Sox9在四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化模型中的機(jī)制研究

吳鐘英 周國(guó)琴 李鵬

(貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心,貴州 貴陽(yáng) 550004)

肝臟因受到諸如酒精、藥物或者病毒感染等引起的慢性損傷不能及時(shí)的再生性修復(fù)時(shí)便會(huì)形成以纖維化為主要特征的病理性修復(fù)[1]。在這個(gè)過程中,肝臟中纖維組織過度沉積、降解減少,從而導(dǎo)致纖維增生和分解不平衡的結(jié)果。反復(fù)或持續(xù)的慢性肝實(shí)質(zhì)損傷、炎癥可使細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)— 主要成分為膠原纖維合成過多而降解相對(duì)不足而最終形成肝纖維化,甚至還可能發(fā)展為肝硬化、肝功能衰竭和肝癌[2]。Sox9是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子,因其與性別決定基因Y DNA結(jié)合位點(diǎn)具有高度相似性而得名[3]。在正常的肝臟中表達(dá)Sox9的肝祖細(xì)胞會(huì)逐漸分化成替代肝臟內(nèi)的成熟肝細(xì)胞[4]。Sox9除作為肝臟祖細(xì)胞的特征性分子之外,在多個(gè)器官(包括睪丸、胰腺、腸道、大腦、腎臟和心臟)的發(fā)育過程中起重要作用[5-7]并調(diào)控多種生物學(xué)過程,比如促進(jìn)細(xì)胞增殖和癌癥的發(fā)生等[8]。本研究從CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化中分離出肝細(xì)胞,并檢測(cè)到肝細(xì)胞中的Sox9在肝臟纖維化過程中的增加,在細(xì)胞水平探討Sox9在四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)的肝纖維化模型中的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雄性C57小鼠40只,4周齡,體質(zhì)量(20±2)g;本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2001161)。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心恒溫22～24℃,相對(duì)濕度50%～60%,光照/黑暗周期12 h的特定無(wú)病原體條件下。

1.2主要藥物與試劑 四氯化碳(CCl4,規(guī)格:500 ml,批號(hào):201986,徐州天鴻化工有限公司);抗Sox9(1:50 00,ab185966,Abcam,美國(guó))。玉米油(規(guī)格:500 ml,批號(hào):1020B053,北京索萊寶科技有限公司)。

1.3主要儀器 儀器SN267839連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品;DYY-BC電泳儀、北京六一生物科技有限公司,CFX96熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)儀,美國(guó)伯樂公司產(chǎn)品,C600凝膠成像系統(tǒng),Azure公司。

1.4方法

1.4.1分組與造模 將40只4周齡C57小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分為空白組(10只)和模型組(30只)。造模方法參考文獻(xiàn)[9-10],模型組腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為10%的CCl4溶液(按照玉米油:CCl4=9∶1配制而成),每次注射劑量5ml/kg,3次/w,持續(xù)5 w,制造HF模型?？瞻捉M,經(jīng)腹腔注射等體積生理鹽水,3次/w,持續(xù)5 w。3～4w后,每組隨機(jī)抽取3只小鼠,對(duì)其進(jìn)行肝組織染色檢驗(yàn),顯示建立CCl4誘導(dǎo)小鼠HF模型成功。

