銅綠假單胞菌prtN突變引起甲氧芐啶耐藥

摘要 耐藥銅綠假單胞菌（PAO1）在臨床感染過程中造成非常棘手的問題，研究其耐藥機制有助于臨床的治療。研究結果表明，相對于野生型，ΔprtN表現(xiàn)出明顯的甲氧芐啶（Tmp）抗性。為了了解其抗性出現(xiàn)的機理，測定了Tmp作用靶點folA的表達情況。相比于PAO1， folA在ΔprtN中的表達并未升高，反而有所下降。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PrtN調(diào)控的S型綠膿桿菌素基因和prtN的雙突變體對Tmp的抗性稍有降低，而脂多糖缺陷菌株ΔwbpL對Tmp的抗性略有升高。在ΔprtN中活性氧（ROS）相關基因（oxyR，katA，ahpC）的表達水平、生物被膜及外排泵相關抗生素抗性檢測結果都顯示與野生型無顯著性差異。綜上， prtN基因突變引起的Tmp抗性可能是通過PrtN調(diào)控S型綠膿桿菌素及脂多糖相關靶標作用的結果。

關鍵詞 綠膿桿菌素； prtN； 甲氧芐啶； 脂多糖； ROS

中圖分類號：R378 DOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2024-05-013

Trimethoprim resistance in Pseudomonas aeruginosa is

instigated by genetic mutations in the prtN gene

XIAO Yue，WANG Chong，SI Yujie，HAN Xue， DUAN Kangmin，CHEN Lin

（Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China， Ministry of Education/

College of Life Sciences， Northwest University， Xi’an 710069， China）

Abstract Antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa（PAO1） poses a significant challenge in clinical infections， highlighting the importance of studying its resistance mechanisms for improving clinical treatments. Our study found that the ΔprtN exhibited significant resistance to trimethoprim （Tmp） compared to the wild type. To elucidate the underlying mechanism of this resistance， we assessed the expression of folA， the target of Tmp. Interestingly， folA expression in ΔprtN was not elevated， instead but rather decreased compared to the PAO1 strain. Further investigations revealed that a double mutant lacking both the PrtN-regulated S type pyocin biosynthesis gene and prtN exhibited slightly reduced Tmp resistance. In contrast， the lipopolysaccharide-deficient strain ΔwbpL showed slightly increased Tmp resistance.In ΔprtN， the expression levels of reactive oxygen species（ROS）-related genes （oxyR， katA， ahpC）， biofilm formation， and antibiotic resistance associated with efflux pumps showed no significant difference compared to the wild type.In conclusion， the Tmp resistance observed in the prtN mutant is likely due to the regulatory effects of PrtN on S-type pyocins and lipopolysaccharide-related targets.

Keywords pyocin; prtN; trimethoprim; LPS; ROS

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PAO1）是一種常見的革蘭氏陰性機會致病菌，其致病性在于能夠產(chǎn)生很多毒力因子，其中綠膿桿菌素是銅綠假單胞菌特有的一種細菌毒素，根據(jù)其結構和作用模式，已確定了3種類型的綠膿桿菌素R型、F型和S型^［1］。PAO1中綠膿桿菌素合成過程主要受兩個基因控制，prtR的負調(diào)控和prtN的正調(diào)控。在SOS反應被激活后，RecA促進PrtR的切割，導致PrtN的解除抑制和隨后的膿毒桿菌素合成基因的上調(diào)^［2］。

