牛和小鼠早期胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞譜系發(fā)育調(diào)控的比較

吳瀟彤，史延，李爽，王少華，張坤

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江省奶牛遺傳改良與乳品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058）

長(zhǎng)期經(jīng)高強(qiáng)度選育的荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性能已得到顯著提升[1]，但問題也隨之而來，高產(chǎn)奶牛的繁殖效率比較低。影響奶牛繁殖效率的因素有很多，比如品種、環(huán)境、飼養(yǎng)管理、繁殖技術(shù)、疾病等[2]，這些因素可能會(huì)導(dǎo)致受精失敗、早期胚胎發(fā)育阻滯、遺傳缺陷或流產(chǎn)。因此，對(duì)牛胚胎發(fā)育調(diào)控的研究有助于開發(fā)相關(guān)措施，提高奶牛繁殖效率。

哺乳動(dòng)物的發(fā)育起始于高度分化的配子（精子和卵細(xì)胞）結(jié)合形成受精卵，歷經(jīng)6～7 次（以牛為例）有絲分裂后，單細(xì)胞的受精卵逐步發(fā)育成囊胚（受精后6～7 d，圖1）。隨后，囊胚到達(dá)子宮并在受精后19～21 d著床，進(jìn)一步發(fā)育成胎兒。正常的早期胚胎發(fā)育是后續(xù)胎兒成功發(fā)育的前提（本文所指的早期胚胎發(fā)育階段特指受精后胚胎發(fā)育到囊胚期的過程）。因此，早期胚胎發(fā)育過程中誘導(dǎo)胚胎分化的調(diào)控機(jī)制是目前早期胚胎發(fā)育研究的熱點(diǎn)。

圖1 小鼠和牛早期胚胎發(fā)育過程中的形態(tài)變化及關(guān)鍵生物學(xué)事件Fig.1 Morphological changes and key biological events during early embryonic development in mice and cattle

早期胚胎發(fā)育主要依靠母源mRNA 和蛋白質(zhì)，直到合子基因組激活（zygotic genome activation,ZGA）的發(fā)生（小鼠為2細(xì)胞期，牛為8—16細(xì)胞期）。隨后胚胎形態(tài)發(fā)生變化，卵裂球由先前的松散狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛ハ鄩嚎s的緊實(shí)狀態(tài)，即致密化。同時(shí)，細(xì)胞形成頂端-基底軸，胚胎極性由此建立[3]。細(xì)胞極性建立和不對(duì)稱分裂對(duì)于胚胎后續(xù)的發(fā)育至關(guān)重要。在桑葚胚期，位于滋養(yǎng)外胚層（trophectoderm, TE）細(xì)胞基底膜區(qū)域的鈉鉀泵將含Na+的液體泵入TE 細(xì)胞外間隙，形成多個(gè)微腔，隨著Na+不斷積累，形成滲透梯度，液體持續(xù)泵入微腔，直至達(dá)到細(xì)胞外間隙的承受閾值，多個(gè)微腔破裂形成一個(gè)充滿液體的囊胚腔[4]，標(biāo)志著囊胚的形成。在囊胚形成前后，早期胚胎大致發(fā)生2 次細(xì)胞譜系分化，最終形成3 種類型的胚層細(xì)胞——TE細(xì)胞、原始內(nèi)胚層（primitive endoderm, PE）細(xì)胞、上胚層（epiblast, EPI）細(xì)胞。多種信號(hào)通路參與胚胎細(xì)胞譜系分化，如Hippo、Notch、Wnt、MEK/ERK通路等。本文從胚胎形態(tài)變化、轉(zhuǎn)錄因子以及細(xì)胞信號(hào)通路等角度，綜述牛和小鼠早期胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞譜系分化的調(diào)控。

1 早期胚胎發(fā)育過程中的胚胎形態(tài)變化

哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過程中形態(tài)變化相似，但發(fā)育進(jìn)程差異較大，關(guān)鍵生物學(xué)事件如ZGA、致密化等發(fā)生的時(shí)間存在差異（圖1）。

