不同廠家二丁顆粒微生物限度檢查方法建立及結(jié)果分析評(píng)價(jià)

李昀錚

松原市食品藥品檢驗(yàn)所，吉林 松原 138000

二丁顆粒具有清熱解毒、利濕退黃的功效，臨床上多用于熱癤癰毒、咽喉腫痛、風(fēng)熱火眼等相關(guān)疾病的治療[1-2]。其主要藥材如紫花地丁、蒲公英以及板藍(lán)根等都具有一定的抑菌效果，因此在對(duì)其進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，原則上必須遵照《中國藥典》要求的方法，先開展供試液抑菌活性的消除工作，之后再推進(jìn)下一步的檢查。

本研究通過對(duì)5 個(gè)相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)中的15 批次二丁顆粒進(jìn)行檢測，利用方法學(xué)驗(yàn)證來找出合適的微生物限度檢驗(yàn)方式，進(jìn)而對(duì)選中的5 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)中15 批次的二丁顆粒進(jìn)行微生物限度檢驗(yàn)，然后對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和探討，以期為眾多二丁顆粒生產(chǎn)企業(yè)提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BSC-1304IIA2 蘇凈安泰生物安全柜、BHC-1300IIA2 蘇州安泰生物安全柜、BXP-280S 智能微生物培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），SPX-150 生化培養(yǎng)箱(揚(yáng)州慧科電子有限公司)，BPX-272 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），BAXSystem Q7 全自動(dòng)病原微生物快速檢測系統(tǒng)（美國-杜邦），SHZ-82A 水浴恒溫振蕩器（金壇市白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠），移液器（德國VITLAB），YXQ-LS-100SII 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 樣品

本次實(shí)驗(yàn)所用到的二丁顆粒是5 家公司共15個(gè)批次的產(chǎn)品，見表1。

表1 二丁顆粒生產(chǎn)廠家及批次

1.2.1 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA，批號(hào)：220426）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（9S-CD，批號(hào)：220519）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA，批號(hào)：220616）；麥康凱液體培養(yǎng)基（批號(hào)：220426）；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：220505）。上述培養(yǎng)基均已通過培養(yǎng)基適用性檢查。

1.2.2 稀釋液

pH 為7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào)：220118)，0.05%（V/V）聚山梨酯80 稀釋液，pH 為7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和稀釋液均購于北京路橋技術(shù)股份有限公司。0.9%氯化鈉，購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)：20200916）。

1.2.3 菌種（傳代次數(shù)，來源）

金黃色葡萄球菌ATCC6538：第1 代；銅綠假芽孢桿菌ATCC9027：第1 代；枯草芽孢桿菌ATCC6633：第1 代；白色念珠菌ATCC10234：第1 代；黑曲霉菌ATCC16404：第1 代；大腸埃希菌ATCC25922：第1代。來源：美國菌種保藏中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

遵照《中國藥典》2020 版四部通則1108 的規(guī)定進(jìn)行配制[3]。

2.2 供試液的制備

取供試品10 g，加入100 mL pH 為7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，置于40 ℃恒溫水浴并振蕩直至其完全溶解，即得到1∶10 的供試液A。利用逐級(jí)稀釋法，再得到1∶100 的稀釋液樣品b 和1∶1 000 的稀釋液樣品c。

2.3 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

陽性菌組：從“2.1”選項(xiàng)中提前準(zhǔn)備好的稀釋級(jí)菌液中，取出0.1 mL 制備好的菌液（菌量不大于10 000 CFU/mL），將其加入9.9 mL pH 為7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，根據(jù)規(guī)定量和方法注入平皿和規(guī)定的培養(yǎng)基中，將按照規(guī)定時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)后測得的菌數(shù)記作a；試驗(yàn)組對(duì)照組：取5 份10 mL 供試液A 分別和5 種含有0.1 mL 試驗(yàn)菌的菌液置于無菌管中，混勻，并按照上述方法測得菌數(shù)b；供試液對(duì)照組：取10 mL 供試液A 和0.1 mL pH為7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液置于無菌管中，按上述方法測得菌數(shù)c；計(jì)數(shù)結(jié)果按照如下公式進(jìn)行計(jì)算：回收率：R=（b-c）/a×100%，當(dāng)R 值在0.5～2范圍內(nèi)對(duì)，可認(rèn)為此法能夠用于該樣本細(xì)菌數(shù)量的統(tǒng)計(jì)[4-5]。