作為醫(yī)院中6種易感染且耐藥的菌株之一，銅綠假單胞菌對很多抗生素都具有一定抗性^［3］。甲氧芐啶（Trimethoprim，Tmp）是一種廣譜、低毒性抗生素，被廣泛應用于臨床抑菌治療。其抑菌和殺菌機制已被報道：由于Tmp競爭性抑制二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR），阻礙葉酸代謝，最終影響核酸合成，從而抑制細菌的生長和繁殖^［4］;在2017年還發(fā)現(xiàn)Tmp存在新的抗菌機制，在細菌內(nèi)部誘發(fā)活性氧（reactive oxygen species， ROS），進一步引發(fā)SOS導致細菌死亡^［5］。目前，細菌對抗生素產(chǎn)生抗性的普遍機制可分為：①減少抗生素的進入，促進抗生素的外排^［6］；②改變抗生素作用的靶點，如Abdizadeh等人發(fā)現(xiàn)大腸桿菌L28R突變體通過延長酶與底物復合物的結合時間間接獲得抗性^［7］；③甲氧芐啶耐藥通常是由于自發(fā)突變導致編碼DHFR的基因擴增或過表達，以及DHFR酶中的多個氨基酸替換^{［4，8］}；④染色體上基因編碼天然耐藥的二葉酸還原酶^［9］，而近年對于甲氧芐啶耐藥性的研究主要集中在于細菌獲得耐藥性dfr基因，其主要機制是獲得A型（DfrA）或B型（DfrB）Tmp抗性二氫葉酸還原酶^［10-11］。自1972年報道第一個質粒介導的dfr基因以來，已在革蘭氏陰性菌中鑒定出40多個不同的dfr基因^［12-13］。

實驗室前期發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌PAO1中基因prtN（PA0610）和topA的雙突變體對甲氧芐啶表現(xiàn)出明顯的抗性^［14］，經(jīng)過驗證確定了Tmp抗性表型來源于基因prtN的突變。從Tmp作用靶點和普遍耐藥菌的抗性機制如外排泵系統(tǒng)、生物被膜等著手，發(fā)現(xiàn)都與之無關。為了研究prtN突變?nèi)绾我餞mp抗性，本文構建prtN調(diào)控的綠膿桿菌素相關基因的單突變以及與ΔprtN的雙突變體，結果發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌素相關基因單突變體表現(xiàn)出與野生型相同的Tmp抗性，而雙突變體中S型雙突變體的抗性相比于ΔprtN有所降低。同時發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌的突變體ΔwbpL（其缺失了R型綠膿桿菌素的結合位點）表現(xiàn)出了一定的Tmp抗性。由于Tmp可通過引發(fā)細菌內(nèi)部ROS最終導致細菌裂解死亡，因此，對ROS相關基因的轉錄水平進行了測定，檢測結果顯示在野生型和突變體中并未有任何差異，表明ROS與ΔprtN抗性產(chǎn)生的原因無關。

1 材料及方法

1.1 材料

試劑：Tetracycline （Tcn） 10 mg/mL，Azithromycin （Azi） 5 mg/mL 使用體積分數(shù)75％乙醇溶解，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩anamycin （Kan） 10 mg/mL，Ampicillin （Amp） 50 mg/mL，Trimethoprim （Tmp） 20 mg/mL，Carbenicillin （Car） 50 mg/mL，Meropenem （Mep） 50 mg/mL，Chloramphenicol （Chl） 10 mg/mL，Ciprofloxacin （Cip） 1 mg/mL，Gentamycin （Gen） 10 mg/mL， 使用雙蒸水溶解后， 使用0.22 μm濾膜過濾除菌， 保存于4 ℃?zhèn)溆谩?.01 M磷酸鹽緩沖液（PBS）及0.3 M蔗糖溶液滅菌后室溫保存。無縫克隆試劑盒（貨號：TSV-S1購于北京擎科）。

本文使用的菌株和質粒如表1所示，所用引物如表2所示，試劑濃度均為體積分數(shù)。

1.2 方法

1.2.1 突變體及互補菌株的構建

采用無縫克隆的方法構建敲除突變體的載體。利用同源重組的方法構建突變體^［15］。簡單來說，基因上下游片段PCR產(chǎn)物酶切純化后與pEX18Tc載體連接。在驗證正確后，通過三親株雜交的方法經(jīng)過二次篩選得到目的基因突變體。