1.1 早期卵裂

精卵結(jié)合形成受精卵意味著早期胚胎發(fā)育的開始，隨后受精卵不斷進(jìn)行細(xì)胞分裂，此過程稱為“卵裂”。胚胎中卵裂球的分裂并不同步，因此在某些時(shí)刻胚胎中細(xì)胞數(shù)目為奇數(shù)。隨著分裂不斷進(jìn)行，胚胎的細(xì)胞數(shù)目持續(xù)增加，但胚胎的體積變化不大[5]，為后續(xù)的胚胎致密化奠定基礎(chǔ)。此外，這一時(shí)期存在一個(gè)重要的生物學(xué)事件——ZGA。在ZGA 之前，合子基因組保持轉(zhuǎn)錄沉默，胚胎發(fā)育主要依靠母源mRNA 和蛋白質(zhì)。合子基因組正常激活后，大量母源mRNA 降解，只有部分母源mRNA編碼的蛋白質(zhì)可以在這一時(shí)期之后少量表達(dá)。小鼠和牛發(fā)生ZGA的時(shí)間并不相同。在小鼠中，次要ZGA 發(fā)生在胚胎1 細(xì)胞S 期到2 細(xì)胞G1 期[6]，此時(shí)合子基因轉(zhuǎn)錄水平較低且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物高度混雜[7]；主要ZGA發(fā)生在2細(xì)胞晚期，此時(shí)大量合子基因被激活并且開始轉(zhuǎn)錄；而在牛中，ZGA發(fā)生在8—16細(xì)胞期[8]（表1）。

表1 小鼠和牛早期胚胎發(fā)育時(shí)期和事件比較Table 1 Comparison of periods and events of early embryonicdevelopment between mice and cattle

1.2 致密化和極性化

胚胎在歷經(jīng)前幾輪分裂后，迎來一個(gè)重要的形態(tài)變化——胚胎致密化。哺乳動(dòng)物中胚胎致密化發(fā)生的時(shí)間存在差異，小鼠胚胎致密化發(fā)生在8 細(xì)胞期[9]，而牛胚胎致密化發(fā)生在16—32 細(xì)胞期[10]（表1）。

致密化發(fā)生前，小鼠胚胎的微絨毛在卵裂球上均勻分布。當(dāng)小鼠胚胎發(fā)育至8 細(xì)胞期，微絨毛開始富集在細(xì)胞表面區(qū)域，此時(shí)，胚胎的頂端-基底軸開始形成。形成的頂端膜區(qū)域使卵裂球產(chǎn)生極性[3]，并使其進(jìn)行不對(duì)稱分裂。子代通過不對(duì)稱分裂獲得頂端膜區(qū)域[11]，細(xì)胞極性得以維持。在小鼠胚胎發(fā)育至16細(xì)胞期時(shí)，內(nèi)部細(xì)胞表面的微絨毛分布稀疏，而外部細(xì)胞頂端膜區(qū)域的微絨毛分布密集[12]。在牛胚胎9—15 細(xì)胞期，部分卵裂球中微絨毛的分布出現(xiàn)極化，16細(xì)胞期之后細(xì)胞極化變得更加明顯[13]。埃茲蛋白（ezrin, EZR）負(fù)責(zé)連接膜蛋白和肌動(dòng)球蛋白[14]。有研究認(rèn)為，EZR 參與微絨毛的形成：胚胎致密化發(fā)生前，EZR 在細(xì)胞表面均勻分布；致密化發(fā)生后，磷酸化的EZR 開始聚集在細(xì)胞的頂端膜區(qū)域，隨著細(xì)胞不斷分裂，在16 細(xì)胞期EZR 只在外部細(xì)胞中表達(dá)[15]。在小鼠胚胎中，頂端膜區(qū)域的形成在細(xì)胞譜系分化過程中發(fā)揮重要作用，但在牛胚胎中，抑制頂端膜區(qū)域的形成不會(huì)影響囊胚發(fā)育[16]，說明早期胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞譜系分化的調(diào)控機(jī)制具有物種特異性。

在胚胎的頂端膜區(qū)域，有大量蛋白酶激活受體（proteinase-activated receptors, PARs）復(fù)合體富集，包括PAR3、PAR6 和非典型蛋白激酶C（atypical protein kinase C, aPKC），在基底膜區(qū)域，有大量E-鈣黏蛋白（E-cadherin，又叫CDH1）和PAR1 富集。CDH1 參與細(xì)胞-細(xì)胞接觸點(diǎn)的黏著連接。在缺失CDH1 的胚胎中，外部細(xì)胞不能形成完整的上皮組織[17]。在分子水平上，富含CDH1 的絲狀偽足從黏著連接和頂端膜區(qū)域的邊緣向鄰近細(xì)胞的頂端膜區(qū)域延伸并與鄰近細(xì)胞緊密黏附[18]。在形態(tài)上，胚胎發(fā)生致密化時(shí)，卵裂球變得扁平，細(xì)胞界限變得模糊，細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸增加[19]。在非極性細(xì)胞中，頂端膜蛋白aPKC的含量低于極性細(xì)胞，肌球蛋白的收縮性高于極性細(xì)胞[3]，因此非極性細(xì)胞被周圍的極性細(xì)胞向胚胎內(nèi)部擠壓。隨著非極性細(xì)胞的內(nèi)化，極性和非極性細(xì)胞收縮性的差異逐漸增大[3]。胚胎致密化和極性化為囊胚腔的形成奠定了基礎(chǔ)。