1.4.2動(dòng)物一般狀態(tài) 實(shí)驗(yàn)過程中每日觀察并記錄各組小鼠的精神、飲食、活動(dòng)、體質(zhì)量、皮毛等情況。

1.4.3小鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化 取出小鼠部分肝臟組織,以4%多聚甲醛固定24 h,流水沖洗數(shù)小時(shí)(3～8 h),濃度梯度酒精法進(jìn)行脫反復(fù)脫水、二甲苯透明、浸蠟、組織包埋、組織切片、貼片、化蠟、封閉、孵育一抗、二抗等按標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。然后鏡下觀察,并染色觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.4.4Western印跡檢測(cè)小鼠肝組織中Sox9蛋白表達(dá)量 用全蛋白提取試劑盒,提取C57小鼠肝組織蛋白,經(jīng)二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白含量檢測(cè)試劑盒,測(cè)定小鼠肝臟組織中蛋白濃度。每孔加18μg樣品,數(shù)小時(shí)后蛋白分離,取膠并切割膠塊,隨后將轉(zhuǎn)膜液潤(rùn)濕的海綿、濾紙、膠、PVDF膜、濾紙、海綿的依次入在轉(zhuǎn)膜夾板中夾緊,放置于轉(zhuǎn)膜槽倒入轉(zhuǎn)膜液,將電泳槽整體泡在冰水混合物中,轉(zhuǎn)膜成功后,經(jīng)5%脫脂奶粉在常溫下進(jìn)行封閉4 h,再進(jìn)行洗膜3次后,5 min/次。后加入兔抗-Sox9(1∶1 000)、兔抗-GAPDH(1∶1 000),4℃過夜,次日收取一抗,后洗膜3次,5 min/次。加入山羊抗兔的二抗(1∶1 000),室溫孵育2 h,洗膜3次后,圖像采集,Image J軟件分別計(jì)算Sox9與GAPDH灰度值的比值。

1.4.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠肝組織中Sox9的表達(dá)水平 取小鼠肝組織80～100 mg,加入TRIzol后,用剪刀剪碎,放在-80 ℃冰箱預(yù)冷并轉(zhuǎn)入研磨器中,加入氯仿,12 000 g的離心力離心,可見EP管中出現(xiàn)分層,上層為透亮色,下層為粉紅色,將上層吸取液體轉(zhuǎn)移至另一個(gè)EP管中,滴加氯仿,加入冰箱預(yù)冷的異丙醇,劇烈震蕩使其充分混勻,離心力離心10 min,加入70%乙醇震蕩,離心力離心棄上清液,加入DEPC水溶解RNA,1μl溶解的RNA,超微量紫外分光光度計(jì)上測(cè)量RNA的濃度和純度。嚴(yán)格按照試劑盒要求及說明書合成cDNA,設(shè)計(jì)引物,反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 30 s變性95℃ 10 s退火65 ℃ 10s延伸72 ℃ 30 s,其中變性95 ℃ 10 s退火65 ℃ 10 s延伸72 ℃ 30 s這個(gè)過程循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 正常對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好,毛色光亮,雙眼有神,反應(yīng)敏銳,飲食正常,體質(zhì)量逐增,無(wú)死亡情況。而模型組小鼠,皮毛發(fā)黃且造模,2～3W后小鼠大部分出現(xiàn)炸毛現(xiàn)象,雙眼乏神,行動(dòng)緩慢、反應(yīng)遲鈍,食量減退,較同時(shí)期空白組小鼠體質(zhì)量減輕。

2.2Sox9在四氯化氮誘導(dǎo)的肝纖維化模型中表達(dá)升高 通過qRT-PCR的使用,檢測(cè)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中Sox9的表達(dá),結(jié)果表明CCl4誘導(dǎo)后肝組織中Sox9顯著增加,并在肝纖維化發(fā)展中保持高水平(圖1)。如圖所示:CCl4誘導(dǎo)后肝組織中Sox9的表達(dá)在1W、2W、3W后逐漸升高,而正常對(duì)照組變化不明顯。

圖1 Sox9在四氯化氮誘導(dǎo)的肝纖維化模型中表達(dá)升高

2.3Western印跡檢測(cè)小鼠肝組織中Sox9蛋白表達(dá)量升高 提取3W、4W的肝臟組織,經(jīng)Western 印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Sox9的蛋白表達(dá)量升高明顯,明顯高于正常對(duì)照組(圖2)。可見在肝纖維化過程中,Sox9發(fā)揮重要作用。

圖2 Western印跡中,正常肝組織與CCl4誘導(dǎo)的纖維化肝臟中Sox9分子的表達(dá)

2.4經(jīng)免疫組化驗(yàn)證四氯化氮誘導(dǎo)的肝纖維化模型中Sox9表達(dá)量升高。然后,我們用Sox9特異性抗體對(duì)纖維化肝臟進(jìn)行染色,并證實(shí)了纖維化肝臟不同細(xì)胞成分中Sox9的增加(圖3)。

圖3 免疫組化中,對(duì)照組與四氯化氮誘導(dǎo)的肝組織中Sox9分子的表達(dá)

