王晶，劉滔，趙敏潔，馮鳳琴，戴笑瑩，喬海軍，彭昕

（1.浙江大學寧波科創(chuàng)中心，浙江 寧波 315100；2.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058；3.寧波圣旺生物科技有限公司，浙江 寧波 315000；4.寧波市中醫(yī)藥研究院，浙江 寧波 315010）

隨著人們生活水平的提高，肉類食品的安全性受到了極大的重視，抗生素雖然在畜禽養(yǎng)殖疾病預防中表現(xiàn)出積極作用，但同時也破壞了畜禽胃腸道微生態(tài)平衡，導致抗生素耐藥細菌大量增加和機體藥物殘留，直接威脅人體健康[1]。2019年7月9日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布第194 號公告，規(guī)定自2020 年1 月1日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種，并禁止在日糧中添加任何促生長的抗生素。因此，植物源活性物質(zhì)作為綠色添加劑日益成為替代傳統(tǒng)抗生素的關(guān)注點和研發(fā)熱點，特別是中草藥作為飼料添加劑，不僅能改善動物健康狀況、調(diào)節(jié)腸道菌群和宿主免疫、緩解不良應激、預防疾病，還有促進動物腸道有益菌生長和動物消化吸收、提高飼料轉(zhuǎn)化率和動物生長性能的作用，另外，中草藥具有安全低毒、不易產(chǎn)生抗藥性、殘留少等特點[2]。

三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanum）又稱三葉青，作為浙江省特色優(yōu)勢中藥新“浙八味”之一，具有抗腫瘤、抗炎、解熱鎮(zhèn)痛、抗病毒、保肝和調(diào)節(jié)免疫等功效，尤以“清熱解毒”的傳統(tǒng)功效著稱，被譽為“植物抗生素”[3]。隨著三葉青藥材產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，三葉青種植面積不斷增長，但由于三葉青僅塊根進入浙江省中藥炮制規(guī)范，地上部分無法藥用，造成了大量資源浪費。然而，有研究發(fā)現(xiàn)從三葉青藤莖葉分離純化的有效部位提取物，也表現(xiàn)出良好的抗炎、抗菌作用[4]。傳統(tǒng)功效記錄和現(xiàn)代研究證實，三葉青的根和葉均具有顯著的抗菌、抗病毒、促免疫活性，且能促進動物腸道益生菌生長，是極具潛力的中藥飼料添加劑開發(fā)原料[5]。此外，目前對肉雞生長性能、食用品質(zhì)、免疫效應和腸道健康等方面影響的系統(tǒng)評價仍十分缺乏。因此，本研究通過評價三葉青地上部分（三葉青藤葉粉）對肉雞生長性能、免疫功能和腸道菌群的干預效應，為三葉青地上部分在肉雞飼料中的開發(fā)與應用提供理論依據(jù)，對養(yǎng)殖業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展以及拓展中藥非藥用部位的資源化利用均具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑、主要儀器

材料與試劑：1日齡雄性黃羽肉雞（品種為嶺南黃雞），購于浙江群大畜牧養(yǎng)殖有限公司；免疫球蛋白A（immunoglobulin A, IgA）、IgG、IgM酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒，購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

主要儀器：中藥粉碎機（型號為QJ-08，上海兆申電子科技有限公司）；酶標儀（型號為Infinite M200 Pro，瑞士TECAN公司）；高速冷凍離心機（型號為HC-3018R，安徽中科中佳科學儀器有限公司）；電子天平[型號為BSA224S，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]。

1.2 樣品制備

三葉青地上部分的產(chǎn)地為浙江省寧波市，由寧波圣旺農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，經(jīng)浙江大學寧波科創(chuàng)中心彭昕教授鑒定為葡萄科植物三葉青藤葉（T.hemsleyanumleaves, THL）。將上述得到的三葉青地上部分干燥后置于粉碎機中，粉碎后均勻過80目篩，得到三葉青藤葉粉末，備用。