1.3 囊胚腔的形成與擴(kuò)張

細(xì)胞分裂和胚胎致密化持續(xù)進(jìn)行，TE細(xì)胞持續(xù)壓縮，上皮組織對(duì)機(jī)械力的感應(yīng)持續(xù)增強(qiáng)，使細(xì)胞-細(xì)胞連接處逐漸成熟，即TE 細(xì)胞上皮組織逐漸成熟[20]。同時(shí)，基底膜區(qū)域的鈉鉀泵，即Na+/K+-ATP酶將液體泵入TE細(xì)胞外間隙，形成多個(gè)微腔[4]。液體持續(xù)泵入微腔使腔內(nèi)濃度高于腔外，形成滲透梯度，而滲透梯度又促使液體繼續(xù)泵入微腔，形成正反饋。當(dāng)腔內(nèi)液體累積達(dá)到微腔的承受閾值時(shí)，液體繼續(xù)泵入微腔會(huì)使微腔破裂，大量微腔破裂合并形成一個(gè)囊胚腔，隨后，破裂的細(xì)胞外間隙恢復(fù)密封狀態(tài)，微腔再次形成，如此循環(huán)往復(fù)，囊胚腔隨之?dāng)U張[20]。

2 關(guān)鍵基因與信號(hào)通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)對(duì)胚胎細(xì)胞譜系分化的影響

早期胚胎大致經(jīng)過2次細(xì)胞譜系分化形成3類細(xì)胞（TE細(xì)胞、PE細(xì)胞和EPI細(xì)胞）譜系。最終，TE細(xì)胞分化為胎盤，PE細(xì)胞分化為卵黃囊，EPI細(xì)胞分化為胎兒。在早期胚胎發(fā)育過程中，第一次細(xì)胞譜系分化的正常進(jìn)行是第二次細(xì)胞譜系分化成功進(jìn)行的前提。其中，胚胎極性建立和不對(duì)稱分裂對(duì)第一次細(xì)胞譜系分化至關(guān)重要。針對(duì)第一次細(xì)胞譜系分化過程，科學(xué)家提出了多種假說。這些假說本質(zhì)上相互關(guān)聯(lián)，共同調(diào)控第一次細(xì)胞譜系分化并指導(dǎo)第二次細(xì)胞譜系分化。

2.1 “極性假說”

哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過程中，由單個(gè)細(xì)胞分裂而來且形態(tài)相似的細(xì)胞卻擁有不同的細(xì)胞命運(yùn)。細(xì)胞命運(yùn)為何不同？細(xì)胞分裂方式為何不同？細(xì)胞位置為何有內(nèi)外之分？基于這些疑問，科學(xué)家提出了多種模型。其中一個(gè)模型是“內(nèi)-外假說”，該假說強(qiáng)調(diào)細(xì)胞所處位置是決定細(xì)胞命運(yùn)的主要因素[21]。胚胎外側(cè)細(xì)胞發(fā)育為TE 細(xì)胞，內(nèi)側(cè)細(xì)胞發(fā)育為內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cell mass, ICM）。另外一個(gè)模型是“極性假說”，該假說認(rèn)為細(xì)胞極性的建立誘導(dǎo)細(xì)胞分化命運(yùn)[11]。細(xì)胞極性形成后產(chǎn)生2種分裂方式，當(dāng)細(xì)胞的分裂方向平行于頂端-基底軸時(shí)，發(fā)生對(duì)稱分裂，產(chǎn)生2 個(gè)具有極性的子代細(xì)胞；而當(dāng)細(xì)胞的分裂方向垂直于頂端-基底軸時(shí)，發(fā)生不對(duì)稱分裂，產(chǎn)生1 個(gè)極性子代細(xì)胞和1 個(gè)無極性的子代細(xì)胞。

這些假說相互關(guān)聯(lián)，協(xié)同決定細(xì)胞命運(yùn)。例如，從ICM 分離出的細(xì)胞可以形成具有極性的TE細(xì)胞[22]。極性蛋白aPKC 和PAR3 可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞間的緊密連接蛋白來影響胚胎細(xì)胞間的黏附性[23]，其表達(dá)受阻會(huì)使外部細(xì)胞保持外側(cè)位置的競(jìng)爭(zhēng)力下降，從而發(fā)生內(nèi)化。由此，胚胎致密化會(huì)增加細(xì)胞間接觸，促進(jìn)細(xì)胞黏附蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞極化[24]。然而，細(xì)胞極化受阻會(huì)影響細(xì)胞的不對(duì)稱分裂，引起細(xì)胞錯(cuò)誤定位，使細(xì)胞分化過程混亂。胚胎頂端膜區(qū)域受損雖不影響牛囊胚形成，但會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎的TE細(xì)胞和ICM細(xì)胞分化失敗[25]，說明在牛胚胎中有其他途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化。