回補體構建：將目的基因與mini-CTX-lacZ質粒連接后導入大腸桿菌，使用三親株方法整合到基因組上^［14］。

1.2.2 整合型發(fā)光報道子的構建

pMS402與目的基因啟動子經(jīng)過酶切連接后，導入大腸桿菌并進行驗證，正確后使用PacⅠ酶切，酶切后會形成兩個片段，包含啟動子和發(fā)光基因的大片段經(jīng)切膠純化后與CTX6.1連接，連接驗證正確后使用三親株雜交的方式將發(fā)光報道子整合到相應菌株的基因組^［16］。

1.2.3 最低抑制濃度（MIC）

過夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌轉接1％到新鮮液體LB中37 ℃活化3 h，接5 μL活化后的菌液加入含有新鮮LB和不同濃度抗生素的96孔板中，使得每孔總體積為100 μL，最后加入60 μL石蠟防止液體揮發(fā)。用酶標儀每30 min測定一次OD₆₀₀，持續(xù)24 h^［17］。

1.2.4 抗生素敏感性檢測CFU法

挑取單克隆接種到液體LB中， 37 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)。將菌液OD₆₀₀值調(diào)到0.2，吸取100 μL菌液加入900 μL液體LB中使其稀釋10倍，重復6次至梯度稀釋至10^-6。從10^-2濃度起在不同濃度的平板和對照平板上點樣菌液3 μL，待菌液滲入平板后置于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，待菌落長出觀察生長情況^［18］。

1.2.5 胞外多糖檢測

挑取單克隆菌株接種到液體LB中過夜培養(yǎng)后吸取部分菌液按1％接種量加入到新鮮液體LB中，于37 ℃，200 r/min培養(yǎng)16～18 h。調(diào)節(jié)菌液OD₆₀₀為0.2左右，分別吸取3 μL點在剛果紅平板上。待菌液滲入后于37 ℃培養(yǎng)48 h。觀察菌株胞外多糖產(chǎn)量變化^［19］。

1.2.6 生物被膜產(chǎn)量測定

結晶紫染色法測定生物被膜產(chǎn)量^［20］。過夜培養(yǎng)菌液調(diào)至OD₆₀₀為0.5。取部分菌液按1％接種量加入到新鮮液體LB中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h后棄去管內(nèi)菌液。用PBS洗滌除去殘余菌液后加入結晶紫進行染色。30 min后棄去試管內(nèi)結晶紫，并用ddH₂O清洗，觀察染色情況，最后用1 mL 95％乙醇洗下生物被膜后測定OD₅₉₅。

2 研究結果

2.1 ΔprtN具有Tmp抗性

實驗室前期偶然發(fā)現(xiàn)ΔprtNtopA-RM具有明顯Tmp抗性。為了確定抗性出現(xiàn)的具體來源，分別構建了prtN的缺失突變體ΔprtN和ΔtopA-RM（topA基因在PAO1中無法敲除，所以ΔtopA-RM是前期研究篩選得到的重組突變菌株）^［14］。 平板敏感性檢測和MIC測定結果表明〔見圖1（a）、表3〕，ΔprtN與雙突變體ΔprtNtopA-RM都表現(xiàn)出一致且明顯的Tmp抗性，而ΔtopA-RM對Tmp的敏感性和野生型PAO1一致。研究結果表明，單獨prtN基因的突變導致Tmp抗性的產(chǎn)生，而與topA基因的突變與否沒有關系。并且為了進一步確定Tmp抗性表型來源于prtN基因的缺失，使用同源重組的方法（mini-CTX-lacZ作為載體）回補prtN基因的突變?；匮a菌株CFU和MIC測定結果（結果未列出）都能夠恢復ΔprtN的抗性表型至野生型水平〔見圖1（b）〕。

2.2 Tmp抗性產(chǎn)生與其作用靶點、生物被膜及外排泵的關系

Tmp作用靶點是二氫葉酸還原酶，通過抑制二氫葉酸還原酶的活性阻止葉酸合成從而抑制細菌的生長^［4］。銅綠假單胞菌中二氫葉酸還原酶由folA（PA0350）基因編碼。為了確定是否由于folA基因突變或高表達造成Tmp的抗性產(chǎn)生，首先通過PCR擴增后測序確定其是否發(fā)生突變，結果顯示基因并未發(fā)生任何堿基突變（結果未列出）。然后，構建了folA的發(fā)光報道子CTX-folA，并將其整合入ΔprtN與野生型基因組中觀察表達情況。結果如圖2所示，突變體中folA的表達相比于野生型降低近1倍。

