馬瑩 田玉潭 劉軍 劉敦華

摘要：為充分開(kāi)發(fā)雞骨的利用價(jià)值，該研究以雞骨泥酶解基料為原料，使用植物乳桿菌和戊糖片球菌對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵處理，分析不同菌種配比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵劑接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量、多肽含量、游離氨基酸含量以及感官評(píng)分的影響，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵過(guò)程工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響最顯著，其次是發(fā)酵劑接種量，最后是發(fā)酵時(shí)間，優(yōu)化后最佳發(fā)酵溫度為33 ℃，發(fā)酵劑接種量為6%，發(fā)酵時(shí)間為49 h。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到氨基酸態(tài)氮含量為0.222 1 g/100 g，多肽含量為2.784 g/100 g，總游離氨基酸含量為67.79 mg/100 g。該研究建立的發(fā)酵工藝可為酶解發(fā)酵工藝提供技術(shù)參考，為肉制品副產(chǎn)物的資源化利用提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：雞骨；酶解；發(fā)酵；響應(yīng)面優(yōu)化；氨基酸態(tài)氮

中圖分類號(hào)：TS251.94????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2023）12-0103-08

Optimization of Process Conditions of Chicken Bone Paste

Essence Basic Material by Mixed Strain Fermentation

MA Ying1， TIAN Yu-tan1， LIU Jun2， LIU Dun-hua2*

（1.School of Food Science and Engineering， Ningxia University， Yinchuan 750021， China;

2.School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract： In order to fully develop the utilization value of chicken bone， with the enzymolysis basic material of chicken bone paste as the raw material， Lactobacillus plantarum and Pediococcus pentosaceus are used for fermentation treatment. The effects of different strain ratios， fermentation temperatures， inoculation amount of starter and fermentation time on the content of amino acid nitrogen， polypeptides and free amino acids as well as the sensory score of the fermentation broth are analyzed. Single factor experiment and response surface experiment are used to optimize the process conditions during fermentation. The results show that the fermentation temperature has the most significant effect on the fermentation effect， followed by the inoculation amount of starter and the fermentation time. After optimization， the optimal fermentation temperature is 33 ℃， the inoculation amount of starter is 6% and the fermentation time is 49 h. After verification experiment， the content of amino and nitrogen is 0.222 1 g/100 g， the content of polypeptides is 2.784 g/100 g， and the content of total free amino acids is 67.79 mg/100 g. The fermentation process established in this study can provide technical references for enzymatic hydrolysis fermentation process and some theoretical basis for the resource utilization of meat by-products.

Key words： chicken bone; enzymatic hydrolysis; fermentation; response surface optimization; amino acid nitrogen

近年來(lái)，我國(guó)肉類產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，年產(chǎn)1 700多萬(wàn)噸畜禽骨副產(chǎn)物，約含有165萬(wàn)噸動(dòng)物蛋白。按目前我國(guó)人均每日消耗75 g蛋白質(zhì)計(jì)算，可以滿足約8 000萬(wàn)人對(duì)蛋白質(zhì)一年的需求量[1]。畜禽副產(chǎn)物中的畜禽骨含有豐富的蛋白質(zhì)、骨膠、氨基酸、黏多糖等營(yíng)養(yǎng)成分以及鈣、磷、鐵、鋅等微量元素，尤其在骨蛋白的水解產(chǎn)物中基本包含了蛋白質(zhì)組成的所有氨基酸以及人體所必需的部分氨基酸，因此加工利用畜禽骨具有很高的實(shí)用價(jià)值[2]。

酶解和發(fā)酵可以顯著提升雞骨的可利用價(jià)值，雞骨經(jīng)酶解后必需氨基酸、多肽含量得到提升[3]，蛋白質(zhì)和脂肪通過(guò)發(fā)酵分解產(chǎn)生酚、多肽及醇類等風(fēng)味成分[4]。與僅酶解或僅發(fā)酵骨副產(chǎn)品相比，在酶解的基礎(chǔ)上利用發(fā)酵技術(shù)可以很大程度上提升畜禽骨的利用率，生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品[5]。系列研究表明，使用混合發(fā)酵劑發(fā)酵產(chǎn)品，能有效降低產(chǎn)品中生物胺含量，提升風(fēng)味，使產(chǎn)品具有較好的感官評(píng)價(jià)[6]，其發(fā)酵效果優(yōu)于單一發(fā)酵劑，能彌補(bǔ)單一發(fā)酵劑的種種缺陷。因此，如何選擇恰當(dāng)?shù)木N配比組合和工藝條件，提高發(fā)酵后氨基酸態(tài)氮含量、多肽含量、游離氨基酸含量及感官風(fēng)味成為當(dāng)前亟需解決的問(wèn)題。