基于二丁顆粒的抑菌作用，采用供試液按照1:10 培養(yǎng)基稀釋法（5 倍稀釋法即在5 個(gè)平皿中，每個(gè)皿中都含有供試液0.2 mL，各加入15～20 mL 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基）作為需氧菌總數(shù)進(jìn)行計(jì)算，按照規(guī)定量和方法注入平皿與規(guī)定的培養(yǎng)基中，并按規(guī)定時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)后測得回收率的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)表明，以上5 種菌株的回收率范圍均在0.5～2 之間。

2.4 大腸埃希菌檢驗(yàn)方法適應(yīng)性檢驗(yàn)

試驗(yàn)組：將10 mL 供試液A 接種到100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，并將其與大腸桿菌的菌懸液（不大于100 CFU）混合。陽性對(duì)照組：將1 mL 大腸埃希菌菌懸液加入100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。供試液對(duì)照組：用供試品代替試驗(yàn)組液體進(jìn)行試驗(yàn)。陰性對(duì)照組：同批滅菌配制、完成滅菌的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。以上試驗(yàn)組、陽性對(duì)照組、供試液組及陰性對(duì)照組均按《中國藥典》2020年版的四部要求進(jìn)行試驗(yàn)。

測試結(jié)果顯示，在15 批次的檢驗(yàn)樣本中，在測試的對(duì)照和陽性對(duì)照樣本中，大腸埃希菌都是在測試樣本（加菌）生長的，供試組（未加菌）以及陰性對(duì)照組中均沒有生長表現(xiàn)。由此可以得出，此方法適用于本品的控制菌檢查。

2.5 此次微生物限度檢驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)此次的檢驗(yàn)結(jié)果，本次試驗(yàn)二丁顆粒的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)如下：需氧菌總數(shù)不可以超過103CFU/g；霉菌和酵母菌法的總數(shù)不可以超過102CFU/g；不可以檢出大腸埃希菌。

此次微生物限度檢驗(yàn)結(jié)果如下：此次試驗(yàn)中15批次的二丁顆粒需氧菌總數(shù)，霉菌和酵母菌總數(shù)合格率為100%，都沒有檢出大腸埃希菌。

3 分析

二丁顆粒中的紫花地丁、蒲公英、板藍(lán)根等藥材均具有抑菌性。其中紫花地丁提取物的抑菌活性按照大小順序依次為：停乳鏈球菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞無乳鏈球菌＞乳房鏈球菌＞沙門氏菌[6]。其中蒲公英的多項(xiàng)成分如總黃酮、多糖綠原酸分別對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、枯草芽草桿菌等有抑制作用[7]；板藍(lán)根能有效抑制金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，具有光譜抗菌作用[8]。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同藥廠經(jīng)過工藝提取后的二丁顆粒對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抗菌效果各不相同，這可能是因?yàn)槊總€(gè)廠家的工藝不同，受工藝影響，其抑菌強(qiáng)度也會(huì)有所變化。相信隨著技術(shù)水平的提高與工藝的完善，中藥口服制劑受到的污染因素會(huì)有所減少，使微生物限度檢查指標(biāo)提升，藥品質(zhì)量控制進(jìn)一步發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

本文通過對(duì)15 批次二丁顆粒微生物限度的方法學(xué)檢驗(yàn)，得出如下結(jié)果：需氧細(xì)菌總數(shù)的測定可以使用培養(yǎng)基稀釋法，霉菌、酵母菌、大腸埃希菌的測定可以使用常規(guī)法。最終研究結(jié)果表明，來自5 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)的15 個(gè)批次二丁顆粒的微生物限度檢查結(jié)果都符合規(guī)定。