MSPD-HPLC法分析云南紅豆杉中的10-DAB Ⅲ和紫杉醇

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202304019

趙倩倩， 朱靖博， 2024.

MSPD-HPLC法分析云南紅豆杉中的10-DAB Ⅲ和紫杉醇 ［Ｊ］.

廣西植物， 44（6）： １０４２－１０５１.

ZHAO QQ， ZHU JB， 2024.

Determination of 10-DAB Ⅲ and Taxol in Taxus yunnanensis by MSPD-HPLC ［J］.

Guihaia， 44（6）： １０４２－１０５１.

摘" 要：" 為建立云南紅豆杉（Taxus yunnanensis）中10-去乙?；涂ㄍあ螅?0-DAB Ⅲ）和紫杉醇（Taxol）的分析方法，該研究采用基質固相萃取-高效液相色譜分析（MSPD-HPLC）對云南紅豆杉中的10-DAB Ⅲ及Taxol進行定量分析，探究硅膠、佛羅里硅土、酸性氧化鋁、中性氧化鋁、堿性氧化鋁、C18、C18-ME、C18-G1、C18-HC、Diol、Xamide、Xion 共12種樣品預處理分散劑及各種分散劑的質量、洗脫劑的種類、洗脫劑的濃度、洗脫劑體積對兩種成分分析的影響，并對優(yōu)化后的條件進行方法學驗證，同時與超聲提取、熱回流提取預處理方法進行比較分析證明其有效性。結果表明：（1）12種固相分散劑中，堿性氧化鋁具有良好的目標化合物萃取物檢出量，并且當堿性氧化鋁與樣品的質量比為3∶1、6 mL甲醇為洗脫劑洗脫時，10-DAB Ⅲ和Taxol的萃取檢出量較高。（2）建立的云南紅豆杉枝葉中10-DAB Ⅲ和Taxol的分析方法具有良好的線性關系（r≥0.999 9），10-DAB Ⅲ和Taxol的檢出限和定量限分別介于0.023 9～0.030 1 μg·mL-1和0.142～0.178 μg·mL-1之間；各目標分析物平均加樣回收率在93.6%～109.0%之間。（3）比較分析顯示，3種方法對2種紫杉烷類化合物的萃取檢出量基本無差別，但MSPD法溶劑消耗少、操作簡單，分析時間短，凈化效率高，可應用于云南紅豆杉原料的快速分析。該研究以堿性氧化鋁為分散劑應用于云南紅豆杉紫杉烷類化合物的萃取，建立了快速、高效的云南紅豆杉中10-DAB Ⅲ和紫杉醇的分析方法，為云南紅豆杉中的紫杉烷類化合物的定量分析提供了依據。

關鍵詞： 云南紅豆杉， 10-去乙?；涂ㄍ?Ⅲ， 紫杉醇， 基質固相萃取， 高效液相色譜分析

中圖分類號：" Q943

文獻標識碼：" A

文章編號：" 1000-3142（2024）04-1042-10

收稿日期：" 2023-05-30" 接受日期： 2023-09-13

基金項目：" 國家自然科學基金-聯(lián)合基金項目（U1603285）。

第一作者： 趙倩倩（1996—），碩士研究生，主要從事天然產物化學研究，（E-mail）2413737899@qq.com。

*通信作者：" 朱靖博，博士，二級教授，主要從事天然產物化學與利用研究，（E-mail）2817638020@qq.com。

Determination of 10-DAB Ⅲ and Taxol in

Taxus yunnanensis by MSPD-HPLC

ZHAO Qianqian， ZHU Jingbo*

（ School of Food Science and Technology， Dalian Polytechnic University， Dalian 116023， Liaoning， China ）