本研究主要采用植物乳桿菌和戊糖片球菌組合，在不同菌種配比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵劑接種量和發(fā)酵時(shí)間的條件下對(duì)雞骨泥酶解基料的發(fā)酵情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通過(guò)氨基酸態(tài)氮含量、多肽含量、游離氨基酸含量的變化探究不同的條件對(duì)雞骨泥酶解基料發(fā)酵效果的影響。該研究對(duì)發(fā)酵畜禽骨香精基料制品的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

雞骨：購(gòu)于市場(chǎng)；植物乳桿菌凍干粉：寧夏海達(dá)生物科技開(kāi)發(fā)有限公司；戊糖片球菌凍干粉：上海北諾生物科技有限公司。

MRS肉湯培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉：上海廣諾化學(xué)科技有限公司；甲醛溶液：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250：廣東誠(chéng)信生物科技有限公司；牛血清蛋白：酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；無(wú)水乙醇、磷酸：徐州天鴻化工有限公司；三氯乙酸：廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。福林酚試劑甲液、乙液：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶（均為食品級(jí)）：河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；食鹽：中鹽上海市鹽業(yè)有限公司；葡萄糖：北京紅星化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

DSX-280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；T6型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PHS-2F型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LRH-150-B型生化培養(yǎng)箱 廣州瑞豐實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TDL-5-A型低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SE-150型高速粉碎機(jī) 北京科一科技有限公司；L-8900型全自動(dòng)氨基酸自動(dòng)分析儀 日本Hitachi公司。

1.3 雞骨泥酶解基料的制備

選擇木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶為水解酶，將新鮮雞骨粉粹成泥，與水按1∶1混合，85 ℃磁力攪拌30 min后調(diào)整適宜pH和溫度，加入水解酶充分酶解，90 ℃加熱滅酶后冷卻至室溫，過(guò)濾后添加葡萄糖和食鹽，4 ℃腌制5 h滅菌后備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌種特性測(cè)定

將戊糖片球菌和植物乳桿菌的凍干粉用MRS培養(yǎng)基活化。將活化好的兩種菌株分別接種到10支10 mL的試管中，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每4 h測(cè)定OD600 nm值和pH值；另將活化好的兩種菌株吸取10 mL，加入到0%、3%、6%、9%、12% NaCl的耐鹽性培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)48 h后，測(cè)定OD600? nm值；接種1%活化后的菌種，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，采用系列稀釋和平板計(jì)數(shù)法對(duì)活菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4.2 雞骨泥酶解基料發(fā)酵工藝優(yōu)化研究

1.4.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

控制單一因素參數(shù)，研究菌種配比、發(fā)酵劑接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)主要因素對(duì)發(fā)酵工藝的影響。具體操作：固定接種量為6%（107 CFU/mL），在30 ℃發(fā)酵36 h，研究不同菌種配比（植物乳桿菌∶戊糖片球菌比例分別為1∶1、2∶1、1∶2）對(duì)發(fā)酵效果的影響；固定植物乳桿菌∶戊糖片球菌比例為1∶1，在30 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，研究不同發(fā)酵劑接種量2%、4%、6%、8%、10%（107 CFU/mL）對(duì)發(fā)酵效果的影響；固定植物乳桿菌∶戊糖片球菌比例為1∶1，發(fā)酵劑接種量為6%（107 CFU/mL），發(fā)酵時(shí)間為36 h，研究不同發(fā)酵溫度20，25，30，35，40 ℃對(duì)發(fā)酵效果的影響；固定植物乳桿菌∶戊糖片球菌比例為1∶1，發(fā)酵劑接種量為6%（107 CFU/mL），發(fā)酵溫度為30 ℃，研究不同發(fā)酵時(shí)間24，36，48，60，72 h對(duì)發(fā)酵效果的影響。