2.2 第一次細(xì)胞譜系分化

Hippo信號(hào)通路由胚胎致密化和頂端極性蛋白啟動(dòng)，如血管動(dòng)蛋白（angiomotin, AMOT）和神經(jīng)纖維瘤蛋白亞型2（neurofibromin 2, NF2），并且胚胎內(nèi)部細(xì)胞和外部細(xì)胞會(huì)獲得不同的Hippo 信號(hào)，產(chǎn)生不同的命運(yùn)，說明細(xì)胞極性和不對(duì)稱分裂影響Hippo通路的活性[26]。抑制AMOT不會(huì)影響牛囊胚發(fā)育[27]。在小鼠胚胎內(nèi)部細(xì)胞中，AMOT 分布于細(xì)胞-細(xì)胞連接處，位于AMOT N 端結(jié)構(gòu)域的第176位絲氨酸殘基被大腫瘤抑制激酶1/2（large tumor suppressor kinase 1/2, LATS1/2）磷酸化后，會(huì)抑制肌動(dòng)蛋白的活性，從而激活Hippo通路[28]；而在外部細(xì)胞中，AMOT 位于細(xì)胞頂端膜區(qū)域，與肌動(dòng)蛋白互作，抑制Hippo通路。哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶1/2（mammalian sterile twenty-like kinase 1/2, MST1/2）和LATS1/2 是Hippo 信號(hào)通路的核心級(jí)聯(lián)組件。在牛早期胚胎中，MST1/2 在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)且功能冗余，在抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用。同時(shí)，敲除Mst1/2會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育阻滯[29]。Lats1/2參與小鼠胚胎ICM的形成，并調(diào)控細(xì)胞分化命運(yùn)[30]。

首先，Hippo 通路上游因子AMOT 等被激活，MST1/2 與 支 架 蛋 白SAV1（salvador family WW domain containing protein 1）和調(diào)節(jié)支架蛋白MOB1（MOB kinase activator 1）結(jié)合形成復(fù)合物，使LATS1/2磷酸化[31]。隨后，磷酸化的LATS1/2使胚胎內(nèi)部細(xì)胞中的Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein,YAP）/具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif, TAZ）磷酸化。磷酸化的YAP/TAZ滯留在細(xì)胞質(zhì)，不能作為轉(zhuǎn)錄共激活因子與內(nèi)部細(xì)胞核中的TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子4（TEA domain transcription factor 4, TEAD4）結(jié)合，內(nèi)部細(xì)胞的多能性得以維持。Hippo 通路在胚胎外部細(xì)胞中則保持沉默，未被磷酸化的YAP/TAZ 進(jìn)入細(xì)胞核與TEAD4 結(jié)合，促使外部細(xì)胞分化為TE 細(xì)胞。在小鼠胚胎中，敲低Lats1/2會(huì)導(dǎo)致內(nèi)部細(xì)胞核中的YAP 表達(dá)升高[30]。TAZ 始終在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)[32]，并且抑制YAP 表達(dá)不會(huì)影響囊胚發(fā)育[33]。在牛胚胎中，TAZ不僅持續(xù)在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，還在囊胚期部分卵裂球的細(xì)胞核中表達(dá)，敲低TAZ不會(huì)影響牛囊胚率，但會(huì)使TE細(xì)胞數(shù)顯著下降[34]。抑制YAP1會(huì)導(dǎo)致牛囊胚率下降[27]。因此，YAP 和TAZ作為連接LATS 激酶和下游轉(zhuǎn)錄因子TEAD4 的橋梁，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

TEAD4是小鼠胚胎TE細(xì)胞分化的上游調(diào)控因子，卻不是牛胚胎TE細(xì)胞形成和分化所必需的。在牛早期胚胎中，16 細(xì)胞期TEAD4轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)，桑葚胚期TEAD4大量表達(dá)[35]，囊胚期TE細(xì)胞和ICM細(xì)胞中均有TEAD4表達(dá)，且TE 細(xì)胞中TEAD4mRNA 水平高于ICM 細(xì)胞[36]。利用RNA 干擾抑制TEAD4 表達(dá)時(shí)，胚胎仍能發(fā)育至囊胚[36]，并且OCT4（organic cation/carnitine transporter 4）、NANOG（Nanog homeobox）、GATA3（GATA binding protein 3）和CDX2（caudal type homeobox 2）的表達(dá)均不受影響[35]，說明在牛早期胚胎發(fā)育過程中有其他途徑調(diào)控CDX2，如TFAP2C（transcription factor AP-2 gamma）就可以誘導(dǎo)CDX2表達(dá)[37]。