Abstract：" This research aimed to establish an analytical method for the quantification of 10-deacetylbaccatin Ⅲ （10-DAB Ⅲ） and Taxol in Taxus yunnanensis. The method of matrix solid phase dispersion coupled with high performance liquid chromatography （MSPD-HPLC） was used for the respective quantification of 10-DAB Ⅲ and Taxol of T. yunnanensis. The influences of various parameters were investigated， including 12 types of solid-phase dispersants （silica gel， florisil， acid alumina， neutral alumina， alkaline alumina， C18， C18-ME， C18-G1， C18-HC， Diol， Xamide， Xion）， the mass of the dispersants， and the type， concentration， and volume of the eluent on the analysis of the two components. After optimization of these conditions， the methodology was validated. Additionally， a comparative analysis was conducted with the conventional ultrasonic extraction and hot reflux extraction pretreatment methods to ascertain their effectiveness of our novel method. The results were as follows： （1） Among the 12 solid-phase dispersants examined， alkaline alumina yielded a superior extraction detection rate for 10-DAB Ⅲ and Taxol when used in a 3∶1 ratio with the sample mass and 6 mL of methanol as the eluent. （2） The developed 10-DAB Ⅲ" and Taxol analysis method in T. yunnanensis demonstrated that excellent linearity （r≥0.999 9） with limit of detection （LOD）" and limit of quantification （LOQ） for 10-DAB Ⅲ and Taxol ranging from 0.023 9 to 0.030 1 μg·mL-1 and from 0.142 to 0.178 μg·mL-1， respectively. The average recoveries of the target analytes varied between 93.6% and 109.0%. （3） A comparative analysis revealed that negligible differences in extraction detection of the two taxanes between the three methods. However， the MSPD method stood out due to its lower solvent consumption， simple operation， short analysis time and high purification efficiency， making it more suitable for the rapid analysis of T. yunnanensis raw materials. Therefore， this study presents a rapid and efficient analytical method for the extraction and analysis of 10-DAB Ⅲ and Taxol in T. yunnanensis， using alkaline alumina as a dispersant， providing a significant contribution to the quantitative analysis of taxanes in this species.

Key words：" Taxus yunnanensis， 10-DAB Ⅲ， Taxol， MSPD， HPLC

云南紅豆杉（Taxus yunnanensis）為紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）植物，全世界約有11種（柏培磊，2012）。紅豆杉的主要活性成分是紫杉烷類化合物，其中以Taxol和10-DAB Ⅲ等最為人們所熟知（王炯等，2017）。紫杉醇對子宮癌、卵巢癌等（Yang amp; Horwitz， 2017）多種癌癥具有良好的療效，10-DAB Ⅲ不僅具有抑制腫瘤的作用，同時也是半合成紫杉醇和多烯紫杉醇等抗癌藥物的重要前體物（馬淑楨和吳綿斌，2006）。因此，快速準確分析紅豆杉中這兩種成分具有重要的現(xiàn)實意義。

紅豆杉中的紫杉烷類化合物分析主要采用HPLC、UPLC、HPLC-MS、UPLC-MS法等。不同品種紅豆杉原料中的10-DAB Ⅲ、三尖杉寧堿、紫杉醇等多種紫杉烷類化合物的含量通常采用C18或Pentafluorophenyl柱的HPLC法分析（Zu et al.， 2006； Fu et al.， 2009；馬生軍等，2017；馮永林等，2017；崔海超等，2022）。張靜采用UPLC分析了紅豆杉中的10-DAB Ⅲ等3個有效成分（張靜等，2011）；趙春芳、Luo建立了LC-MS-MS方法分析紅豆杉中的紫杉烷類化合物（趙春芳和余龍江，2006；Luo et al.， 2009）。以上分析方法在分析樣本前處理方面采取了傳統(tǒng)的回流提取法或超聲輔助提取法及在樣品凈化處理時采用液液萃取、SPE凈化，存在樣品需要量大、有毒有機溶劑消耗量多、前處理時間長等缺點（江璐依，2020）。

基質固相萃?。╩atrix solid phase dispersion，MSPD）法是由Staren Barker教授提出的樣品分析預處理方法（Barker et al.， 1989），適用于固態(tài)、半固態(tài)或具有一定黏度樣品（Barker， 2000），對目標化合物具有凈化、富集作用，其具有消耗時間少、操作簡單等優(yōu)點。MSPD方法的原理是利用分析物的分子結構特征及分散劑的不同性質，通過研缽將樣品及分散劑磨碎并混勻，再用洗脫劑洗脫后進行定量分析。目前，MSPD已經廣泛應用到食品藥物殘留測定、天然產物和藥物的提取和分析中。劉雷等（2020）采用MSPD-UPLC法同時測定狼毒大戟中4種成分；Wei等（2011）以堿性氧化鋁為分散劑，用乙腈-水混合溶液洗脫，采用MSPD-HPLC法對草烏中的4種生物堿進行分析、凈化；Lu等（2011）采用在線MSPD-HPLC/MS法，用于分析草魚中的藥物殘留；Li等（2014）基于磁性Fe3O4納米粒子結合氣質聯(lián)用技術，構建了果蔬中101種農藥的殘留檢測方法，同時研究比較了不同基質固相萃取條件對樣品的凈化效果。