1.4.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取發(fā)酵劑接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）以及發(fā)酵溫度（C）為響應(yīng)因素，以氨基酸態(tài)氮含量、多肽含量、總游離氨基酸含量為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhken原理設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化雞骨泥酶解基料的發(fā)酵工藝。實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.4.3 發(fā)酵指標(biāo)測(cè)定

1.4.3.1 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定

氨基酸態(tài)氮含量參考GB/T 5009.39－2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[7]進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3.2 多肽含量的測(cè)定

多肽含量參考付曉燕等[8]的方法進(jìn)行測(cè)定，稱取樣品2～3 g，用15%三氯乙酸溶液溶解并定容至25 mL，混勻，靜置5 min，過(guò)濾。取1 mL樣液，加入福林酚試劑甲液5 mL，混勻，30 ℃下保溫10 min；再加入福林酚試劑乙液0.5 mL，混勻，30 ℃下保溫40 min，于500 nm處測(cè)定吸光值，通過(guò)牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.247x+0.083 3（x為濃度，mg/mL；y為吸光值，R2=0.995 7），計(jì)算多肽含量。

1.4.3.3 游離氨基酸含量的測(cè)定

游離氨基酸含量參考馬浩然[9]的方法進(jìn)行測(cè)定。取5 g雞骨泥酶解基料發(fā)酵樣品于25 mL容量瓶中，用10%的三氯乙酸溶液定容至刻度，超聲振蕩30 min，混勻后靜置1 h，用雙層濾紙過(guò)濾后以10 000 r/min離心10 min，取適量發(fā)酵液于氨基酸自動(dòng)分析儀中檢測(cè)。

1.4.4 感官評(píng)價(jià)

量取5 mL發(fā)酵液置于一次性口杯中，評(píng)定小組由10名食品專業(yè)的同學(xué)組成，對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)分，感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)平行測(cè)定3次，取平均值，采用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，采用Origin 2022對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。運(yùn)用Design-Expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種特性分析

2.1.1 菌種生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸特性分析

菌種生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸特性見(jiàn)圖1。

一般來(lái)說(shuō)，菌種的高活性時(shí)期是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期到穩(wěn)定期前期[10]。由圖1可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，兩種菌種均在4 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在4～8 h生長(zhǎng)速率加快，20 h后進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期。除了在剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，植物乳桿菌的生長(zhǎng)速率比戊糖片球菌快，其余生長(zhǎng)期內(nèi)的速率均呈同步趨勢(shì)，從同時(shí)期菌種產(chǎn)酸特性來(lái)看，菌種在4～8 h隨著其生長(zhǎng)趨勢(shì)的增長(zhǎng)，其產(chǎn)酸速率隨之加快。兩種菌均具有高產(chǎn)酸能力，隨著生長(zhǎng)環(huán)境pH降低，同時(shí)存在厭氧環(huán)境，更有利于菌種生長(zhǎng)繁殖，到20 h時(shí)pH降低至3.8左右后，兩種菌株的生長(zhǎng)速率不再增加，原因可能是菌種在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)代謝活躍，相關(guān)酶活性較強(qiáng)，加快了乳酸的生成速率，進(jìn)入穩(wěn)定期后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被過(guò)度消耗以及積累了大量的代謝產(chǎn)物，從而抑制了菌種的生長(zhǎng)代謝，使得產(chǎn)酸速率降低。彭健斌等[11]利用乳酸菌發(fā)酵羊肉，發(fā)現(xiàn)兩種乳酸菌均在4 h后生長(zhǎng)速率加快，植物乳桿菌和戊糖片球菌分別在18 h和16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，與本研究結(jié)果類似。說(shuō)明植物乳桿菌、戊糖片球菌均具有較大的產(chǎn)酸量，在發(fā)酵過(guò)程中處于優(yōu)勢(shì)地位，有助于改善發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味，同時(shí)能夠在發(fā)酵過(guò)程中抑制其他微生物的生長(zhǎng)。由此可知，植物乳桿菌和戊糖片球菌的最佳收獲期為：植物乳桿菌12～16 h，戊糖片球菌12～16 h。

