咖啡酸對(duì)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)抑制探究

摘要 世界范圍內(nèi)，病原菌對(duì)抗生素的耐藥性日趨嚴(yán)峻，但藥物研發(fā)效率日趨緩慢，迫切需要新的抗感染藥物或藥物作用靶點(diǎn)。銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)（quorum sensing， QS）與其致病性密切相關(guān)，尋找靶向QS系統(tǒng)的抑制劑是新型抗感染藥物新策略。前期研究發(fā)現(xiàn)，以咖啡酸為主要成分的大血藤提取物對(duì)銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)具有轉(zhuǎn)錄抑制作用。進(jìn)一步探究了咖啡酸對(duì)銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)和毒性因子產(chǎn)生的抑制作用;通過(guò)分子對(duì)接結(jié)合缺失突變體感染白菜模型檢測(cè)，探究了咖啡酸的作用靶點(diǎn)。結(jié)果表明：咖啡酸顯著抑制銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)相關(guān)基因rhlR、rhlI、pqsA、pqsR及其調(diào)控的毒性因子的編碼基因如phzA1、lasB等，進(jìn)一步抑制該類毒性因子的產(chǎn)生和降低了細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性和生物被膜，最終降低了銅綠假單胞菌的感染性，其可能通過(guò)靶向pqs系統(tǒng)發(fā)揮其QS抑制作用。

關(guān)鍵詞 咖啡酸; 銅綠假單胞菌; 群體感應(yīng)系統(tǒng); 毒力因子靶點(diǎn); pqs

中圖分類號(hào)：R378 DOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2024-05-009

The inhibitory effect of caffeic acid on Pseudomonasaeruginosa QS system and its target

SONG Wenxu¹， FENG Yuqi¹， HAN Xiaofeng¹， WANG Shiwei¹，XU Cuixiang²， ZHANG Haixiang²， SHEN Lixin¹

（1.College of Life Sciences， Northwest University， Xi’an 710069， China;

2.Shaanxi Provincial Key Laboratory of Infection and Immune Diseases， Shaanxi ProvincialPeople’s Hospital，Xi’an 710068，China）

Abstract Antimicrobial resistance （AMR） of bacteria has increased worldwide dramatically and the development of new antibiotics has been slowed down. Therefore， it is urgent to explore new anti-infective drugs or therapeutics. Quorum sensing （QS） system of pathogen is closely related to its pathogenicity. QS system inhibitors could significantly reduce the pathogenicity of pathogen. QS system is mainly composed of las， rhl， and pqs systems and Sargentodoxae Caulis extracts mainly containing caffeic acid which has shown QSI activity. In this study， we proved the antivirulence and antipathogenicity of caffeic acid against Pseudomonas aeruginosa at the transcript and product level， then we further investigate the target of caffeic acid in QS system by using molecular docking combining the mutant strains determination. The results indicated that caffeic acid could reduce the expression of QS-related genes rhlR， rhlI， pqsA， pqsR as well as virulence related genes such as phzA1、lasB. Motility ability and biofilm were also suppressed obviously by caffeic acid. Chinese cabbage and fruit fly infection model analysis verified the antipathogenicity of caffeic acid. Caffeic acid might inhibit QS system by targeting the pqs system based on the docking analysis and gene mutant strains evaluation on caffeic acid.

Keywords caffeic acid; Pseudomonas aeruginosa; quorum sensing system; virulence factors target site; pqs

銅綠假單胞菌是一種自然環(huán)境中常見的革蘭氏陰性條件致病菌^［1］， 通常容易在免疫力低下患者、特別是囊性纖維化患者和燒傷患者中引起各種急性和慢性感染^［2-3］。 銅綠假單胞菌對(duì)多種甚至新發(fā)現(xiàn)的抗生素具內(nèi)在及獲得性耐藥， 導(dǎo)致其感染治療效率低下， 患者死亡率不斷升高，發(fā)現(xiàn)新的抗銅綠假單胞菌感染藥物或治療靶點(diǎn)迫在眉睫^［4］。

銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)在銅綠假單胞菌的致病性和耐藥性中具有重要作用^［5］。銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)包括las、rhl和pqs系統(tǒng)^［6］，其中l(wèi)as系統(tǒng)對(duì)彈性蛋白酶、蛋白水解酶具有直接調(diào)節(jié)作用^［7］，rhl系統(tǒng)對(duì)綠膿菌素具有調(diào)節(jié)作用^［8］，pqs系統(tǒng)對(duì)生物被膜的形成以及綠膿菌素、鼠李糖脂等多種毒性因子具有調(diào)節(jié)作用^［6］。生物被膜在銅綠假單胞菌的慢性感染和耐藥性中具重要地位^［9］，群集運(yùn)動(dòng)、泳動(dòng)、蹭行等運(yùn)動(dòng)及胞外蛋白酶、綠膿菌素是銅綠假單胞菌抵達(dá)感染位點(diǎn)、定植及急性感染中主要致病因子^［10-11］。通過(guò)抑制銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)，從而在不影響細(xì)菌生長(zhǎng)的情況下降低其相關(guān)毒性因子的表達(dá)及后續(xù)致病性，成為一種獨(dú)辟的不同于殺死或抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的新方法，該抑制物被稱為群體感應(yīng)抑制劑^［12］。

咖啡酸已被證明具有抗菌、抗病毒的作用^［13-14］。前期研究發(fā)現(xiàn)，中藥大血藤的水提物對(duì)銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)具有顯著抑制作用，咖啡酸是大血藤的主要成分。本研究對(duì)咖啡酸對(duì)銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)及其調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄、產(chǎn)物表達(dá)等進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抑制作用;進(jìn)一步通過(guò)白菜感染模型和果蠅感染模型驗(yàn)證了其對(duì)銅綠假單胞菌的感染性的控制作用，分子對(duì)接結(jié)果顯示咖啡酸與銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)中的PqsR蛋白具有較強(qiáng)結(jié)合作用，相關(guān)突變體侵染試驗(yàn)結(jié)果顯示咖啡酸可能作用于pqs系統(tǒng)發(fā)揮QSI作用。因此，咖啡酸是一種潛在的銅綠假單胞菌感染臨床治療前導(dǎo)藥物，在未來(lái)有可能作為一種抗生素代替藥物來(lái)對(duì)抗細(xì)菌感染。

1 菌株、儀器與試劑

1.1 菌株和質(zhì)粒

本文使用的菌株和質(zhì)粒如表1所示。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

本研究使用的儀器如下：Synergy H1多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek）、WFJ7200型分光光度計(jì)（美國(guó)Unico）、Z 326 K離心機(jī)（德國(guó)Hermle）、恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造公司）、GHP-980 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）、SW-CJ-IF 型超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰）、DK-2000-3L 型水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.3 試劑和培養(yǎng)基

1.3.1 試劑

甲氧芐啶（Tmp）、二甲亞砜（DMSO）購(gòu)于美國(guó)sigma公司;氯仿、濃鹽酸、無(wú)水乙醇購(gòu)于天津富宇精細(xì)化工有限公司;硫酸鎂、氯化鈉、氫氧化鈉、結(jié)晶紫購(gòu)于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;蛋白胨、酵母粉、脫脂奶粉、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、葡萄糖、蔗糖、瓊脂粉購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司，以上試劑和培養(yǎng)基均為分析純。本研究所用試劑濃度均為體積分?jǐn)?shù)。

1.3.2 培養(yǎng)基

1） Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g，溶于1 L ddH₂O調(diào)pH為7.2～7.4，滅菌后用于后續(xù)試驗(yàn)。

2） 運(yùn)動(dòng)培養(yǎng)基。

i） 泳動(dòng)（g／L）：10 g蛋白胨、5 g氯化鈉，調(diào)溶液pH至7.2～7.4后加入3 g瓊脂粉，121 ℃滅菌20 min。

ii） 群集運(yùn)動(dòng)（g／L）：8 g營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、5 g葡萄糖，調(diào)溶液pH至7.2～7.4后加入5 g瓊脂粉，115 ℃滅菌30 min。

iii） 蹭行（g／L）：固體LB培養(yǎng)基。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 銅綠假單胞菌培養(yǎng)

從牛奶管接PAO1及PAO1（ΔlasR）、PAO1（ΔrhlR）、PAO1（ΔpqsR）于LB固體平板劃線，其他菌株于含有Tmp抗性的平板劃線，37 ℃培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌株復(fù)蘇。挑PAO1及PAO1（ΔlasR）、PAO1（ΔrhlR）、PAO1（ΔpqsR）單克隆于LB液體培養(yǎng)基37 ℃，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，其余突變菌株單克隆于含有Tmp的液體LB中37 ℃，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，用于進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 銅綠假單胞菌MIC測(cè)定