銅綠假單胞菌的生物被膜主要是由分泌的胞外多糖形成，胞外多糖能夠通過共價鍵、范德華力等作用吸附一部分抗菌素增強菌體的抵抗能力^［21］。因此，生物被膜是抗生素發(fā)揮作用的第一道屏障，它能夠有效地減少抗生素和菌體的接觸，很多抗性增強的突變體便是由于生物被膜厚度增加導致^［22］。剛果紅染色觀察菌落的顏色深淺可以判斷出胞外多糖的產(chǎn)量多少^［23］。結晶紫染色法可以檢測生物被膜產(chǎn)量。本研究比較了ΔprtN和野生型的胞外多糖以及生物被膜，結果顯示并未有顯著性差異〔見圖3（a）、（b）〕。

除了生物被膜外，銅綠假單胞菌的外排泵家族在耐藥性方面也起著重要作用，外排泵家族能夠降低抗生素在菌體內(nèi)的濃度。目前已知與Tmp抗性相關的外排泵主要有3種^［24-25］：MexAB-OprM、MexCD-OprJ和MexEF-OprN。MexAB-OprM主要介導Mep抗性^［26］;MexCD-OprJ和Azi抗性相關^［27］;MexEF-OprN引起Chl抗性^［28］。通過測定ΔprtN和野生型的MIC，發(fā)現(xiàn)ΔprtN對3種抗生素的敏感性沒有發(fā)生變化（見表4）。因此，3種外排泵并未參與ΔprtN對Tmp抗性產(chǎn)生的過程。

2.3 綠膿桿菌素在Tmp抗性中的作用

有文獻報道R2型和F2型綠膿桿菌素合成量的降低會增強菌體對環(huán)丙沙星和氟喹諾酮類的抗性^［29］。因此，ΔprtN對Tmp抗性的增強也有可能是相同的原因導致的。在PAO1中有3類共5種綠膿桿菌素（見表5）：R2（PA0614-PA0627）、F2（PA0632-PA0648）、S2（PA1150）、S4（PA3866）和S5（PA0985）^［30］。通過構建這5種綠膿桿菌素的野生型缺失突變體和ΔprtN中的缺失突變體并檢測對Tmp的MIC來驗證本文的假設。其中R2型綠膿桿菌素基因中敲除了編碼尾鞘蛋白和尾管蛋白的PA0622和PA0623;敲除F2型綠膿桿菌素基因中編碼尾部蛋白的PA0633。由于R2型和F2型綠膿桿菌素多被報道在菌體表現(xiàn)抗生素抗性中起著相對重要的作用，因此還構建了二者的雙突變體。在綠膿桿菌素基因的敲除并沒有影響菌體的生長速率條件下，測定了它們對Tmp的敏感性。結果顯示，S型綠膿桿菌素和ΔprtN的雙突變體對Tmp的抗性下降了1/5，且環(huán)丙沙星和絲裂霉素的MIC也分別降低了1/2和1/5。其他兩種類型的綠膿桿菌素的雙突變體并未導致任何抗性的變化。

銅綠假單胞菌編碼兩種類型的LPS：A-band和B-band^［31］。文獻報道wbpL的突變引起細菌缺失A-band和B-band的LPS，同時暴露核心多糖上的綠膿桿菌素結合位點，導致細菌會對自身產(chǎn)生的R型綠膿桿菌素也產(chǎn)生敏感性^［32-33］。本研究前期抗性篩選過程中發(fā)現(xiàn)， ΔwbpL對Tmp的敏感性也降低， 但是并沒有到達ΔprtN的水平（見圖4）。提示R型綠膿桿菌素與Tmp抗性產(chǎn)生過程存在一定的聯(lián)系。