3 討 論

肝纖維化是以肝內(nèi)纖維組織過度沉積、降解減少為主要病理特征的疾病,這主要是因?yàn)楦闻K受到慢性損傷時(shí)不能及時(shí)修復(fù)而引起的病理性修復(fù)。在肝纖維化形成的過程中,即有肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell,HSC)的活化,也有免疫細(xì)胞的募集和表型的改變,并伴隨著肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞上皮向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)。目前對(duì)肝纖維化的研究均集中在HSC的激活、肝內(nèi)免疫細(xì)胞的功能改變以及肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞EMT的分子調(diào)控機(jī)制,并有可能通過干預(yù)這些過程達(dá)到逆轉(zhuǎn)和緩解肝纖維化進(jìn)程的目的。作為肝臟結(jié)構(gòu)和功能的主要細(xì)胞,肝細(xì)胞在受到損傷后,一部分細(xì)胞會(huì)凋亡壞死,另外一部分會(huì)在損傷的肝臟微環(huán)境境中發(fā)生特異性的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變,即EMT的發(fā)生,而肝細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變會(huì)促進(jìn)肝纖維化的形成,這個(gè)過程往往受多種促纖維化分子(比如:TGF-β)的調(diào)節(jié)[12]。Sox9是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子,被認(rèn)為與肝纖維化過程中細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生關(guān)系密切。正常肝內(nèi)膽管存在表達(dá)Sox9的肝祖細(xì)胞,通過細(xì)胞譜系示蹤顯示,在正常的肝臟中表達(dá)Sox9的肝祖細(xì)胞會(huì)逐漸分化成替代肝臟內(nèi)的成熟肝細(xì)胞,在CCl4和膽管結(jié)扎兩種損傷模型中,表達(dá)Sox9的肝祖細(xì)胞就會(huì)增殖分化為肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞來修復(fù)損傷的肝臟[13]。Sox9除作為肝臟祖細(xì)胞的特征性分子之外,在多個(gè)器官的發(fā)育過程中起重要作用并調(diào)控多種生物學(xué)過程,比如在神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移過程中起到調(diào)節(jié)EMT24-26和促進(jìn)細(xì)胞增殖和癌癥的發(fā)生等[14]。但在不同發(fā)育階段, Sox9的任何不正常的表達(dá)量或異位表達(dá)都可能導(dǎo)致疾病[15]。另外,在損傷的修復(fù)過程中需要干細(xì)胞的活化,Sox9可能通過影響干細(xì)胞的功能導(dǎo)致組織細(xì)胞的惡變,如Sox9在膀胱癌中的表達(dá)是明顯上調(diào)的,但在在膀胱損傷修復(fù)中是激活的[16]。沉默或降低細(xì)胞中Sox9的水平后,細(xì)胞分裂和細(xì)胞的增殖有關(guān)的磷酸化組蛋白3 表達(dá)量均明顯減少[17]。Sox9作為一種轉(zhuǎn)錄因子,在不同器官的纖維化發(fā)展過程中調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞中的骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)和膠原。最新報(bào)告顯示,通過對(duì)Sox9缺失的HSC的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和實(shí)驗(yàn)分析和功能分析,超過30%的Sox9調(diào)控的基因與ECM有關(guān)[18]。我們已證明,在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中,Sox9的蛋白濃度會(huì)隨著纖維化的嚴(yán)重程度而改變。到目前為止,肝細(xì)胞Sox9在肝纖維化進(jìn)展中的失調(diào)仍有許多待確定。在這里,我們從CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化中分離出肝細(xì)胞,并檢測(cè)到肝細(xì)胞中的Sox9在肝臟纖維化過程中的增加。那么,Sox9在小鼠肝纖維化中的作用能否在人類身上表達(dá)一致:人類肝損傷后Sox9的檢測(cè)結(jié)果與在小鼠身上觀察到的結(jié)果是否相同;在我們的研究者中發(fā)現(xiàn),小鼠肝臟中Sox9表達(dá)的量與纖維化的嚴(yán)重程度密切相關(guān);那么,Sox9在疾病早期的表達(dá)量,是否與預(yù)測(cè)人類肝纖維化的進(jìn)展程度有關(guān)。同時(shí),Sox9表達(dá)量,與其他纖維化風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)比較是否更有優(yōu)勢(shì)、表現(xiàn)更好,不得而知。并且可能有助于肝纖維化患者的分層,如肝纖維化、肝硬化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分,需要更多的研究及關(guān)注。