根據(jù)CLSI中所提供的方法并稍做修改^［15］，在96孔板根據(jù)菌液的渾濁度測(cè)定PAO1的MIC。過(guò)夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌轉(zhuǎn)接1％到新鮮液體LB中37 ℃活化3 h，接種5 μL活化后的菌液加入含有新鮮LB和不同濃度咖啡酸的96孔板中，使得每孔總體積為100 μL，最后加入50 μL石蠟防止液體揮發(fā)。用酶標(biāo)儀每30分鐘測(cè)定一次OD₆₀₀，持續(xù)24 h。

2.3 咖啡酸對(duì)QS系統(tǒng)核心基因的影響

利用含有熒光素酶基因lux-CDABE的質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建目的基因啟動(dòng)子發(fā)光報(bào)道子菌株，根據(jù)發(fā)光報(bào)道菌株的化學(xué)發(fā)光情況（CPS）檢測(cè)PAO1中目的基因的表達(dá)^［16］。具體檢測(cè)步驟如下：首先，轉(zhuǎn)接50 μL過(guò)夜搖的發(fā)光報(bào)道菌株于5 mL含有37.5 μL Tmp的液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min 活化3 h；其次，在96孔板中每孔加入不同濃度的咖啡酸和新鮮LB，使其總體積為95 μL，對(duì)照組用DMSO代替，然后每孔加入5 μL活化后的菌液；最后，加入50 μL石蠟防止液體揮發(fā)，使用酶標(biāo)儀于37 ℃進(jìn)行24 h發(fā)光檢測(cè)，每30 min檢測(cè)一次CPS。

2.4 咖啡酸對(duì)銅綠假單胞菌毒性因子作用

2.4.1 生物被膜

結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物被膜產(chǎn)量^［17］。 過(guò)夜培養(yǎng)PAO1調(diào)至OD₆₀₀為0.5。取30 μL菌液分別加入到已配好3 mL LB和不同濃度藥物的培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后棄去管內(nèi)菌液，用PBS洗滌除去殘余菌液后加入結(jié)晶紫進(jìn)行染色。30 min后棄去試管內(nèi)結(jié)晶紫，并用ddH₂O清洗，觀察染色情況，最后用1 mL 95％乙醇洗下生物被膜后測(cè)定OD₅₉₅。

2.4.2 綠膿菌素

取50 μL過(guò)夜培養(yǎng)PAO1接種于含有不同濃度藥物的5 mL LB中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)16 h， 8 000 r/min離心5 min。取上清并加入等體積的氯仿，振蕩混勻后8 000 r/min離心10 min，將氯仿相取出并加入1 mL 0.2 mol／L的HCl 混勻后靜置，測(cè)定無(wú)機(jī)相OD₅₂₀^［18］。

2.4.3 胞外蛋白酶

將PAO1過(guò)夜培養(yǎng)以后取50 μL接種于含有不同濃度藥物的5 mL LB中，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)12 h， 8 000 r/min離心5 min。 取200 μL菌液上清和800 μL 2％脫脂牛奶加入1.5 mL EP管中， 37 ℃水浴鍋中孵育30 min，然后測(cè)定混合液的OD₄₄₀^［19］。

2.4.4 運(yùn)動(dòng)

蹭行：培養(yǎng)好的PAO1調(diào)至OD₆₀₀為0.5，將含有不同濃度咖啡酸的蹭行培養(yǎng)基用200 μL槍頭從中間穿透，吸取2 μL菌液注入到穿透位置，靜置后轉(zhuǎn)移到37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，除去培養(yǎng)基后用結(jié)晶紫染色觀察運(yùn)動(dòng)情況。

泳動(dòng)、群集運(yùn)動(dòng)：取2 μL OD₆₀₀為0.5的菌液點(diǎn)在含不同濃度藥物的培養(yǎng)基中央，靜置后平穩(wěn)轉(zhuǎn)移到37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12 h，觀察運(yùn)動(dòng)情況^［20］。

