譚鼎,李平,陳榮,郭雪峰,車(chē)麗妍,田冰,李濤

(塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 阿拉爾 843300)

大腸桿菌疾病(colibacillosis)發(fā)病率高、傳染性強(qiáng),抗生素的濫用導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性逐漸增強(qiáng),易引起規(guī)模性發(fā)病,危害公共安全。目前,暫無(wú)針對(duì)性疫苗,防控難度極大。這些問(wèn)題在“限抗”轉(zhuǎn)型背景下難以得到及時(shí)有效地解決,對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展造成了極大威脅[1]。乳酸菌是定植在腸道內(nèi)的有益菌,通過(guò)調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生態(tài)平衡來(lái)調(diào)控腸道的生理結(jié)構(gòu)、維護(hù)腸道屏障完整性,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收,抑制有害菌生長(zhǎng),通常被用于預(yù)防和治療腸道感染疾病和抗生素依賴(lài)性腹瀉[2-3]。

現(xiàn)有研究表明,植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌皆對(duì)大腸桿菌有較好的拮抗作用,可緩減并修復(fù)因大腸桿菌感染而造成的腸黏膜損傷[4],但目前關(guān)于唾液乳桿菌體內(nèi)、體外抑菌能力的研究尚少。本試驗(yàn)旨在分離鑒定出一種能抑制大腸桿菌的雞源唾液乳桿菌,通過(guò)體外試驗(yàn)評(píng)價(jià)唾液乳桿菌對(duì)大腸桿菌的抑菌作用,同時(shí)構(gòu)建大腸桿菌感染模型,并對(duì)感染模型組灌服雞源唾液乳桿菌進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證,通過(guò)組織形態(tài)學(xué)HE染色觀察唾液乳桿菌對(duì)腸黏膜的保護(hù)作用,為大腸桿菌感染性疾病的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新疆黑雞購(gòu)自圖木舒克市冠翔畜牧養(yǎng)殖服務(wù)中心;大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC25922)由塔里木大學(xué)陳偉教授課題組惠贈(zèng);5周齡SPF級(jí)小鼠(雌雄各半)購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要試劑

MRS肉湯(MRS Broth)、MRS瓊脂和LB肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博有限公司;DNA Marker DL 2 000、EasyTaq Mix酶和細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司;革蘭氏染色試劑盒、核酸染色劑和無(wú)菌生理鹽水均購(gòu)自Solarbio公司。

1.1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD)購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;凝膠成像系統(tǒng)(721BR08598)、梯度PCR儀(C1000)、電泳儀(042BR18884)均購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離鑒定

在超凈工作臺(tái)上將黑雞唾液拭子置于盛有5 mL MRS肉湯的試管中,37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行增菌,無(wú)菌條件下劃線于含0.8%CaCO3的改良MRS固體培養(yǎng)基上,挑取有溶鈣圈的單菌落進(jìn)行革蘭染色并鏡檢觀察。

使用細(xì)菌全基因組DNA試劑盒提取乳桿菌的DNA,參照文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)細(xì)菌16srRNA基因通用引物27 F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,1492 R:5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′,目的片段大小為1 500 bp,由蘇州金唯智生物科技有限公司合成;擴(kuò)增體系為25 μL:滅菌雙蒸水8.5 μL、EasyTaq Mix 12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、DNA模板2 μL;PCR擴(kuò)增程序?yàn)?預(yù)變性95 ℃ 300 s,變性94 ℃ 30 s,退火54 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 60 s,循環(huán)35次;終延伸72 ℃ 10 min,陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物由蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序,所獲序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)分析,根據(jù)比對(duì)結(jié)果鑒定細(xì)菌種類(lèi)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.2 唾液乳桿菌體外抑菌能力測(cè)定

將大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922)菌種接種于LB肉湯培養(yǎng)基中,在37 ℃條件下培養(yǎng),取200 μL菌液涂布于MRS培養(yǎng)基平板,每個(gè)平板放置5個(gè)牛津杯,在牛津杯中加入200 μL的唾液乳桿菌菌液,對(duì)照組加入200 μL無(wú)菌生理鹽水,將平板置于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑的最大值與最小值,取平均值為抑菌圈直徑。

1.2.3 唾液乳桿菌體內(nèi)抑菌能力檢測(cè)

1.2.3.1 唾液乳桿菌稀釋液的制備

將雞源唾液乳桿菌分離株和大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC25922)分別接種于MRS和LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h后,取1.5 mL菌液于離心管中,8 000 rpm離心1 min,棄上清,菌體用無(wú)菌生理鹽水重懸并稀釋至1.5×108CFU/mL備用。

1.2.3.2 唾液乳桿菌對(duì)小鼠腸黏膜保護(hù)作用檢測(cè)