2.1.2 菌種耐鹽特性分析

菌種耐鹽特性見(jiàn)圖2。

由圖2可知，兩種菌株在食鹽濃度為0%～6%時(shí)，OD600? nm值較穩(wěn)定，說(shuō)明菌株在此范圍內(nèi)生長(zhǎng)不受食鹽濃度的影響。當(dāng)食鹽濃度大于6%時(shí)，菌株的OD600 nm值迅速降低，說(shuō)明該階段菌株的生長(zhǎng)受到食鹽濃度的抑制。高濃度的鹽使得微生物細(xì)胞的外界滲透壓升高，細(xì)胞嚴(yán)重失水，生長(zhǎng)代謝受到抑制。張超等[12]在對(duì)菌種耐鹽特性的研究中也得到類似的結(jié)果。肉制品在發(fā)酵過(guò)程中食鹽的適宜添加量為2.5%～3.0%[10]，菌種在此食鹽濃度范圍內(nèi)均具有較高的活性，因此這兩種菌株均適用于發(fā)酵骨制品的生產(chǎn)。

2.1.3 活菌計(jì)數(shù)

菌種的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3。

在生產(chǎn)發(fā)酵肉制品時(shí)，發(fā)酵劑的最適接種量為106 CFU/mL[13]。由表3可知，菌種的計(jì)數(shù)結(jié)果均高于106 CFU/mL，因此這兩種菌株的接種量均符合骨制品在發(fā)酵過(guò)程中的要求。

2.2 最佳工藝配方的篩選

2.2.1 菌種配比對(duì)發(fā)酵效果的影響

不同菌種配比對(duì)酶解雞骨發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，菌種配比為1∶2組的氨基酸態(tài)氮含量（0.15 g/100 g）較其他兩組高，菌種配比為1∶2和2∶1兩組的感官評(píng)分較高。由于微生物在發(fā)酵過(guò)程中自身生長(zhǎng)代謝，有助于分解骨中的蛋白質(zhì)和脂肪，從而產(chǎn)生游離氨基酸和游離脂肪酸，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，如乙酸、雙乙酰和丙酸等，有益于發(fā)酵產(chǎn)品形成獨(dú)特的風(fēng)味[14]。片球菌屬作為骨制品發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌株，發(fā)酵雞骨風(fēng)味的形成與其生長(zhǎng)代謝有很大的關(guān)聯(lián)[15]。綜合來(lái)看，菌種配比為1∶2組的氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分均最高。因此，兩種菌株的適宜配比為植物乳桿菌∶戊糖片球菌為1∶2。

2.2.2 發(fā)酵劑接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響

不同發(fā)酵劑接種量對(duì)酶解雞骨發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，酶解雞骨發(fā)酵液的氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵劑接種量的增加先升高后降低，原因可能是當(dāng)接種量超過(guò)一定量時(shí)，菌體會(huì)消耗更多的營(yíng)養(yǎng)成分用于生長(zhǎng)代謝，同時(shí)接種量過(guò)大反而會(huì)抑制乳酸菌的生長(zhǎng)[16]，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮含量下降，接種量過(guò)低又使得發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)不足[17-18]。接種量為6%、8%組的感官評(píng)分較高。楊秀娟等[19]對(duì)發(fā)酵香腸進(jìn)行工藝優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵溫度控制在30 ℃左右時(shí)，有利于菌種的生長(zhǎng)代謝，從而抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)，并且當(dāng)接種量為6%時(shí)，成品無(wú)明顯酸味，風(fēng)味良好，與本研究結(jié)果相一致。綜合來(lái)看，當(dāng)接種量為6%時(shí)，感官評(píng)分和氨基酸態(tài)氮含量均較高，因此，發(fā)酵劑的適宜接種量為6%。

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響

不同發(fā)酵溫度對(duì)酶解雞骨發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分隨著發(fā)酵溫度的升高先上升后下降，氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵溫度為30，35，40 ℃時(shí)均較高，感官評(píng)分在發(fā)酵溫度為35 ℃時(shí)最高，骨產(chǎn)品在發(fā)酵時(shí)溫度過(guò)高，可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵初期其他雜菌快速增長(zhǎng)，溫度過(guò)低，又不利于發(fā)酵劑菌株的生長(zhǎng)代謝，從而抑制生物酶的分泌，影響發(fā)酵雞骨的品質(zhì)[20]。張蕓等[21]基于戊糖片球菌發(fā)酵酶解鯽魚(yú)基料進(jìn)行工藝優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響高于發(fā)酵時(shí)間，與本研究結(jié)果相一致。因此，綜合來(lái)看，確定最適發(fā)酵溫度為35 ℃。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酶解雞骨發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量和感官評(píng)分的影響見(jiàn)圖6。