2.5 咖啡酸對(duì)銅綠假單胞菌感染的抑制作用

2.5.1 中國(guó)白菜感染模型

經(jīng)不同濃度咖啡酸處理的PAO1過(guò)夜培養(yǎng)后收集菌體，用10 mmol的MgSO₄重懸至OD₆₀₀為2.0，將10 μL懸液注入表面經(jīng)0.1％ H₂O₂消毒的菜莖中。將菜莖置于含有浸漬了10 mmol MgSO₄的濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，30 ℃下孵育6 d，并記錄白菜腐爛面積^［21］。

2.5.2 果蠅感染模型

將銅綠假單胞菌與不同濃度的咖啡酸在LB肉湯中過(guò)夜培養(yǎng)后于8 000 r/min離心5 min，然后用5％的蔗糖將菌體重懸至OD₆₀₀為2.0。將無(wú)菌濾紙片覆蓋于培養(yǎng)瓶中的滅菌蔗糖瓊脂表面，并將500 μL 重懸后的菌液均勻注射于濾紙片并吹干，取20只同期化后的雄性果蠅饑餓處理3 h并放于培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶于25 ℃培養(yǎng)10 d，每24 h統(tǒng)計(jì)一次存活果蠅數(shù)^［22］。

2.6 咖啡酸作用靶點(diǎn)探究

2.6.1 分子對(duì)接

從PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)獲得銅綠假單胞菌LasR、LasI、PqsR、PqsA蛋白的3D結(jié)構(gòu)（PDB格式），用pymol對(duì)蛋白進(jìn)行預(yù)處理后得到3D結(jié)構(gòu)、pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得咖啡酸的3D結(jié)構(gòu)，利用moe進(jìn)行蛋白和小分子的對(duì)接及結(jié)果分析。

2.6.2 突變體驗(yàn)證

挑突變菌株單克隆PAO1（ΔlasR）、PAO1（ΔrhlR）、PAO1（ΔpqsR）于含有不同濃度咖啡酸或DMSO的5 mL液體LB培養(yǎng)基中，于37 ℃ 200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，8 000 r/min離心 5 min，收集菌體。菌體用10 mmol的MgSO₄重懸至OD₆₀₀為2.0后，取10 μL注入到經(jīng)0.1％ H₂O₂消毒的菜莖。菜莖置于含有10 mmol的MgSO₄浸潤(rùn)的無(wú)菌濾紙的玻璃平皿中，30 ℃培育，觀察菜莖的腐爛面積。

3 研究結(jié)果

3.1 咖啡酸對(duì)QS系統(tǒng)及相關(guān)基因表達(dá)的影響

群體感應(yīng)抑制劑不影響細(xì)菌生長(zhǎng)，但對(duì)群體感應(yīng)基因及其調(diào)控基因等具有抑制作用^［23］。本研究利用酶標(biāo)儀連續(xù)24 h檢測(cè)37 ℃條件下菌液的OD₆₀₀確定了咖啡酸對(duì)PAO1的最小抑菌濃度為2 000 μg／mL。

以咖啡酸溶解溶劑DMSO為對(duì)照，在不影響生長(zhǎng)的500、1 000 μg／mL的咖啡酸作用下，檢測(cè)QS系統(tǒng)相關(guān)基因rhlR、rhlI、pqsR、pqsA及毒性因子相關(guān)基因lasB、phzA1的表達(dá)。結(jié)果如圖1所示，咖啡酸明顯降低了rhlR、pqsR、rhlI、pqsA基因表達(dá)，其中在第8～12 h內(nèi)存在對(duì)于 rhlR、rhlI、pqsA顯著的抑制效果，然后抑制作用逐漸減弱，而咖啡酸在24 h內(nèi)表現(xiàn)出pqsA的抑制作用。此外，咖啡酸對(duì)QS相關(guān)毒性因子lasB、phzA1的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平也有抑制作用。這表明咖啡酸對(duì)銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)調(diào)控基因具有轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用。

3.2 咖啡酸對(duì)群體感應(yīng)控制毒力因子的影響

進(jìn)一步檢測(cè)咖啡酸對(duì)群體感應(yīng)相關(guān)毒性因子產(chǎn)物水平表達(dá)的影響。

綠膿菌素和蛋白水解酶是銅綠假單胞菌破壞宿主細(xì)胞表面的基質(zhì)成分，引起細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡， 導(dǎo)致各種感染的主要原因。檢測(cè)了500、1 000 μg／mL的咖啡酸對(duì)這兩種毒性因子的作用（見圖2）。 結(jié)果顯示， 與對(duì)照組相比添加咖啡酸后銅綠假單胞菌蛋白水解酶和綠膿菌素的產(chǎn)量明顯降低。