5周齡小鼠經(jīng)過(guò)7 d的適應(yīng)性飼養(yǎng)后,隨機(jī)分為4組,每組8只;空白對(duì)照組灌胃無(wú)菌生理鹽水200 μL/(只·天),連續(xù)21 d;炎性對(duì)照組灌胃大腸桿菌菌液200 μL/(只·天),連續(xù)7 d;唾液乳桿菌組灌胃雞源唾液乳桿菌菌液200 μL/(只·天),連續(xù)21 d;拮抗組先灌胃雞源性唾液乳桿菌菌液200 μL/(只·天),14 d之后,繼續(xù)灌胃大腸桿菌菌液200 μL/(只·天),連續(xù)7 d。試驗(yàn)期間,小鼠自由飲水。

當(dāng)炎性對(duì)照組飲食量減少,眼瞼分泌物增多,動(dòng)作遲緩,反應(yīng)遲鈍,臀部及肛門(mén)周?chē)忻黠@污跡時(shí),進(jìn)行樣品采集。小鼠禁食12 h(正常飲水),對(duì)各試驗(yàn)組進(jìn)行空腹稱(chēng)重,并取適量新鮮腸內(nèi)容物保存于無(wú)菌離心管中。

參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)tuf基因特異性引物,F:5′-TTATCTGAATACGACTTCCCTG-3′,R:5′-GTTGTCTTAACAATGTCATCCTT-3′,目的片段大小為296 bp,由上海生工有限公司合成;擴(kuò)增體系為25 μL:滅菌雙蒸水8.5 μL、EasyTaq Mix 12.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL、DNA模板2 μL;PCR擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性95 ℃ 300 s,變性94 ℃ 30 s,退火53 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 45 s,循環(huán)35次;終延伸72 ℃ 10 min;上述引物與體系用于腸道內(nèi)容物中唾液乳桿菌的檢測(cè)。

將小鼠安樂(lè)死,取2 cm小腸組織保存在固定液中,制作切片HE染色并用顯微鏡觀察,對(duì)絨毛高度和隱窩深度進(jìn)行測(cè)量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用CaseViewer軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,通過(guò)LSD法進(jìn)行多重比較,P<0.01為差異極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

將樣品純培養(yǎng)后,單個(gè)菌落形態(tài)完整,微微凸起,表面光滑,呈乳白色,有溶鈣環(huán)(圖1A);將挑選的細(xì)菌涂片染色,菌體革蘭氏染色后為藍(lán)紫色桿狀,兩端鈍圓(圖1B)。

A:分離株菌落形態(tài); B:分離株革蘭氏染色結(jié)果(10×100)。

2.2 分離株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果

以分離株DNA為模板,以細(xì)菌16srRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在1 500 bp左右出現(xiàn)明顯條帶(圖2),與預(yù)期大小相符;經(jīng)測(cè)序后與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析,與唾液乳桿菌5547株(MT463556.1)同源性為100%,表明分離株為唾液乳桿菌。選取與分離株同源性高的唾液乳桿菌16srRNA序列,運(yùn)用MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù),結(jié)果顯示分離菌株的16srRNA基因序列與Ligilactobacillussalivarius2875(MT611 837.1)株遺傳進(jìn)化相距最近,置信度為100%(圖3),說(shuō)明二者在進(jìn)化上親緣關(guān)系非常近。

M:DL-2 000 Marker;1:陰性對(duì)照;2:16s rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖3 分離株基于16s rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.3 唾液乳桿菌體外抑菌能力測(cè)定結(jié)果

如表1、圖4所示,體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明,雞源唾液乳桿菌對(duì)大腸桿菌具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用,抑菌圈平均直徑為17.59 mm。

表1 唾液乳桿菌抑制大腸桿菌抑菌圈直徑

1:生理鹽水抑制大腸桿菌抑菌圈;2～5:唾液乳桿菌抑制大腸桿菌抑菌圈。

2.4 小鼠腸道內(nèi)唾液乳桿菌檢測(cè)結(jié)果

以各組小鼠糞便中細(xì)菌DNA為模板,用tuf基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),唾液乳桿菌組在296 bp左右出現(xiàn)目的條帶,對(duì)照組無(wú)特異性條帶(圖5),表明雞源性唾液乳桿菌可以適應(yīng)宿主的自然選擇并發(fā)揮其益生作用。

M:DL-2 000 Marker;1:唾液乳桿菌組;2:拮抗組;3:炎性對(duì)照組;4:空白對(duì)照組。

2.5 小鼠腸腔組織切片結(jié)果

小鼠腸黏膜組織切片結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組、炎性對(duì)照組和拮抗組相比,唾液乳桿菌組腸絨毛細(xì)長(zhǎng)、排列整齊、連續(xù)性和完整性較好,腸腔最小(圖6),表明唾液乳桿菌對(duì)小鼠腸絨毛具有伸長(zhǎng)和保護(hù)作用。

圖6 各組小腸組織切片圖(HE 20×)