1.3 動物分組及飼養(yǎng)管理

試驗采用隨機分組法，選取240 只體質(zhì)量相近的健康肉仔雞，隨機分為4 組，每組6 個重復（每個重復10羽），試驗期為42 d。試驗分為對照組（飼喂基礎日糧，記作CK）和低劑量組、中劑量組、高劑量組（分別飼喂添加1%、3%、5%三葉青藤葉粉的基礎日糧，記作THL-L、THL-M、THL-H）?；A日糧參照美國國家研究委員會（National Research Council,NRC）于1994 年建議的肉雞營養(yǎng)需要量進行配制，不同試驗組日糧配方及營養(yǎng)指標見表1。肉雞養(yǎng)殖于浙江省海鹽天銘蛋雞專業(yè)合作社實驗雞舍，自由采食和飲水，24 h 光照，定時清掃雞舍衛(wèi)生，定期進行雞舍內(nèi)消毒，免疫和飼養(yǎng)管理遵照實驗雞場規(guī)定執(zhí)行。本試驗獲得浙江大學實驗動物福利倫理審查委員會批準，遵循《浙江大學實驗動物福利倫理審查委員會章程》相關(guān)規(guī)定。

表1 不同試驗組日糧組成及營養(yǎng)指標Table 1 Ingredients and nutritional indexes of diets in different experimental groups

1.4 生長性能測定

在試驗第1天（1日齡）、第21天（21日齡）、第42天（42日齡），以重復為單位分別對肉雞進行空腹稱量并記錄，準確記錄試驗期內(nèi)肉雞的給料量和撒料量，參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準（NY/T 823—2020《家禽生產(chǎn)性能名詞術(shù)語和度量計算方法》）測定肉雞生長性能。公式如下：

1.5 免疫器官指數(shù)測定

各試驗組于第42 天分別隨機抽取6 只試驗雞（42日齡），稱量后取脾臟、胸腺和法氏囊，用濾紙吸干水分后稱量，并計算免疫器官指數(shù)。公式如下：

1.6 血清中免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）含量測定

各試驗組于第42 天分別隨機抽取6 只試驗雞（42日齡），剖殺取血，每只試驗雞約取血液5 mL，靜置，經(jīng)高速離心機離心15 min 后，置于－20 ℃條件下保存，備用。血清中免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）含量采用相應ELISA 試劑盒進行測定。將各試劑盒在室溫下平衡20 min 后，取出待測血清，按照試劑盒說明書規(guī)范操作。使用酶標儀進行雙波長檢測，測定待測血清在450 nm（最大吸收波長）和630 nm（參考波長）波長下的吸光度值，參照標準曲線計算血清中IgG、IgM、IgA的含量。

1.7 腸道菌群分析

各試驗組于第42 天分別隨機抽取5 只試驗雞（42日齡），取盲腸內(nèi)容物，按照糞便DNA提取試劑盒（Qiagen QIAamp DNA Stool Mini Kit）說明書提取DNA，然后采用文庫擴增試劑盒（KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit），以338F（5′-ACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3′）為引物，通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）擴增16S rRNA 的V3～V4 區(qū)，構(gòu)建文庫，并對文庫進行定量和質(zhì)控，根據(jù)樣本的數(shù)據(jù)量要求，進一步將文庫等摩爾混合。MiSeq測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行顯著性分析，采用方差分析（analysis of variance, ANOVA）進行不同組間差異比較和統(tǒng)計檢驗（Tukey法），以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

盲腸菌群原始測序序列使用Trimmomatic軟件進行質(zhì)控，并用FLASH 軟件進行拼接。根據(jù)97%的序列相似度對優(yōu)化后的序列進行可操作分類單元（operational taxonomic units, OTUs）聚類，并對菌群組成進行統(tǒng)計，使用上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司提供的免費在線數(shù)據(jù)分析平臺I-Sanger（https://www.majorbio.com/）對菌群數(shù)據(jù)進行分析。進一步采用線性判別分析（linear discriminant analysis,LDA）來估算每個組分（物種）相對豐度對差異效果影響的大小，進行LEfSe多級物種差異判別分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三葉青藤葉粉對肉雞生長性能的影響