2.4 ROS與Tmp抗性產(chǎn)生無關

活性氧可作為信號分子參與細菌生理活性的調(diào)節(jié)，導致生長抑制，而生長抑制長期以來一直與抗生素耐受性相關^［34］。為了確定ROS是否參與了ΔprtN突變體中Tmp抗性產(chǎn)生的過程，構建了與ROS相關的3個發(fā)光報道子，對比了oxyR（氧化應激反應相關調(diào)節(jié)子）、ahpC和katA（ahpC和katA直接參與清除H₂O₂和過氧化物的相關基因）3個基因在突變體和野生型中的表達水平（見圖5）。結果顯示，在生長一致的情況下，CTX-ahpC、CTX-oxyR和CTX-katA的表達水平并沒有變化，說明ROS并未參與抗性產(chǎn)生的過程。

3 討論與結論

銅綠假單胞菌作為臨床機會致病菌，本身具有多種毒性因子，同時由于內(nèi)源耐藥性、獲得性耐藥和適應性耐藥對很多抗生素具有耐受性^［35］。因此，銅綠假單胞菌臨床感染的治療就成為了非常棘手的一個問題。毒性因子的表達在銅綠假單胞菌致病過程中具有重要作用，耐藥性則有利于病原菌的感染以及感染后的生存?，F(xiàn)有對于耐藥性和毒性因子相關研究很多，但是仍然有許多的知識空白需要進一步研究，如毒性因子的編碼或者調(diào)控基因突變?nèi)绾我鹣嚓P耐藥性的出現(xiàn)？毒性因子和耐藥性相互之間的關系等。本文發(fā)現(xiàn)綠膿桿菌素合成基因prtN的突變會造成銅綠假單胞菌對Tmp的抗性。這一結果與Coleman在2020年發(fā)現(xiàn)prtN突變體在Swarming條件下對甲氧芐氨嘧啶具有抗性一致。但是其并未對其抗性產(chǎn)生的原因進行深究^［36］。Tmp作為一種廣譜抗生素，最初用于預防和治療尿路感染。其作用的靶點是細菌二氫葉酸還原酶，干擾細菌的葉酸代謝，進而抑制細菌的生長。研究結果證明prtN突變引起Tmp抗性產(chǎn)生的過程并非由靶點的突變及補償效應（見圖2），生物被膜，外排泵以及ROS所引起的（見圖3、圖5），而prtN基因調(diào)控的綠膿桿菌素合成基因在prtN突變體產(chǎn)生抗性的過程中只起到部分作用，未知的其他基因及途徑參與了這一過程。

通過高表達靶標基因，從而抵抗抗生素的作用是一種可能的策略^［8］。Sikdar等人報道群體感應（quorum sensing，QS）中斷引起磺胺噻唑和甲氧芐啶耐藥性變化，且能夠將QS與葉酸生物合成途徑關鍵基因的表達調(diào)節(jié)聯(lián)系起來^［37］。檢測Tmp作用的靶點二氫葉酸還原酶folA的表達情況，發(fā)現(xiàn)folA在ΔprtN中的表達量在對數(shù)期階段反而遠遠低于野生型PAO1。說明銅綠假單胞菌通過低表達抗生素作用靶點降低抗生素的作用，當然也無法排除在低表達抗生素作用靶點的同時也通過替代途徑彌補folA低表達所造成的影響^［10］。通過檢測發(fā)現(xiàn)該基因未發(fā)生突變，結果證明ΔprtN的Tmp抗性并非由二氫葉酸還原酶的突變或者高表達引起。銅綠假單胞菌中有12套外排泵，能夠對不同的底物進行轉運，其中就包括對抗生素的外排過程^［24-25］。因此，通過檢測MexAB，MexCD和MexEF外排泵對應的代表性抗生素的抗性，排除了ΔprtN所引起的抗性是通過外排泵實現(xiàn)的。同樣，生物被膜被認為是內(nèi)源性耐藥的典范，主要是通過降低抗生素的進入從而賦予細菌對抗生素的耐藥。因此，檢測了生物被膜以及胞外多糖的產(chǎn)量，結果發(fā)現(xiàn)突變體和野生型并無顯著性差異（見圖3）。綜上，以上結果能夠說明prtN突變導致的Tmp的抗性并非通過原有已知的經(jīng)典耐藥機制，而是通過prtN調(diào)控的相關已知及未知的基因影響細菌的耐藥性。在大腸桿菌中，Sangurdekar等人通過轉座突變，在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了許多基因突變后導致Tmp抗性增加，其中嘧啶合成基因的突變會導致Tmp抗性的出現(xiàn)^［38］。此外，Meylan等人報道，乙醛酸鹽可以通過乙醛酸支路抑制細胞呼吸及乙酰輔酶A的轉移，從而誘導表型耐受^［39］。Lopatkin等最近研究表明，代謝活性比生長速度更加能夠解釋抗生素的致死效應^［40］。呼吸減少，細胞進入穩(wěn)定期ATP合成降低都會導致抗生素的耐受性增加^［41-42］。PrtN作為調(diào)控因子，除影響綠膿桿菌素外可能影響了其他未知代謝途徑，共同作用結果賦予了其具有Tmp抗性。