3.3 咖啡酸對(duì)運(yùn)動(dòng)的影響

細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)同樣在其感染過(guò)程中具有重要作用，運(yùn)動(dòng)主要參與細(xì)菌在宿主細(xì)胞表面的黏附和抵抗宿主的免疫反應(yīng)等過(guò)程。本文檢測(cè)了咖啡酸對(duì)銅綠假單胞菌運(yùn)動(dòng)能力的影響。由圖3可知，與對(duì)照組相比咖啡酸抑制了銅綠假單胞菌的運(yùn)動(dòng)能力，其中1 000 μg／mL的咖啡酸對(duì)群集運(yùn)動(dòng)和泳動(dòng)具有極顯著的抑制作用，同時(shí)結(jié)晶紫染色結(jié)果表明蹭行運(yùn)動(dòng)也受到一定程度的抑制。

3.4 咖啡酸對(duì)生物被膜抑制作用

生物被膜通過(guò)形成胞外聚合物來(lái)對(duì)多種抗生素產(chǎn)生抵抗作用，它與細(xì)菌的慢性感染和抗生素耐藥性密不可分。本研究結(jié)果如圖4所示，咖啡酸明顯降低了生物被膜的生成量，當(dāng)咖啡酸濃度達(dá)到1 000 μg／mL時(shí)，其對(duì)生物被膜的抑制率可以達(dá)到50％左右，證明咖啡酸可以抑制生物被膜的形成。

3.5 咖啡酸對(duì)銅綠假單胞菌感染的減輕作用

通過(guò)中國(guó)白菜感染模型和果蠅感染模型對(duì)咖啡酸抗致病性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示，（+）為PAO1感染，（-）為PAO1未感染。與僅PAO1感染的對(duì)照組相比，不同濃度的咖啡酸處理濃度依賴性地顯著減少了中國(guó)白菜的腐爛面積〔見圖5（a）〕，顯著提高了果蠅侵染模型中的果蠅10 d 后的生存率;同時(shí)果蠅感染模型中，僅使用咖啡酸處理后的果蠅存活率與未經(jīng)任何處理的空白對(duì)照組的果蠅生存率接近，無(wú)顯著性差異，表明咖啡酸對(duì)動(dòng)物無(wú)顯著毒性。

3.6 咖啡酸作用靶點(diǎn)推測(cè)

3.6.1 分子對(duì)接預(yù)測(cè)咖啡酸作用于PqsR蛋白

本研究利用分子對(duì)接預(yù)測(cè)了咖啡酸與QS系統(tǒng)LasR、LasI、PqsA、PqsR蛋白的作用靶點(diǎn)，結(jié)果如圖6所示。由于PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中缺少RhlI和RhlR蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，因此，未進(jìn)行咖啡酸和以上兩個(gè)蛋白的對(duì)接。由表2可知，PqsR蛋白與咖啡酸的結(jié)合能為-5.306 4 kcal／mol，已知結(jié)合能越低兩個(gè)分子的結(jié)合強(qiáng)度越高，因此咖啡酸可能作用于pqs系統(tǒng)。

3.6.2 中國(guó)白菜感染模型驗(yàn)證咖啡酸作用于pqs系統(tǒng)發(fā)揮QSI效果

利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的3個(gè)缺失突變株P(guān)AO1（ΔlasR）、PAO1（ΔrhlR）、PAO1（ΔpqsR）和不同濃度的咖啡酸混合后進(jìn)行白菜侵染試驗(yàn)，根據(jù)白菜的腐爛程度推測(cè)咖啡酸作用靶點(diǎn)。結(jié)果如圖7所示，咖啡酸與PAO1（ΔlasR）、PAO1（ΔrhlR）混合并注射到白菜后的腐爛面積明顯減少，PAO1（ΔpqsR）對(duì)白菜腐爛的影響程度不明顯，說(shuō)明pqs系統(tǒng)受損后咖啡酸失去作用位點(diǎn)，導(dǎo)致其難以發(fā)揮抗致病性作用。根據(jù)以上結(jié)果結(jié)合分子對(duì)接結(jié)果推測(cè)，咖啡酸可能通過(guò)靶向PqsR蛋白以發(fā)揮QSI作用。