本研究以云南紅豆杉枝葉為對象，基于MSPD-HPLC快速分析云南紅豆杉中的10-DAB Ⅲ和Taxol含量，通過考察和優(yōu)化影響10-DAB Ⅲ及Taxol萃取檢出量的各因素，并與超聲提取法和熱回流提取預處理法進行比較分析，擬探討以下問題：（1）MSPD-HPLC分析紅豆杉中的10-DAB Ⅲ及Taxol的分散劑選擇與優(yōu)化；（2）選定的分散劑分析10-DAB Ⅲ及Taxol時的萃取條件優(yōu)化；（3）新構建分析方法的方法學驗證及其適用性；（4）MSPD法與超聲提取法、熱回流提法等前處理方法進行比較分析確定方法的有效性。

1" 材料與方法

1.1 儀器和試劑

AC Chrom S6000型高效液相色譜分析儀（北京華譜新創(chuàng)科技有限公司），12 mL固相萃取柱（湖北蘇林科技有限公司），600Y型多功能粉碎機（廣州旭朗機械設備有限公司），Bmnson 3800型超聲波清洗器（鞏義市英裕華科儀器廠）。

10-DAB Ⅲ（99%）、Taxol（99%）購自西安天豐生物科技有限公司。硅膠、佛羅里硅土來自北京華譜新創(chuàng)科技有限公司，均為200～300目；C18、C18-ME、C18-G1、C18-HC、Diol、Xamide、Xion來自北京華譜新創(chuàng)科技有限公司，粒徑均為10 μm；Alkaline alumina、 Acidic alumina、Neutral alumina來自上海陸都化學試劑廠，均為200～300目；色譜級甲醇、乙腈購自天津市科密歐化學試劑有限公司；分析級甲醇、乙腈、乙醇、丙酮購自天津康科德科技有限公司。紅豆杉枝葉采自云南保山地區(qū)的云南紅豆杉（Taxus yunnanensis）馴化栽培種。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備" 將云南紅豆杉枝葉用粉碎機粉碎，過40目篩。在50 ℃烘箱內干燥至恒重并保存在玻璃干燥器中，備用。

1.2.2 標準品溶液制備

稱取對照品適量于甲醇中溶解，配制成濃度均0.1 mg·mL-1的10-DAB Ⅲ、Taxol混合標準品溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，用于HPLC分析。

1.2.3 MSPD-HPLC法" 稱取0.25 g云南紅豆杉粉末與正相色譜填料（硅膠、佛羅里硅土、堿性氧化鋁、酸性氧化鋁、中性氧化鋁）、反相色譜填料（C18-HC、C18-G1、C18、C18-ME）、HILIC填料（Xion、Xamide、Diol）按一定比例混合，并充分研磨。將研磨后的混合樣品轉移至萃取柱中，萃取柱上、下兩端放置篩板，充分壓實；加入甲醇，常壓洗脫，將洗脫后得到的溶液收集至25 mL容量瓶，甲醇定容，0.22 μm濾膜過濾，用于定量分析，所有實驗重復3次。

1.2.4 不同預處理方法比較" （1）超聲提取法：稱取云南紅豆杉樣品0.25 g，于20 mL甲醇中超聲提取1 h，甲醇定容至25 mL，混勻后，經濾膜過濾，進行定量分析。（2）熱回流提取法：稱取云南紅豆杉樣品0.25 g，置于100 mL錐形瓶中，加入25 mL甲醇熱回流提取1 h，提取3次。過濾、濃縮后轉移至25 mL容量瓶內，經濾膜過濾，用于定量分析。（3）MSPD-HPLC法：方法同“1.2.3”項。確定最佳萃取條件后，比較基于MSPD法萃取的云南紅豆杉中10-DAB Ⅲ及Taxol萃取檢出量及凈化效果。

1.2.5 色譜條件" C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。流動相：乙腈（A）-水（B）。梯度洗脫：0～20 min，15%～50% A；21～60 min，51%～100%。體積流量為0.8 mL·min-1；檢測波長為227 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。