由表2 可知，在試驗雞只21 日齡時，與對照組相比，各三葉青藤葉粉添加劑量組肉雞的平均日增重顯著升高（P＜0.05），平均日采食量隨添加劑量增加而增加，但較對照組無顯著差異；添加不同劑量三葉青藤葉粉后，肉雞的料重比均顯著降低（P＜0.05），其中，中、高劑量組的效果最為顯著。在試驗雞只42 日齡時，與對照組相比，各三葉青藤葉粉添加劑量組肉雞的平均日增重均顯著提高（P＜0.05），其中，中劑量組效果最為明顯，提高11.07%；低、中劑量組肉雞的平均日采食量較對照組顯著增加（P＜0.05），但高劑量組較對照組無顯著差異；中、高劑量組肉雞的料重比較對照組顯著降低（P＜0.05），其中，中劑量組效果最為顯著。上述結(jié)果表明，在肉雞日糧中添加三葉青藤葉粉可顯著提高肉雞平均日增重和降低料重比，但添加高劑量三葉青藤葉粉后，肉雞的平均采食量沒有繼續(xù)增加，可能是因為飼料適口性受到影響。

表2 三葉青藤葉粉對肉雞生長性能的影響Table 2 Effects of THL powder on growth performance of broilers

2.2 三葉青藤葉粉對肉雞免疫功能的影響

胸腺、法氏囊和脾臟是家禽重要的免疫器官，通過免疫器官指數(shù)可以初步衡量機體的免疫功能。由表3 可知，與對照組相比，低、中劑量組的胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；各三葉青藤葉粉添加劑量組的脾臟指數(shù)較對照組有升高趨勢，但差異不顯著。以上結(jié)果表明，添加適當劑量的三葉青藤葉粉可刺激免疫器官發(fā)育，提高機體免疫功能。

表3 三葉青藤葉粉對肉雞免疫指標的影響Table 3 Effects of THL powder on immune indexes of broilers

免疫球蛋白含量也與動物機體免疫功能密切相關(guān)。由表3可知，與對照組相比，各三葉青藤葉粉添加劑量組肉雞血清中IgA、IgM 含量均顯著升高（P＜0.05）；而血清中IgG 含量僅在中、高劑量組中顯著升高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，在日糧中添加三葉青藤葉粉能夠提高肉雞的機體免疫功能，并且中、高劑量組的作用效果更為顯著。

2.3 三葉青藤葉粉對肉雞腸道菌群的影響

根據(jù)添加不同劑量三葉青藤葉粉對肉雞生長性能和免疫功能的影響綜合分析，選擇中劑量組（THL-M）與對照組的肉雞盲腸內(nèi)容物進行菌群對比分析。經(jīng)過序列質(zhì)量控制標準化對比后，共獲得472 091 條高質(zhì)量的有效序列，優(yōu)化后的序列平均長度為416 bp。以97%的序列相似度為標準，將所有序列劃分成796 個OTUs。通過基于Bray-Curtis算法的主坐標分析（principal coordinate analysis,PCoA）進一步分析和評估組間菌群結(jié)構(gòu)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2 組之間的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)存在顯著性差異（圖1），表明添加中劑量三葉青藤葉粉后肉雞腸道菌群的β多樣性發(fā)生改變。

圖1 三葉青藤葉粉中劑量組與對照組間主坐標分析結(jié)果Fig.1 PCoA results between the THL-M group and the control group

通過進一步與數(shù)據(jù)庫進行比對，對OTUs進行物種分類，分別基于各分類水平（門、綱、目、科、屬）分析肉雞盲腸內(nèi)容物中菌群的組成。如圖2A所示，在門水平上，肉雞腸道中的主要菌群為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、脫硫菌門（Desulfobacterota）、互養(yǎng)菌門（Synergistota）和放線菌門（Actinobacteriota）等，其中厚壁菌門和擬桿菌門是最主要的2類菌群，但本研究中這2個優(yōu)勢菌門的相對豐度在2組間無顯著差異，添加中劑量三葉青藤葉粉后，放線菌門和變形菌門（Proteobacteria，包含于其他菌群中）相對豐度有降低趨勢，但無顯著差異。如圖2B所示，在科水平上，添加中劑量三葉青藤葉粉可顯著升高毛螺菌科（Lachnospiraceae）的相對豐度（P＜0.01）。

