨基的消耗及有機酸的產(chǎn)生,體系的酸性狀態(tài)也會引起褐變程度的略微增加。這與Chen等[25]的研究結(jié)果相似。此外,超聲-美拉德反應(yīng)處理組要高于未超聲組。這可能是由于超聲預(yù)處理產(chǎn)生的湍流和機械剪切力能加快溶液的高速混合,未反應(yīng)的多肽鏈完全展開,大量氨基基團暴露出來,增大了底物與木糖的接觸空間,提高了美拉德反應(yīng)速率[26]。

注:不同小寫字母表示各樣品中中間產(chǎn)物的吸光度差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示各樣品中褐變程度的吸光度差異顯著(P<0.05)圖1 不同處理方式下各樣品中間產(chǎn)物及褐變程度的變化Fig.1 Changes in intermediates and browning degree of samples with different treatments

2.2 內(nèi)源性熒光強度的變化

據(jù)報道,熒光化合物的生成與熱誘導(dǎo)的美拉德反應(yīng)有關(guān)[27]。圖2展示了不同處理組樣品內(nèi)源性熒光光譜的變化。酶解產(chǎn)物在348 nm處顯示出最大熒光強度,而美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強度有所下降。這一結(jié)果表明,鰱魚蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞,蛋白酶裂解氨基酸之間的鍵,釋放氨基酸殘基。隨著具有熒光吸收基團的氨基酸殘基含量的增加,熒光強度也隨之增加[28]。在有木糖參與的情況下,酶解產(chǎn)物的熒光強度下降,超聲-美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強度低于未超聲組。

圖2 不同處理方式下各樣品內(nèi)源性熒光光譜的變化Fig.2 Changes in intrinsic fluorescence of different treated samples

這是由于木糖中的羧基與酶解產(chǎn)物中的氨基充分反應(yīng),從而通過超聲處理加速了氨基和羧基的分子間運動。Liu等[29]在探究糖基化改性蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化中,發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物熒光強度的下降與氨基酸殘基空間位點受阻有關(guān),結(jié)果與本研究一致。

2.3 游離氨基酸分析

游離氨基酸不僅是重要的風(fēng)味物質(zhì),而且是參與美拉德反應(yīng)的風(fēng)味前體化合物。游離氨基酸按呈味特性可分為鮮味(Asp、Glu)、甜味(Thr、Ser、Gly、Ala和Pro)和苦味氨基酸(Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His和Arg)[30]。不同處理方式樣品的游離氨基酸含量如表1所示。本研究共檢測了17種游離氨基酸,游離氨基酸含量在不同處理組樣品間均存在顯著差異(P<0.05)。與酶解產(chǎn)物相比,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和超聲-美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的總游離氨基酸分別降低了14.41%和23.18%。其中苯丙氨酸、精氨酸和蘇氨酸的降低程度較大,說明這些氨基酸主要參與了美拉德反應(yīng)過程中的斯特勒克(Strecker)降解反應(yīng)。

表1 不同處理樣品中游離氨基酸的含量 Tab.1 Content of free amino acids in different treated samples

不同處理樣品呈味游離氨基酸含量的變化如圖3所示。

圖3 不同處理樣品呈味游離氨基酸含量的變化Fig.3 Changes of free amino acid content in taste presentation of different treated samples

由圖3可知,酶解產(chǎn)物經(jīng)美拉德反應(yīng)后的苦味氨基酸降低了9%,而超聲-美拉德反應(yīng)處理組降低了18%,表明美拉德反應(yīng)能有效減少酶解產(chǎn)物中的苦味氨基酸生成,而超聲預(yù)處理使產(chǎn)物粒徑變小,美拉德反應(yīng)速率加快,并使產(chǎn)物的苦味最小化。鮮味氨基酸中谷氨酸含量顯著降低(P<0.05),表明谷氨酸參與美拉德反應(yīng)的活性較高。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中鮮、甜味氨基酸的含量有所下降,這些游離氨基酸與木糖發(fā)生縮合反應(yīng),并在一定程度上影響了酶解產(chǎn)物的口感。

2.4 MMSE-GC-MS分析

采用MMSE-GC-MS技術(shù)對揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行提取,測定其揮發(fā)性化合物的含量如表2所示。共鑒定出49種揮發(fā)性化合物,酶解產(chǎn)物、美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和超聲-美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中分別檢測到44、47和46種揮發(fā)性化合物。其中包括18種醛類、7種醇類、3種酯類、5種酮類、10種烴類、3種雜環(huán)類和3種其他類化合物。各樣品組產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物主要為醛類和烴類化合物。酶解產(chǎn)物經(jīng)超聲處理后使粒徑變小,易與木糖交聯(lián),形成醛類、烯烴、酮類等揮發(fā)性化合物,因此超聲-美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中醛類含量最高。醛類因其較低的閾值而成為食品加工過程中最有價值的揮發(fā)性化合物[31]。醛類化合物是由氨基酸和多肽在加熱過程中與木糖反應(yīng)形成,多肽本身的脫水和縮合也會使其含量增多。由表2可知,己醛和苯甲醛在酶解產(chǎn)物中含量較高。苯甲醛是一種具有櫻桃香的芳香醛,廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[32]。己醛是由亞油酸氧化生成,具有淡淡的草香和脂肪味[33]。

表2 不同處理樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量 Tab.2 Content of volatile flavor components in different treated samples