4 結(jié)語(yǔ)

銅綠假單胞菌作為一種廣泛存在于自然界革蘭氏陰性條件致病菌，由于其對(duì)抗生素耐藥性的不斷加重，成為影響人類健康的重大威脅之一^［24］。銅綠假單胞菌的致病性和耐藥性主要是由于毒力因子的分泌和生物被膜的形成，而這些毒力又受到其體內(nèi)的QS系統(tǒng)調(diào)節(jié)^［25］。因此，以QS系統(tǒng)為靶標(biāo)開發(fā)群體感應(yīng)抑制劑（QSI），可以作為抵抗銅綠假單胞菌感染的重要策略^［26］。研究發(fā)現(xiàn)，包括許多天然物質(zhì)以及人工合成化合物在內(nèi)的許多物質(zhì)具有QSI活性，如以QS信號(hào)分子為母核結(jié)構(gòu)合成的結(jié)構(gòu)類似物mBTL^［27］，天然植物中廣泛存在的酚類物質(zhì)綠原酸^［28］、黃酮類物質(zhì)槲皮素^［29］等。而中草藥提取物由于成分復(fù)雜并且往往具有抗菌、抗病毒的功效，因此可以作為QSI發(fā)掘的天然資源庫(kù)^［30］。大血藤是我國(guó)特有的傳統(tǒng)中藥材，常被用于治療闌尾炎、跌打腫痛等^［31］，咖啡酸是大血藤的主要成分之一，其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗細(xì)胞損傷等功效^［32-33］。

研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸能在轉(zhuǎn)錄水平和產(chǎn)物水平抑制銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)。同時(shí)，白菜感染模型和果蠅感染模型發(fā)現(xiàn)咖啡酸顯著降低了銅綠假單胞菌的致病性。此外，進(jìn)一步研究了咖啡酸在QS系統(tǒng)的作用靶點(diǎn)。首先，利用分子對(duì)接預(yù)測(cè)了咖啡酸與蛋白質(zhì)PqsR的最強(qiáng)結(jié)合；其次，采用白菜感染模型對(duì)QS系統(tǒng)的相關(guān)突變體PAO1（ΔlasR）、PAO1（ΔrhlR）、PAO1（ΔpqsR）的致病性進(jìn)行了檢測(cè)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PqsR的缺失導(dǎo)致了咖啡酸對(duì)QS系統(tǒng)抑制效應(yīng)的消失，驗(yàn)證了咖啡酸可能主要通過(guò)作用pqs系統(tǒng)，尤其是與PqsR作用，從而發(fā)揮QS系統(tǒng)抑制效應(yīng)的作用，擾亂QS系統(tǒng)對(duì)下游基因的調(diào)控作用，以發(fā)揮QSI活性。QSIs的群體感應(yīng)抑制機(jī)制主要包括競(jìng)爭(zhēng)性地阻斷信號(hào)分子與其相應(yīng)受體蛋白的結(jié)合，抑制QS信號(hào)分子的生物合成，降解細(xì)胞內(nèi)的3種信號(hào)分子。研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸很有可能與信號(hào)分子PQS競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體蛋白PqsR，抑制QS系統(tǒng)從而降低銅綠假單胞菌的致病性。

綜上，本研究證明了咖啡酸可能通過(guò)干擾pqs系統(tǒng)進(jìn)一步抑制銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)，降低毒力因子的產(chǎn)生最終導(dǎo)致銅綠假單胞菌的致病性降低，在治療銅綠假單胞菌感染的同時(shí)避免其抗生素耐藥性的產(chǎn)生，咖啡酸對(duì)果蠅的低毒作用也說(shuō)明其具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

［1］ SCHABER J A， TRIFFO W J， SUH S J， et al. Pseudomonas aeruginosa forms biofilms in acute infection independent of cell-to-cell signaling ［J］. Infect Immun， 2007， 75（8）： 3715-3721.

［2］ MITTAL R， AGGARWAL S， SHARMA S， et al. Urinary tract infections caused by Pseudomonas aeruginosa： A minireview ［J］. J Infect Public Health， 2009， 2（3）： 101-111.