由圖6可知，酶解雞骨發(fā)酵液的氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降，可能是因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間過(guò)短不足以使微生物大量繁殖，相關(guān)酶活性減弱，風(fēng)味物質(zhì)沒(méi)有得以完全轉(zhuǎn)化；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌體大量繁殖，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被嚴(yán)重消耗，造成發(fā)酵產(chǎn)物又被充當(dāng)為底物再次參與反應(yīng)。左勇等[22]對(duì)豬骨酶解液進(jìn)行工藝優(yōu)化，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果影響的變化趨勢(shì)與本研究結(jié)果相一致。感官評(píng)分在發(fā)酵時(shí)間為36，48，60 h時(shí)較高。因此，確定最適發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.3 響應(yīng)面工藝優(yōu)化

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以氨基酸態(tài)氮含量、多肽含量、總游離氨基酸含量為響應(yīng)值，選取3個(gè)影響最大的因素：發(fā)酵劑接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和發(fā)酵溫度（C）優(yōu)化雞骨泥酶解基料發(fā)酵工藝。采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3.2 氨基酸態(tài)氮含量的響應(yīng)面分析

對(duì)氨基酸態(tài)氮含量與發(fā)酵劑接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）3個(gè)因素進(jìn)行多元回歸擬合分析和方差分析，得到氨基酸態(tài)氮含量的二次多項(xiàng)回歸模型：氨基酸態(tài)氮含量=0.22+0.015A+0.007 913B－0.030C－0.004 850AB－0.022AC－0.021BC－0.005 765A2 －0.013B2－0.061C2。

回歸模型方差分析見(jiàn)表5。

由表5可知，各因素對(duì)氨基酸態(tài)氮含量影響的大小順序?yàn)镃（發(fā)酵溫度）>A（發(fā)酵劑接種量）>B（發(fā)酵時(shí)間），R2=0.873 3，RAdj2=0.710 4，說(shuō)明該回歸模型能反映71.04%響應(yīng)值的變化。氨基酸態(tài)氮含量的模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著，模型擬合良好，可靠性高。

由圖7可知發(fā)酵劑接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）之間的交互作用對(duì)酶解雞骨發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量的影響。三維響應(yīng)面坡度的陡峭或平緩程度與響應(yīng)值對(duì)實(shí)驗(yàn)因素的改變是否敏感密切相關(guān)[23]。發(fā)酵劑接種量（A）與發(fā)酵溫度（C）對(duì)氨基酸態(tài)氮含量的交互作用最顯著，坡度相對(duì)最陡；發(fā)酵時(shí)間（B）與發(fā)酵溫度（C）之間的交互作用較顯著，坡度較陡；發(fā)酵劑接種量（A）與發(fā)酵時(shí)間（B）之間的交互作用最不顯著，坡度最緩。

2.3.3 多肽含量的響應(yīng)面分析

對(duì)多肽含量與發(fā)酵劑接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）3個(gè)因素進(jìn)行多元回歸擬合分析和方差分析，得到多肽含量的二次多項(xiàng)回歸模型：多肽含量=2.75+0.15A+0.017B－0.33C－0.072AB+0.087AC－0.15BC－0.29A2－0.072B2－0.60C2。

回歸模型方差分析見(jiàn)表6。

通過(guò)回歸模型的方差分析能夠判斷出該模型的可靠性，同時(shí)判斷出發(fā)酵劑接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）對(duì)多肽含量影響的大小。由表6可知，各因素對(duì)多肽含量影響的大小順序?yàn)镃（發(fā)酵溫度）>A（發(fā)酵劑接種量）>B（發(fā)酵時(shí)間），多肽含量的模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，模型擬合良好，可靠性高。R2=0.951 8，RAdj2=0.889 8，說(shuō)明該回歸模型能反映88.98%響應(yīng)值的變化。