圖2 組間腸道菌群結(jié)構(gòu)對比Fig.2 Comparison of community structure of intestinal microflora between the groups

采用LEfSe 對THL-M組與對照組肉雞的特異性腸道微生物進行進一步分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，毛螺菌科和梭菌科（Clostridiaceae）為THL-M組肉雞的特征微生物（圖3）。

圖3 組間腸道菌群特征微生物分析Fig.3 Analysis of key phylotypes of intestinal microflora between the groups

3 討論

肉雞的生長性能是衡量其經(jīng)濟效益的重要指標，可以通過平均日增重、平均日采食量、料重比等指標來反映。本研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞基礎日糧中添加不同劑量的三葉青藤葉粉對肉雞的生長性能有積極的促進作用，主要原因可能是三葉青藤葉粉所含的多種活性化合物，如黃酮類、氨基酸類、萜類、強心苷類、甾體類等[6]，可不同程度地影響機體代謝，從而提高肉雞的生長性能。免疫功能是反映肉雞機體健康的重要依據(jù)之一，增強肉雞免疫力可以防止外來細菌、病毒等的入侵，其中免疫器官指數(shù)與肉雞的免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)[7]。在本試驗中，與對照組相比，在日糧中添加低、中劑量的三葉青藤葉粉對肉雞的法氏囊指數(shù)和胸腺指數(shù)都有顯著提升作用。另外，畜禽常常通過體內(nèi)的免疫球蛋白來識別和消除抗原性異物，因此免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）含量可以用來衡量畜禽機體免疫功能的強弱[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞日糧中添加不同劑量的三葉青藤葉粉，可以不同程度地提高肉雞血清中IgA、IgG 和IgM 的水平，這與復方中草藥添加劑通過調(diào)節(jié)肉雞血清免疫球蛋白來提升免疫功能[9]的作用原理相似。本團隊前期研究表明，三葉青的根和葉均可通過免疫調(diào)節(jié)抑制視黃酸受體相關(guān)孤兒受體γ（retinoic acid receptor-related orphan receptorγ,RORγ）的表達，減少白細胞介素-17（interleukin-17,IL-17）和IL-6 的分泌，糾正體內(nèi)輔助性T 細胞（Th17）與調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）比例失衡，從而提高機體免疫功能，進而發(fā)揮抗菌消炎作用，其分子作用機制與調(diào)控p38絲裂原激活的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase, MAPK）和核因子κB（nuclear factor-κB, NF-κB）信號炎癥通路有關(guān)[10-11]。用三葉青葉和苜蓿干草等制成的可溶性纖維日糧，對改善福建黃兔的血液生化指標、免疫功能、養(yǎng)分消化率、腸道形態(tài)、盲腸發(fā)酵等均有積極作用，非常適宜用于福建黃兔（肉兔）的生產(chǎn)[12]。同時，三葉青地上枝葉可以促進肉牛的生長發(fā)育，提高肉牛的抗病能力，還具有毒副作用小、無殘留、無耐藥性等特點[13]，但三葉青藤葉粉在肉雞養(yǎng)殖中的應用及對其腸道菌群的調(diào)節(jié)作用尚未見報道。