此外,美拉德反應(yīng)前后有新的醛類物質(zhì)生成。比如2-甲基丁醛,作為常用香料已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中,具有可可香氣、水果香等風(fēng)味[34];糠醛是戊糖的相應(yīng)分解產(chǎn)物,其生成量與美拉德反應(yīng)程度有關(guān)[35];(E,E)-2,4-庚二烯醛呈魚腥味,具有較低的閾值[36],并且在超聲-美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中未檢出,表明超聲輔助美拉德反應(yīng)可以有效改善酶解液的風(fēng)味。飽和醇和烴類化合物通常閾值較高,對整體風(fēng)味貢獻(xiàn)不大但參與雜環(huán)物質(zhì)生成[37]。

2-乙基呋喃等雜環(huán)化合物賦予酶解液燒烤、烤肉香或焦香味,經(jīng)超聲輔助美拉德反應(yīng)后含量顯著增加(P<0.05)。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中還檢測到呈酯香味的辛酸乙酯和呈花果香的乙酸乙酯。酮類和其他類揮發(fā)性物質(zhì)對酶解液風(fēng)味均有一定影響。此外,揮發(fā)性化合物的增加與氨基酸的減少相對應(yīng)。

通過氣味活性值(OAV)鑒定出13種對樣品整體香氣貢獻(xiàn)較大的揮發(fā)性成分,如表3所示。OAV值常被用于評價氣味在食品香氣中的重要性。與GC-MS分析不同,OAV考慮了食物基質(zhì)效應(yīng),因為所涉及的氣味閾值取決于單個食物基質(zhì)。食品香氣中的顯著氣味被認(rèn)為是OAV≥1的有效氣味,通常被稱為關(guān)鍵氣味[38-39]。在超聲處理和美拉德反應(yīng)作用下,水解物中OAV≥1的揮發(fā)性化合物明顯增多,且香味特征更為明顯。與GC-MS分析結(jié)果相符合,低閾值的醛類OAV最大,對整體香味的也貢獻(xiàn)最大。

2.5 電子舌分析

鮮味、苦味和豐富度整體的味覺響應(yīng)值較高,酸味響應(yīng)值最低,后味B(苦的回味)對不同處理樣品的響應(yīng)值基本一致。酶解產(chǎn)物經(jīng)美拉德反應(yīng)后酸味值增加,但苦澀味、鮮咸味和豐富度降低,這可能與呈苦味的游離精氨酸和苯丙氨酸、呈鮮味的谷氨酸降低有關(guān)。而超聲-美拉德反應(yīng)處理組的酸味、苦澀味和咸味的響應(yīng)值低于未超聲組。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被蛋白酶水解產(chǎn)生肽和氨基酸時,未反應(yīng)的短肽對咸味、苦味有貢獻(xiàn),經(jīng)過超聲預(yù)處理后未反應(yīng)的短肽減少,這是使咸味和苦味響應(yīng)值降低的主要原因。此外,超聲輔助美拉德反應(yīng)促進(jìn)了其他呈味氨基酸的生成,酶解液中的苦味被掩蓋。以上結(jié)果表明,超聲輔助美拉德反應(yīng)能夠改善酶解液的風(fēng)味。

電子舌雷達(dá)圖如圖4所示。

圖4 不同處理樣品的電子舌雷達(dá)圖Fig.4 Electron tongue radar map of different treated samples

各樣品電子舌的主成分分析如圖5所示。PC1、PC2的貢獻(xiàn)率分別為68.3%、24.4%,累積貢獻(xiàn)率為92.7%(>85%),表明PC1和PC2能夠很好地反映樣本的總體特征信息。從圖5中可以看出,各樣品的滋味輪廓并無重疊部分,表明電子舌可以將不同樣品很好的區(qū)分開,各樣品之間的距離代表樣品種間的整體滋味差異。酶解產(chǎn)物與美拉德反應(yīng)產(chǎn)物處理組之間距離較遠(yuǎn),滋味輪廓存在顯著差異,而美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和超聲-美拉德產(chǎn)物處理組之間距離較近滋味輪廓相似。

圖5 不同處理樣品的電子舌主成分分析(PCA)Fig.5 Principal component analysis (PCA) of electronic tongues of different treated samples

3 結(jié)論

通過超聲-輔助美拉德反應(yīng)技術(shù)對鰱魚酶解產(chǎn)物進(jìn)行處理,對比未超聲處理組及酶解處理組發(fā)現(xiàn):經(jīng)美拉德反應(yīng)后,中間產(chǎn)物和褐變程度增加,超聲-美拉德反應(yīng)產(chǎn)物高于未超聲組,說明超聲處理促進(jìn)了美拉德反應(yīng)速率。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強度下降,超聲處理組低于未超聲組,表明超聲處理加速了氨基和羧基的分子間運動,使具有熒光吸收基團的氨基酸殘基含量下降。游離氨基酸和MMSE-GC-MS結(jié)果顯示美拉德反應(yīng)能夠降低苦味氨基酸的生成,苯甲醛、糠醛和2-乙基呋喃等賦予酶解液良好氣味的揮發(fā)性化合物含量增加。電子舌結(jié)果進(jìn)一步證實了超聲輔助美拉德反應(yīng)能夠有效改善酶解產(chǎn)物的風(fēng)味,為淡水魚風(fēng)味基料的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。