細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)因子2（cellular communication network factor 2, CCN2）由4個(gè)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域組成：胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor binding protein, IGFBP）結(jié)構(gòu)域、血管性血友病C 型（von willebrand type C, vWC）重復(fù)序列、血小板反應(yīng)蛋白（thrombospondin, TSP）重復(fù)序列和含有半胱氨酸基元的C 端（C-terminal, CT）結(jié)構(gòu)域[38]。在牛胚胎中，敲低CCN2會(huì)導(dǎo)致TEAD4及多能因子OCT4和NANOG的表達(dá)顯著下降，敲低TEAD4會(huì)導(dǎo)致CCN2的表達(dá)顯著下降，說明TEAD4和CCN2相互作用，共同調(diào)節(jié)牛胚胎TE 細(xì)胞的分化[36]。

在小鼠早期胚胎中，抑制Tead4后，胚胎不能形成囊胚腔，Cdx2和Gata3表達(dá)下降，Oct4和Nanog未受影響[39]。在小鼠胚胎干細(xì)胞中，TEAD4僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而在小鼠滋養(yǎng)外胚層干細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有TEAD4表達(dá)[40]。由此推測(cè)，TEAD4在內(nèi)部細(xì)胞核中表達(dá)會(huì)阻礙TE細(xì)胞和ICM細(xì)胞的分離，影響囊胚形成；反之，內(nèi)部細(xì)胞中TE 細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序會(huì)遭到破壞，導(dǎo)致內(nèi)部細(xì)胞向ICM 細(xì)胞分化[40]。由此可見，在牛和小鼠早期胚胎中，TEAD4的表達(dá)模式及對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控存在差異。

TE細(xì)胞的標(biāo)記基因CDX2在TE細(xì)胞的形成和維持中發(fā)揮重要作用。在牛胚胎中，ICM 細(xì)胞中CDX2的轉(zhuǎn)錄水平低于TE細(xì)胞[41]，敲低CDX2后，TE細(xì)胞數(shù)、ICM 細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)保持不變，多能因子SOX2（SRY-box transcription factor 2）和OCT4的表達(dá)和定位不受影響[42]，TE 細(xì)胞標(biāo)記基因IFNT（interferon-tau）和KRT8（keratin 8）的表達(dá)也不受影響[43]，GATA3的表達(dá)下降。此外，敲低CDX2雖不影響牛囊胚形成，但會(huì)使囊胚發(fā)育延遲，以及使TE細(xì)胞上皮組織的完整性遭到破壞[43]，說明CDX2對(duì)牛胚胎TE 細(xì)胞的形成雖不是必需的，但對(duì)維持TE細(xì)胞的完整性至關(guān)重要。有觀點(diǎn)認(rèn)為，牛基因位點(diǎn)在染色體區(qū)域的位置影響其在譜系分化過程中的表達(dá)，如在CDX2和NANOG高表達(dá)時(shí)期，其基因位點(diǎn)傾向于分布在染色體區(qū)域的外側(cè)[44]。此外，YAP 在細(xì)胞中的定位與CDX2 的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)有關(guān)，且CDX2在細(xì)胞核中的表達(dá)滯后于YAP[45]。Wnt 家族成員3A（Wnt family member 3A, WNT3A）可能通過WNT-YAP/TAZ 信號(hào)通路激活和調(diào)節(jié)CDX2[46]。在小鼠胚胎中，敲除合子Cdx2不會(huì)影響囊胚發(fā)育，然而，敲除母源-合子Cdx2會(huì)造成TE細(xì)胞分化混亂甚至小鼠胚胎死亡[47]，說明合子Cdx2不是TE 細(xì)胞形成所必需的，而母源Cdx2對(duì)TE 細(xì)胞的分化至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎中，Cdx2和細(xì)胞極性相互作用可以調(diào)控細(xì)胞核的位置，比如，在進(jìn)行不對(duì)稱分裂的細(xì)胞中，細(xì)胞核位于細(xì)胞基底區(qū)域，而在進(jìn)行對(duì)稱分裂的細(xì)胞中，細(xì)胞核位于細(xì)胞頂端區(qū)域，CDX2表達(dá)升高，細(xì)胞核向頂端區(qū)域移動(dòng)[48]。