腸道作為機體主要的消化吸收場所和重要的免疫器官，擔負著保障動物機體正常的營養(yǎng)消化吸收、免疫調(diào)節(jié)以及有毒有害物質(zhì)分解等重要功能[14]，因此，腸道內(nèi)的微生物多樣性對于維持肉雞健康具有重要作用，其中盲腸內(nèi)的微生物多樣性在不同日齡的肉雞中表現(xiàn)最為豐富[15]。腸道菌群的豐度和多樣性結(jié)構(gòu)受多種因素的影響，包括年齡、飼料結(jié)構(gòu)、環(huán)境外源物的攝入以及病原微生物的感染等[16-17]。中草藥及其多糖類、苷類、生物堿類、揮發(fā)油類、有機酸類等主要活性物質(zhì)，可通過破壞致病菌細胞壁或細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能、抑制體內(nèi)酶活性、影響蛋白質(zhì)和核酸的合成等途徑直接抑制致病菌的生長，還能與腸道菌群相互作用產(chǎn)生具有生物活性的代謝物，間接發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、促生長等作用[18]。已有研究表明，不同中草藥及其主要活性物質(zhì)可在家禽生產(chǎn)中作為飼料添加劑發(fā)揮作用，而且進入消化道的活性物質(zhì)可通過改善菌群結(jié)構(gòu)、增強肉雞免疫功能，從而提高肉雞的生長性能[19]。例如，中草藥提取物可顯著降低肉雞回腸內(nèi)容物中大腸埃希菌的含量，顯著提高乳桿菌的含量，從而改善腸道菌群組成，提高肉雞生長性能和免疫功能[20-21]。本研究中，不同劑量的三葉青藤葉粉對肉雞生長性能（平均日采食量、平均日增重和料重比）和免疫功能（免疫器官指數(shù)和血清中免疫球蛋白含量）均有不同程度的改善作用，其中以中劑量（3%）三葉青藤葉粉的促進效果最為顯著。因此，選擇中劑量組和對照組的肉雞盲腸內(nèi)容物進行腸道菌群組成對比分析，進一步發(fā)現(xiàn)2組間肉雞腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。在門水平上，與對照組相比，THL-M組肉雞盲腸中放線菌門和變形菌門的相對豐度呈下降趨勢，其中變形菌門細菌為革蘭氏陰性菌，包含多種致病微生物，如幽門螺桿菌、沙門菌、志賀菌等[22]，這些致病微生物可引發(fā)多種胃腸道炎癥性疾病，進而影響動物的免疫功能和生長速度[23]。因此，三葉青藤葉粉對變形菌門相對豐度的有效調(diào)控有利于保護動物的腸道健康。通過進一步的差異菌群分析發(fā)現(xiàn)，添加中劑量三葉青藤葉粉可明顯增加毛螺菌科和梭菌科的相對豐度。毛螺菌科屬于腸道環(huán)境中相對豐度最高的厚壁菌門，且約占厚壁菌門的50%。部分毛螺菌科細菌在厭氧環(huán)境下，可以發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生短鏈脂肪酸（如甲酸、乙酸、丙酸）、乳酸、乙醇等物質(zhì)，其產(chǎn)物短鏈脂肪酸在抑制有害菌的定植、提高緊密連接蛋白的表達、維持結(jié)腸黏膜屏障功能和調(diào)節(jié)免疫抑制促炎因子等方面發(fā)揮重要作用[24]；并且，毛螺菌科特別適合降解多種難降解的底物，這些底物（主要是乙酸酯、丁酸酯和丙酸酯）可以被微生物發(fā)酵并轉(zhuǎn)化為短鏈脂肪酸，被宿主吸收利用，以便為機體提供能量[25]。梭菌科也與機體攝入過多能量有關(guān)[26]，因為梭菌科細菌可以吸收膳食類脂肪和脂肪性纖維素，促進脂質(zhì)吸收，維持腸道屏障功能，傳導內(nèi)分泌功能信號，從而調(diào)節(jié)甘油三酯、膽固醇、葡萄糖的平衡[27]。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，三葉青藤葉粉可通過調(diào)節(jié)腸道菌群，增加肉雞腸道中毛螺菌科和梭菌科的相對豐度，進而影響宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，提高肉雞生長性能。同時，在飼料中添加適量（3%）三葉青藤葉粉還有助于抑制有害菌（多來自放線菌門和變形菌門）的生長來維持腸道微生態(tài)平衡并加強宿主的免疫功能，進而減少或避免腸道炎癥以及其他疾病的發(fā)生，促進肉雞健康生長。然而，當三葉青藤葉粉添加劑量繼續(xù)增加到5%時，肉雞的采食量卻并未繼續(xù)增加，可能是高劑量三葉青藤葉粉中的揮發(fā)性活性物質(zhì)引起肉雞食欲下降所致。因此，建議選擇3%及以下劑量的三葉青藤葉粉作為禽類飼料添加劑用于改善肉雞生長性能和免疫功能。