［3］ ANTIMICROBIAL RESISTANCE COLLABORATORS. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019： A systematic analysis ［J］.Lancet， 2022， 399（10325）：629-655.

［4］ 丁燁， 戴璐， 俞娟. 抗銅綠假單胞菌感染治療方法研究進(jìn)展 ［J］. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2020， 30（6）： 955-960.

DING Y， DAI L， YU J. Progress of reaserch on treatment of Pseudomonas aeruginosa infection ［J］ Chinese Journal of Nosocomiology， 2020， 30（6）： 955-960.

［5］ SOUKARICH F， WILLIAMS P， STOCKS M J， et al. Pseudomonas aeruginosa quorum sensing systems as drug discovery targets： Current position and future perspectives ［J］.J Med Chem， 2018， 61（23）： 10385-10402.

［6］ LEE J， ZHANG L. The hierarchy quorum sensing network in Pseudomonas aeruginosa［J］. Protein amp; Cell， 2015， 6（1）： 26-41.

［7］ 饒媚， 張素平， 史道華. 銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)抗菌增效機(jī)制研究進(jìn)展 ［J］. 中國(guó)感染與化療雜志， 2019， 19（5）： 578-583.

RAO M， ZHANG S P， SHI D H. Study advances of synergistic mecanisms targeting quorum sensing system in Pseudomonas aeruginosa［J］ Chinese Journal of Infection and Chemotherapy， 2019， 19（5）： 578-583.

［8］ PATTNAIK S， AHMED T， RANGANATHAN S K， et al. Aspergillus ochraceopetaliformis SSP13 modulates quorum sensing regulated virulence and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa PAO1 ［J］.Biofouling， 2018， 34（4）： 410-425.

［9］ WARRIER A， SATYAMOORTHY K， MURALI T S. Quorum-sensing regulation of virulence factors in bacterial biofilm ［J］. Future Microbiol， 2021， 16： 1003-1021.

［10］何媛， 宋貴波. 銅綠假單胞菌毒力因子及調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)展 ［J］. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展， 2023， 51（2）： 94-99.

HE Y， SONG G B. Research progress on virulence factors and regulatory mechanisms of Pseudomonas aeruginosa［J］.Progress in Microbiology and Immunology， 2023， 51（2）： 94-99.

［11］JURADO-MARTíN I，SAíNZ-MEJíAS M，MCCLEAN S.Pseudomonas aeruginosa： An audacious pathogen with an adaptable arsenal of virulence factors［J］.Int J Mol Sci， 2021， 22（6）：3128.

［12］曾莉莉， 史道華， 牛培廣. 銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)及其抑制劑的研究進(jìn)展 ［J］. 中國(guó)抗生素雜志， 2014， 39（9）： 701-705.

ZENG L L， SHI D H， NIU P G. Research progress in quorum sensing system and its inhibitors of Pseudomonas aeruginosa［J］. Chinese Journal of Antibiotics， 2014， 39（9）： 701-705.

［13］KHAN F， BAMUNUARACHCHI N I， TABASSUM N， et al. Caffeic acid and its derivatives： Antimicrobial drugs toward microbial pathogens［J］.J Agric Food Chem， 2021， 69（10）： 2979-3004.

［14］WANG G F， SHI L P， REN Y D， et al. Anti-hepatitis B virus activity of chlorogenic acid， quinic acid and caffeic acid in vivo and in vitro ［J］. Antiviral Res， 2009， 83（2）： 186-190.

［15］任曉娜， 劉宇良， 于航， 等. 纈草、龍腦精油的抑菌活性 ［J］. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 38（10）： 74-78.

REN X N， LIU Y L， YU H， et al. Antibacterial activity of valerian and borneol essenti ［J］.Chinese Journal of Tropical Agriculture， 2018， 38（10）： 74-78.

［16］BECHER A， SCHWEIZER H P. Integration-proficient Pseudomonas aeruginosa vectors for isolation of single-copy chromosomal lacZ and lux gene fusions［J］.Biotechniques， 2000， 29（5）： 948-950.

［17］PEETERS E， NELIS H J， COENYE T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates ［J］. J Microbiol Methods， 2008， 72（2）： 157-165.

［18］ESSAR D W， EBERLY L， HADERO A， et al. Identification and characterization of genes for a second anthranilate synthase in Pseudomonas aeruginosa： Interchangeability of the two anthranilate synthases and evolutionary implications［J］.J Bacteriol， 1990， 172（2）： 884-900.