為了能夠確定prtN調(diào)控的相關基因是否參與了抗性產(chǎn)生的過程，本文構建了prtN調(diào)控的綠膿桿菌素相關基因的單突變以及雙突變體（R，S和F型綠膿桿菌素相關基因），檢測了各自的Tmp抗性。結果發(fā)現(xiàn)，綠膿桿菌素相關基因單突變體表現(xiàn)出與野生型相同的Tmp抗性，而雙突變體大多數(shù)并未表現(xiàn)出抗性的增加。LPS缺陷菌株ΔwbpL（缺失了R2型綠膿桿菌素結合位點）也表現(xiàn)出對Tmp的敏感性有所下降，進一步驗證了綠膿桿菌素參與了prtN突變引起的Tmp抗性產(chǎn)生的過程（見圖4）。因為產(chǎn)生綠膿桿菌素是有成本的，因此產(chǎn)生綠膿桿菌素的細胞對于某些抗生素更敏感^［33］。然而，本研究發(fā)現(xiàn)了S型綠膿桿菌素基因和prtN的雙突變體對Tmp的抗性有所降低（見表5），其中的原因還無法解釋。其中一種可能的解釋為某些能夠抵御S型綠膿桿菌素的基因也對抗生素具有一定的作用，S型綠膿桿菌素突變造成這些基因未能夠充分表達，從而導致雙突變體敏感性增加。

DNA損傷應答的轉錄誘導是甲氧芐啶殺菌作用的一個基本特征^［38］。研究表明，抗生素會通過誘導ROS的產(chǎn)生引起DNA錯配修復最終導致細菌死亡^［5］。同樣，胸腺嘧啶的缺乏也會導致ROS的產(chǎn)生，通過降低復制過程可以引起耐藥性的產(chǎn)生^［5］。在大腸桿菌中，亞致死水平的ROS刺激了耐藥性的出現(xiàn)^［43］。因此，本文構建了銅綠假單胞菌ROS相關基因的發(fā)光報道子CTX-ahpC、CTX-katA和CTX-oxyR，分別整合進ΔprtN和野生型PAO1的基因組中，檢測結果并未有任何差異（見圖5），暗示ROS并不參與ΔprtN抗性產(chǎn)生的過程。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)prtN（PA0610）突變后產(chǎn)生了Tmp抗性。這種抗性的出現(xiàn)是一種新的、未知的調(diào)控機制所引起的，與已報到的經(jīng)典機制和銅綠假單胞菌的固有抗性無關。耐藥性的產(chǎn)生過程可能與綠膿桿菌素的結合位點以及prtN調(diào)控的代謝過程相關。雖然本研究結果能夠排除一些抗性產(chǎn)生的原因，但是具體的作用途徑還需要進一步研究確定，詳細的研究結果將為了解銅綠假單胞菌耐藥性及其治療提供理論支持。

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（編 輯 張 歡）