2" 結果與分析

2.1 萃取條件優(yōu)化

2.1.1 分散劑的選擇" 基質固相分散劑是MSPD吸附法進行樣品預處理過程中影響目標化合物分析準確性的主要因素，分析了正相色譜填料（硅膠、佛羅里硅土、堿性氧化鋁、酸性氧化鋁、中性氧化鋁）、反相色譜填料（C18-HC、C18-G1、C18、C18-ME）、HILIC填料（Xion、Xamide、Diol）12種分散劑對云南紅豆杉紫杉烷類化合物分析的影響。由圖1可知，12種分散劑對目標分析物具有相似的萃取檢出量，HILIC填料（Xion、Xamide、Diol）對紫杉烷類化合物的萃取檢出量略低于正相色譜填料和反相色譜填料，HILIC填料與極性化合物是通過氫鍵作用或者偶極-偶極作用相互吸附（李欣等，2020），對極性相對較弱的10-DAB Ⅲ和Taxol吸附較差有關。12種分散劑對目標化的吸附性能差異不大，但是正相色譜填料對于目標化合物的吸附性較高，其中堿性氧化鋁的萃取檢出量高于其他分散劑，可能是因為堿性氧化鋁可反應性地吸附其中的極性化合物，而弱極性化合物紫杉烷類化合物并未有損失（陳馳，2020），適合于極性相對較弱的紫杉烷類化合物的凈化、富集。因此，本研究選擇堿性氧化鋁為分散劑。

2.1.2 樣品與堿性氧化鋁分散劑質量比的影響

分析了樣品與堿性氧化鋁的不同質量比（2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）對10-DAB Ⅲ和Taxol萃取檢出量的影響。由圖2可知，質量比從2∶1上升到1∶5時，10-DAB Ⅲ和Taxol萃取檢出量明顯提高，質量比為1∶3時萃取檢出量存在一個最佳值，顯然分散劑增大會使樣品組分和分散劑之間的界面面積增加，提高目標分析物的分析收萃取檢出量（郭蕓等，2020）。但是，分散劑質量的進一步增加會使目標分析物不易從萃取柱中被完全洗脫，從而使萃取檢出量降低。由于填充物較多會導致其分散不均勻，因此本研究選擇云南紅豆杉與堿性氧化鋁的質量比為1∶3。

2.1.3 洗脫劑種類的影響" 在堿性氧化鋁作為分散劑的吸附與解析過程中，極性強的洗脫劑有利于將分析物從分散劑上洗脫下來。分別分析了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮4種溶劑對10-DAB Ⅲ和Taxol的洗脫能力。由圖3可知，4種洗脫劑對目標化合物均具有一定的洗脫作用，當甲醇作為洗脫劑時，2種目標分析物的萃取檢出量明顯高于其他3種洗脫劑，2種目標分析物的萃取檢出量較高，這說明甲醇更適合從堿性氧化鋁中解析10-DAB Ⅲ和Taxol。因此，本研究選擇甲醇作為洗脫劑。

2.1.4 洗脫劑濃度的影響" 洗脫劑濃度對目標化合物的萃取檢出量有一定影響，分析了不同濃度的甲醇（20%、40%、60%、80%、100%）對2種目標化合物萃取檢出量的影響，結果如圖4所示。隨著甲醇濃度的增大，2種目標化合物的萃取檢出量也逐漸增大。當濃度達到40%時，隨著甲醇濃度的增大，萃取檢出量變化不大，但隨著甲醇濃度的降低，洗脫時間也相應增加，可能是因為洗脫劑中水的存在會導致溶劑的黏度變大（陳馳，2020）。在洗脫效果相同情況下，以100%甲醇為洗脫劑可縮短洗脫時間，因此選擇100%甲醇作為洗脫劑濃度。

2.1.5 洗脫溶劑體積的影響" 洗脫溶劑體積是MSPD吸附分離中的關鍵參數(shù)，在提取完全的基礎上，應盡量減少洗脫劑的用量。分析了甲醇的洗

脫體積（2、4、6、8、10、12 mL）對萃取檢出量的影響。由圖5可知，當甲醇從2 mL增加至6 mL時，目標化合物萃取檢出量逐漸增加。當洗脫體積為6 mL時，萃取檢出量達到最大且隨著洗脫體積的增大，萃取檢出量沒有明顯提高。因此，本研究選擇6 mL作為目標分析物的洗脫體積。