H1FOO（H1 histone family member O, oocytespecific）是連接組蛋白1（linker histone 1, H1）的一個(gè)變體蛋白，其表達(dá)始于卵母細(xì)胞，ZGA 后被合子H1 取代[49]。連接組蛋白的氨基酸序列具有高度可變性，導(dǎo)致物種間H1FOO 序列存在差異。在小鼠胚胎中，敲低H1foo會(huì)使胚胎延遲進(jìn)入2細(xì)胞期，但過表達(dá)H1foo并不影響胚胎發(fā)育[50]。在牛中，敲低H1FOO后，胚胎停滯在桑葚胚期[51]，譜系分化因子CDX2、GATA3、KRT8和極性相關(guān)基因AMOT、EZR的表達(dá)均下降，抑制性染色質(zhì)標(biāo)記因子H3K9me3和H3K27me3 的含量上升，開放性染色質(zhì)標(biāo)記因子H4K16ac 的含量下降；過表達(dá)H1FOO后，牛的囊胚率下降約50%[50]，說明H1FOO通過調(diào)節(jié)細(xì)胞分化和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)參與牛早期胚胎發(fā)育調(diào)控。

Notch信號(hào)通路在物種間高度保守，并在細(xì)胞分化和凋亡等方面發(fā)揮重要作用[52]。在經(jīng)典的Notch信號(hào)通路中，配體（Delta-like 1/3/4 和Jagged 1/2）和受體（Notch 1/2/3/4）結(jié)合，通過蛋白酶解激活Notch受體，釋放Notch 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（Notch intracellular domain, NICD）。隨后，NICD進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄效應(yīng)器RBPJ（recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region）結(jié)合，招募其他共激活因子形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，從而發(fā)揮調(diào)控作用[51]。在小鼠中，Notch 信號(hào)通路在4 細(xì)胞期被激活，并且只在TE細(xì)胞中活躍，說明Notch信號(hào)通路在第一次細(xì)胞譜系分化過程中發(fā)揮重要作用[53]。干擾Notch 信號(hào)通路會(huì)影響囊胚發(fā)育，促使SOX2表達(dá)下降[54]。有研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠囊胚中，Notch 信號(hào)通路與Hippo信號(hào)通路共同調(diào)控CDX2 在TE 細(xì)胞中的特異性表達(dá)[53]：Notch、Hippo信號(hào)與CDX2上游的增強(qiáng)子結(jié)合，NICD/RBPJ 與SBNO1（Strawberry Notch homolog 1）結(jié)合，從而激活CDX2[55]。在牛胚胎中，NOTCH1mRNA 的表達(dá)在受精后顯著上升，在2 細(xì)胞期達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，在桑葚胚期和囊胚期其表達(dá)均較低。RBPJ 在卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)，在8 細(xì)胞期之前，RBPJ 在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均表達(dá)；在16細(xì)胞期及之后，RBPJ僅在細(xì)胞核中表達(dá)。敲低NOTCH1，牛的囊胚率顯著下降，CDX2、TFAP2A和H1FOO表達(dá)下降。敲低RBPJ雖然不影響牛囊胚形成，但形成的囊胚較小，且總細(xì)胞數(shù)減少[51]。以上研究說明，Notch 信號(hào)通路通過調(diào)控H1FOO，參與牛卵母細(xì)胞成熟和早期胚胎發(fā)育過程調(diào)控。牛和小鼠胚胎第一次細(xì)胞譜系分化過程見圖2。

圖2 小鼠和牛胚胎第一次細(xì)胞譜系分化Fig.2 First cell lineage differentiation in mice and cattle embryos

2.3 第二次細(xì)胞譜系分化

在第二次細(xì)胞譜系分化過程中，ICM細(xì)胞進(jìn)一步分化為EPI細(xì)胞和PE細(xì)胞。EPI細(xì)胞表達(dá)大量多能因子，如NANOG、SOX2等，這些因子在維持細(xì)胞多能性方面起到至關(guān)重要的作用。PE 細(xì)胞表達(dá)大量促進(jìn)與維持PE 細(xì)胞分化的因子，如GATA4/6、SOX17、PDGFRA（platelet-derived growth factor receptor alpha）等，這些因子相互作用共同調(diào)控EPI細(xì)胞和PE細(xì)胞的分化。