利用CaseViewer軟件測(cè)量絨毛高度和隱窩深度,結(jié)果顯示與空白對(duì)照組和炎性對(duì)照組相比,唾液乳桿菌組腸絨毛高度最高,絨隱比最高(P<0.01);與炎性對(duì)照組相比,拮抗組腸絨毛高度和絨隱比極顯著高于炎性對(duì)照組(P<0.01)(圖7A、圖7B);組織切片分析結(jié)果顯示唾液乳桿菌組杯狀細(xì)胞數(shù)目多且排列整齊、隱窩深度最淺、絨隱比最大;炎性對(duì)照組腸絨毛嚴(yán)重破損,杯狀細(xì)胞排列混亂、隱窩深度增大;拮抗組顯著優(yōu)于炎性對(duì)照組(圖7C)。表明雞源唾液乳桿菌可以增加小鼠腸道絨隱比,并且可以緩減、修復(fù)大腸桿菌對(duì)腸黏膜的損傷,進(jìn)而拮抗其感染。

A:絨毛高度、隱窩深度數(shù)據(jù);B:絨隱比數(shù)據(jù);C:小腸組織切片(HE 100×),矩形表示絨毛高度,三角形表示隱窩深度,圓形表示杯狀細(xì)胞區(qū)域。

3 討論

唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)屬于乳酸桿菌科(Lactobacillaceae)乳桿菌屬(Lactobacillus),是一種革蘭氏陽(yáng)性菌,它存在于人類(lèi)和畜禽的共生菌群中[7]。唾液乳桿菌的代謝產(chǎn)物中有過(guò)氧化氫、抑菌素、有機(jī)酸和短鏈脂肪酸等,可抑制或殺滅細(xì)菌[8]。本研究從新疆黑雞唾液中分離鑒定出唾液乳桿菌,通過(guò)牛津杯法發(fā)現(xiàn)該株唾液乳桿菌對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)有顯著的抑制作用,這與王黎明等[9]研究結(jié)果一致,表明新疆黑雞源唾液乳桿菌對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)具有體外抑制作用。

腸道微生物體系在維持動(dòng)物體健康方面有重要的作用,腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成反映了微生物和宿主水平的自然選擇[10]。小鼠腸道主要微生物菌群為Bacteroidetes和Firmicutes等[11-13]。本研究結(jié)果顯示試驗(yàn)組小鼠腸道內(nèi)容物有雞源性唾液乳桿菌,而對(duì)照組幾乎沒(méi)有,表明雞源性唾液乳桿菌適應(yīng)宿主的自然選擇并發(fā)揮其益生作用。

腸黏膜由上皮細(xì)胞層(柱狀上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞等)、固有層和黏膜肌層組成。上皮細(xì)胞層和固有層向管腔突出形成腸絨毛,上皮細(xì)胞層向黏膜下層凹陷形成腸隱窩。腸黏膜是支持水、養(yǎng)分和離子轉(zhuǎn)運(yùn)的一種選擇性組織膜,可作為腸道微生物與基礎(chǔ)免疫系統(tǒng)之間的屏障。乳酸菌是定植在腸道內(nèi)的有益菌,憑借其多樣性和動(dòng)態(tài)平衡性維持腸道健康、調(diào)控腸道生理結(jié)構(gòu)、維護(hù)腸黏膜完整性,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收、有益于宿主的生長(zhǎng)和發(fā)育[14-15]。WU H Q等[16]研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌具有促進(jìn)腸上皮細(xì)胞再生、修復(fù)其病理性損傷和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用,可形成黏膜屏障、抑制病原微生物的定植。邵青玲等[17]研究表明,在飼料中添加多糖后,隱窩深度變淺,細(xì)胞成熟率和吸收功能增強(qiáng),腸黏膜修復(fù)能力增強(qiáng),絨毛高度與隱窩深度比值(絨隱比)大,小腸消化能力強(qiáng)。谷巍等[18]研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌通過(guò)增加腸道絨隱比增強(qiáng)小鼠免疫力,降低小鼠腹瀉率。本研究結(jié)果表明雞源性唾液乳桿菌可以促進(jìn)小鼠腸絨毛的生長(zhǎng)、抑制腸隱窩的深度、增加絨隱比;炎性對(duì)照組的腸絨毛損傷嚴(yán)重,腸腔變大,隱窩加深;而拮抗組對(duì)此有明顯改善作用,緩減并修復(fù)了大腸桿菌對(duì)小鼠腸道黏膜的損傷,保護(hù)腸道健康。

4 結(jié)論

綜上所述,從新疆黑雞唾液中分離的唾液乳桿菌對(duì)大腸桿菌具有良好的體外抑制作用。對(duì)大腸桿菌感染的小鼠腸黏膜完整性和連續(xù)性具有很好的保護(hù)與修復(fù)作用,具有拮抗大腸桿菌感染的能力。