［19］DAI L， WU T Q， XIONG Y S， et al. Ibuprofen-mediated potential inhibition of biofilm development and quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa［J］.Life Sci， 2019， 237： 116947.

［20］RASHID M H， KORNBERG A. Inorganic polyphosphate is needed for swimming， swarming， and twitching motilities of Pseudomonas aeruginosa［J］.Proc Natl Acad Sci U S A， 2000， 97（9）： 4885-4890.

［21］STARKEY M， RAHME L G. Modeling Pseudomonas aeruginosa pathogenesis in plant hosts ［J］. Nat Protoc， 2009， 4（2）： 117-124.

［22］CHUGANI S A， WHITETEY M， LEE K M， et al. QscR， a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2001， 98（5）： 2752-2757.

［23］CHADHA J， HARJAI K， CHHIBBER S. Repurposing phytochemicals as anti-virulent agents to attenuate quorum sensing-regulated virulence factors and biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa［J］. Microb Biotechnol， 2022， 15（6）： 1695-1718.

［24］DOLAN S K. Current knowledge and future directions in developing strategies to combat Pseudomonas aeruginosa infection［J］.J Mol Biol， 2020， 432（20）： 5509-5528.

［25］AZAM M W， KHAN A U. Updates on the pathogenicity status of Pseudomonas aeruginosa ［J］. Drug Discov Today， 2019， 24（1）： 350-359.

［26］周志蓮， 周彤， 周秀娟， 等. 銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)及其抑制劑的研究進(jìn)展 ［J］. 中國(guó)抗生素雜志， 2023， 48（8）： 862-868.

ZHOU Z L， ZHOU T， ZHOU X J， et al. Study on quorum sensing system and its inhibitors of Pseudomonas aeruginosa［J］.Chinese Journal of Antibiotics， 2023， 48（8）： 862-868.

［27］O’LOUGHLIN C T， MILLER L C， SIRYAPORN A， et al. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation ［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2013， 110（44）： 17981-17986.

［28］XU W， ZHANG X， WANG L， et al. Effect of chlorogenic acid on the quorum-sensing system of clinically isolated multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa［J］. J Appl Microbiol， 2022， 132（2）： 1008-1017.

［29］OUYANG J， FENG W， LAI X， et al. Quercetin inhibits Pseudomonas aeruginosa biofilm formation via the vfr-mediated lasIR system ［J］. Microb Pathog， 2020， 149： 104291.

［30］陳沐雨， 潘云萍， 祝司霞. 中草藥對(duì)銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的研究進(jìn)展 ［J］. 國(guó)外醫(yī)藥（抗生素分冊(cè)）， 2023， 44（4）： 217-223.

CHEN M Y， PAN Y P， ZHU S X. Research progress on inhibition of chinese herbal medicine on quorum sensing system of Pseudomonas aeruginosa［J］.World Notes on Antibiotics， 2023， 44（4）： 217-223.

［31］湯建， 曹裕旻， 左亞鋒， 等. 紅藤水溶性部位的LC-MS分析及抗炎活性成分的虛擬篩選 ［J］. 中國(guó)野生植物資源， 2023， 42（12）： 25-29.

TANG J， CAO Y M， ZUO Y F， et al. LC-MS analysis of water-soluble fraction of sargentodoxa cuneata and virtual screening of anti-inflammatory constituents ［J］. Chinese Wild Plant Resources， 2023， 42（12）： 25-29.

［32］張彥芳， 張娜， 韓正宇， 等. 硫普羅寧聯(lián)合咖啡酸治療慢性乙型病毒性肝炎所致白細(xì)胞減少的療效觀察 ［J］. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2014， 23（18）： 1971-1972.

ZHANG Y F， ZHANG N， HAN Z Y， et al. Efficacy observation of sulpiprostone combined with caffeic acid in the treatment of leukopenia caused by chronic hepatitis B ［J］ Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， 2014， 23（18）： 1971-1972.

［33］KALTHOFF S， PAULUSCH S， RUPP A， et al. The coffee ingredients caffeic acid and caffeic acid phenylethyl ester protect against irinotecan-induced leukopenia and oxidative stress response ［J］. Br J Pharmacol， 2020， 177（18）： 4193-4208.

（編 輯 張 歡）