在胚胎內(nèi)部細(xì)胞中，OCT4 對(duì)維持胚胎多能性和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化起到重要作用。在牛卵母細(xì)胞中，OCT4轉(zhuǎn)錄本水平較低，ZGA后其表達(dá)水平升高，致密化階段其轉(zhuǎn)錄水平急劇升高[56]。盡管ZGA 前期能檢測(cè)到OCT4和SOX2轉(zhuǎn)錄本，但未能檢測(cè)到相應(yīng)蛋白[57]，說明牛胚胎中OCT4與ZGA 的關(guān)聯(lián)可能不密切。牛胚胎的TE 細(xì)胞和ICM 細(xì)胞中均有OCT4表達(dá)，且敲除牛合子OCT4后，胚胎仍能表達(dá)OCT4，表明母源OCT4在牛早期胚胎發(fā)育過程中對(duì)維持OCT4表達(dá)發(fā)揮一定作用[58]，敲除OCT4后仍能形成囊胚，SOX2和GATA6的表達(dá)不受影響，NANOG和SOX17的表達(dá)被抑制[59]。在敲除OCT4的牛胚胎中表達(dá)外源成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4（fibroblast growth factor 4, FGF4）時(shí)，NANOG 和SOX17 不能恢復(fù)表達(dá)[59]，說明在牛胚胎中OCT4對(duì)維持EPI細(xì)胞多能性和PE 細(xì)胞分化發(fā)揮重要作用，CDX2 最初與OCT4共定位，但在囊胚期能觀察到明顯的譜系分離[60]。在小鼠早期胚胎中，OCT4 處于多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心[58]，OCT4 和CDX2 相互抑制以調(diào)控TE 細(xì)胞和ICM 細(xì)胞的分化。小鼠OCT4 存在TFAP2C 結(jié)合位點(diǎn)，可以抑制CDX2 的表達(dá)，而牛OCT4 不存在TFAP2C結(jié)合位點(diǎn)[61]，說明OCT4在牛和小鼠胚胎中的功能存在差異。

在牛胚胎中，SOX2表達(dá)始于16細(xì)胞期，囊胚期時(shí)SOX2在ICM細(xì)胞中特異性表達(dá)。敲除SOX2后，在蛋白質(zhì)水平上，NANOG 和OCT4 的表達(dá)均顯著下降[62]。NANOG表達(dá)始于8—16細(xì)胞期[60]，在早期囊胚中，NANOG 在TE 細(xì)胞和ICM 細(xì)胞中均有表達(dá)。敲除NANOG后，胚胎形成較小的囊胚腔，GATA6遷移至ICM 細(xì)胞中表達(dá)，SOX2和GATA6的表達(dá)下降，CDX2的表達(dá)不受影響[63]，說明NANOG在TE細(xì)胞分化中無明顯作用，但在EPI細(xì)胞、PE細(xì)胞的分化和多能性的維持方面發(fā)揮重要作用。在敲除NANOG的牛胚胎中，抑制促分裂原活化的蛋白激酶激酶［mitogen-activated protein kinase (MAPK)kinase, MEK］會(huì)導(dǎo)致胚胎死于囊胚期前，這與在小鼠胚胎中的情況相似[64]；表達(dá)FGF4 不能完全恢復(fù)SOX17 的表達(dá)，這與在小鼠胚胎中的情況相反[64]。在牛早期胚胎中，NANOG和GATA6在ICM細(xì)胞中呈現(xiàn)“椒-鹽”分布模式[58]。GATA6在牛胚胎的ICM細(xì)胞和TE細(xì)胞均有表達(dá)[65]。

在牛胚胎中，F(xiàn)GF 激活下游促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）誘導(dǎo)細(xì)胞分化[66]。敲低成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2）后，牛胚胎中NANOG和GATA6的表達(dá)不受影響，HNF4A（hepatocyte nuclear factor 4 alpha）的表達(dá)顯著下降，并且EPI細(xì)胞和PE前體細(xì)胞數(shù)目不受影響[67]。抑制牛卵母細(xì)胞FGF10表達(dá)會(huì)阻礙囊胚發(fā)育，限制卵丘擴(kuò)大[68]。有研究發(fā)現(xiàn)，微RNA（microRNA, miRNA）在調(diào)控牛胚胎多能性方面發(fā)揮重要作用。例如，miR-218 直接調(diào)節(jié)CDH2和NANOG的表達(dá)，并且能在ICM細(xì)胞中調(diào)節(jié)NANOG以響應(yīng)FGF 信號(hào)通路[69]。抑制牛胚胎的MAPK會(huì)促進(jìn)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中NANOG的表達(dá)，抑制GATA6的表達(dá)，而SOX2和OCT4的表達(dá)不受影響[70]。雙重抑制牛胚胎的MAP2K 和GSK3（glycogen synthase kinase 3）時(shí)，F(xiàn)GF4和NANOG的表達(dá)升高，PDGFRA和SOX1的表達(dá)降低，細(xì)胞類型由PE 細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)镋PI 細(xì)胞[71]，說明MAP2K 和GSK3 可以促進(jìn)細(xì)胞向PE細(xì)胞分化。