由圖8可知發(fā)酵劑接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）之間的交互作用對(duì)酶解雞骨發(fā)酵液多肽含量的影響。發(fā)酵劑接種量（A）與發(fā)酵溫度（C）對(duì)多肽含量的交互作用最顯著，坡度最陡；發(fā)酵時(shí)間（B）與發(fā)酵溫度（C）之間的交互作用較顯著，坡度較陡；發(fā)酵劑接種量（A）與發(fā)酵時(shí)間（B）之間的交互作用最不顯著，坡度最緩。

2.3.4 總游離氨基酸含量的響應(yīng)面分析

對(duì)總游離氨基酸含量與發(fā)酵劑接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）3個(gè)因素進(jìn)行多元回歸擬合分析和方差分析，得到總游離氨基酸含量的二次多項(xiàng)回歸模型：總游離氨基酸含量=67.47+2.52A－0.25B－2.29C－0.98AB－1.92AC－0.81BC－7.18A2 －7.07B2－5.34C2。

回歸模型方差分析見(jiàn)表7。

通過(guò)回歸模型的方差分析，能夠判斷出該模型的可靠性，同時(shí)判斷出發(fā)酵劑接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）對(duì)總游離氨基酸含量影響的大小。由表7可知，各因素對(duì)總游離氨基酸含量影響的大小順序?yàn)锳（發(fā)酵劑接種量）>C（發(fā)酵溫度）>B（發(fā)酵時(shí)間），總游離氨基酸含量的模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，模型擬合良好，可靠性高。R2=0.984 5，RAdj2=0.964 5，說(shuō)明該回歸模型能反映96.45%響應(yīng)值的變化。

由圖9可知發(fā)酵劑接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、發(fā)酵溫度（C）之間的交互作用對(duì)酶解雞骨發(fā)酵液總游離氨基酸含量的影響。發(fā)酵劑接種量（A）與發(fā)酵時(shí)間（B）對(duì)總游離氨基酸含量的交互作用最顯著，坡度最陡；發(fā)酵時(shí)間（B）與發(fā)酵溫度（C）之間的交互作用較顯著，坡度較陡；發(fā)酵劑接種量（A）與發(fā)酵溫度（C）之間的交互作用最不顯著，坡度最緩。

2.3.5 最優(yōu)發(fā)酵工藝條件的驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件分析結(jié)果得出：在發(fā)酵劑接種量為6.64%，發(fā)酵時(shí)間為49.14 h，發(fā)酵溫度為33.55 ℃時(shí)，理論值氨基酸態(tài)氮含量為0.231 1 g/100 g，多肽含量為2.802 g/100 g，總游離氨基酸含量為67.84 mg/100 g。為了適于實(shí)際生產(chǎn)需要，將工藝參數(shù)調(diào)整為發(fā)酵劑接種量6%、發(fā)酵時(shí)間49 h、發(fā)酵溫度33 ℃。在此工藝下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到氨基酸態(tài)氮含量為0.222 1 g/100 g，多肽含量為2.784 g/100 g，總游離氨基酸含量為67.79 mg/100 g，預(yù)測(cè)值接近于實(shí)際值，說(shuō)明利用該模型優(yōu)化后的工藝參數(shù)可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中。

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化，得出發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響最顯著，其次是發(fā)酵劑接種量，最后是發(fā)酵時(shí)間，并且優(yōu)化后最佳發(fā)酵溫度為33 ℃，發(fā)酵劑接種量為6%，發(fā)酵時(shí)間為49 h。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到氨基酸態(tài)氮含量為0.222 1 g/100 g，多肽含量為2.784 g/100 g，總游離氨基酸含量為67.79 mg/100 g。結(jié)果表明，酶解發(fā)酵技術(shù)可以提高雞骨泥原料的利用率，可為利用雞骨開(kāi)發(fā)天然營(yíng)養(yǎng)食品和食品添加劑提供新思路。

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收稿日期：2023-07-13

基金項(xiàng)目：國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2015GA880005）；寧夏回族自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021AAC03013，2022AAC02021）；寧夏回族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（NGSB-2021-6-05）

作者簡(jiǎn)介：馬瑩（1998－），女，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量控制。

*通信作者：劉敦華（1964－），男，教授，博士，研究方向：食品質(zhì)量安全控制技術(shù)與研究。