牛胚胎中SOX17表達(dá)始于16—32細(xì)胞期，最初，SOX17與NANOG共表達(dá)，在囊胚后期表達(dá)開始分離，抑制MEK 信號(hào)后，SOX17的表達(dá)在囊胚期下降[71]。激活Wnt 信號(hào)會(huì) 促 進(jìn)ICM 細(xì)胞中OCT4、NANOG、SOX2和KLF4（KLF transcription factor 4）的表達(dá)，抑制TE 細(xì)胞中CDX2的表達(dá)[72]，說明Wnt信號(hào)對(duì)細(xì)胞向EPI細(xì)胞分化起到一定作用。激活素A 促進(jìn)囊胚發(fā)育，抑制NANOG和SOX2的表達(dá)，促進(jìn)CDX2和GATA6的表達(dá)[73]，說明激活素A 促使細(xì)胞向PE 細(xì)胞分化[73]。此外，在JAK/STAT3（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription 3）通路中，磷酸化的STAT3 與SOX2、NANOG 在細(xì)胞核共定位，且JAK被抑制后SOX2的表達(dá)顯著下降，ICM 細(xì)胞中未檢測(cè)到磷酸化的STAT3[74]，說明JAK/STAT3對(duì)于EPI細(xì)胞的分化起到重要作用。在小鼠胚胎中，PE細(xì)胞和EPI細(xì)胞的分化依賴于FGF/MAP信號(hào)，干擾ERK 會(huì)抑制GATA4/6 的表達(dá)[75]。敲低轉(zhuǎn)錄因子SMARCA5（SWI/SNF related,matrix associated,actin dependent regulator of chromatin,subfamily a,member 5），OCT4在TE細(xì)胞和ICM細(xì)胞中表達(dá)，且SOX17 和NANOG 的表達(dá)降低，EPI 細(xì)胞和PE 細(xì)胞的分化受到影響[76]，說明SMARCA5對(duì)小鼠EPI細(xì)胞和PE 細(xì)胞的分化起到一定作用。牛和小鼠胚胎的第二次細(xì)胞譜系分化見圖3，牛和小鼠早期胚胎發(fā)育生物學(xué)機(jī)制比較見表2。

表2 小鼠和牛早期胚胎發(fā)育生物學(xué)機(jī)制比較Table 2 Comparison of biological mechanisms at early embryonic development between mice and cattle

圖3 小鼠和牛胚胎第二次細(xì)胞譜系分化Fig.3 Second cell lineage differentiation in mice and cattle embryos

3 結(jié)語

迄今為止，大部分關(guān)于哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的研究以小鼠為模型進(jìn)行。由于存在種間差異，不同物種的胚胎發(fā)育模式存在差異。哺乳動(dòng)物胚胎都要?dú)v經(jīng)從受精卵到2 細(xì)胞、4 細(xì)胞、8 細(xì)胞、桑葚胚、囊胚等時(shí)期的形態(tài)轉(zhuǎn)變，而各時(shí)期的持續(xù)時(shí)間、相同生物學(xué)事件的發(fā)生時(shí)期、轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)模式、轉(zhuǎn)錄因子的互作等在不同物種間存在差異。

哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育是一系列動(dòng)態(tài)變化的過程，包括物理變化和化學(xué)變化。物理變化指胚胎形態(tài)發(fā)生改變，主要與2個(gè)生物學(xué)事件相關(guān)，包括胚胎致密化和極性化以及囊胚腔的形成?；瘜W(xué)變化指關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄本的變化，合子基因組激活使胚胎內(nèi)的基因表達(dá)發(fā)生劇烈變化，大部分母源基因降解，合子基因?qū)崿F(xiàn)由沉默到轉(zhuǎn)錄爆發(fā)的轉(zhuǎn)變，從而調(diào)控后續(xù)發(fā)育。胚胎發(fā)育受到多種因素的影響，如細(xì)胞微環(huán)境、細(xì)胞所處位置、細(xì)胞極性和機(jī)械力的感知等，這些因素可能相互作用共同調(diào)控胚胎發(fā)育，因而在分析某一現(xiàn)象時(shí)不能孤立看待某一因素。此外，由于種間差異，基于小鼠的研究不能完全照搬運(yùn)用于其他物種，因此，有必要對(duì)其他物種的胚胎發(fā)育進(jìn)行研究以及進(jìn)行物種間胚胎發(fā)育比較，拓展對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的認(rèn)知。