2.2 方法學驗證

2.2.1 分析方法的線性關系、定量限、檢出限

量取“1.2.2”項下混合標準品溶液1.00、0.50、0.30、0.20、0.10 mL，分別置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，獲得5個梯度質量濃度的10-DAB Ⅲ和Taxol混合標準品溶液，分別過0.22 μm濾膜，在“1.2.5”項條件下進樣。以目標分析物色譜峰面積為縱坐標（y），質量濃度為橫坐標（x）作圖，得到回歸方程。信噪比（signal to noise ratio，S／N）為 3∶1和10∶1的質量濃度為目標化合物的檢出限和定量限。結果見表1。由表1可知，該方法線性相關系數(shù)均大于0.999 9，表明該方法具有良好的線性關系。

2.2.2 分析方法的精密度、穩(wěn)定性" 取同一MSPD樣品，在“1.2.5”項條件下，分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，測得目標化合物的日內精密度；分別于0、24、48 h進樣，測定日間精密度。兩種紫杉烷類化合物峰面積的日內精密度相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）分別為1.3%和1.5%，日間精密度RSD分別為1.1%和1.4%。這表明該方法的精密度、穩(wěn)定性良好。

2.2.3 分析方法的加樣回收率試驗" 在3個濃度水平（50%、100%、150%）下對樣品中10-DAB Ⅲ、Taxol進行加樣回收率測試，得到3個濃度水平的加標樣品回收率在93.6%～109.0%之間，RSD在1.2%～3.2%之間，結果見表2。

2.3 不同前處理方法比較

以云南紅豆杉枝葉為實驗樣品，比較了優(yōu)化后的MSPD與熱回流提取法、超聲提取法的分析結果見表3。由表3可知，3種前處理方法對10-DAB Ⅲ和Taxol的萃取檢出量無顯著差異，但是MSPD法在提取過程中僅需6 mL甲醇、20 min內即可完成。MSPD法與兩種傳統(tǒng)方法相比，MSPD法操作簡單、消耗的溶劑少、耗時短，具有較好的應用前景。

3" 討論與結論

樣品的前處理過程對天然產物含量分析有著至關重要的作用。相關文獻報道紅豆杉中紫杉烷

類化合物前處理方法包括超聲提取法（Wianowska et al.， 2009）、常規(guī)溶劑提?。↙i et al.， 2009）等，但都具有有機試劑消耗大、樣品量大、萃取效率低等缺點，不適用于紅豆杉中紫杉烷的快速定量分析。MSPD作為用于復雜基質中微量成分分析的前處理方法，具有簡單、快速、經濟環(huán)保等優(yōu)點（江璐依，2020），與傳統(tǒng)方法相比，消耗時間短，萃取效率高。

基質固相分散劑是影響目標化合物準確性的重要因素， 常見的分散劑包括正相色譜分散劑（硅

膠、氧化鋁、佛羅里硅土等）、反相色譜分散劑（以C18為基質）和新型分散劑，其作用原理不同，對樣品的吸附性也不同（陳馳，2020）。從MSPD法分散填料篩選結果可以看出，正相色譜填料對目標化合物的檢出量高于反相色譜填料，分析原因可能是正相色譜填料中的Si-OH等基團與化合物中的極性基團（-OH，-NH）形成氫鍵有關（王志兵，2015）。新型色譜填料HILIC對于紫杉烷類化合物的檢出量低于正相色譜填料，分析原因可能為HILIC填料對強極性基團吸附能力較強，作用機理與偶極作用、氫鍵作用等多種作用力有關（徐露露等，2016），不適合極性較弱的紫杉烷類化合物的洗脫，其機理仍需進一步研究。目前，最常用的是反相色譜填料為十八烷基硅膠（Kristenson et al.， 2006）可應用于農藥殘留測定、環(huán)境基質樣品分析（Sánchez-Brunete et al.， 2007），其吸附性能可通過其含水量或pH來調節(jié)（陳馳，2020）。在本研究填料篩選過程中發(fā)現(xiàn)，正相色譜填料中堿性氧化鋁對10-DAB Ⅲ和Taxol的檢出量高于其他正相分散劑，并且經過其富集、凈化后的樣品萃取液澄清、透明，可能是與堿性氧化鋁能夠反應性地吸附紅豆杉中諸如酸性酚類化合物等雜質有關。目前，堿性氧化鋁作為分散劑對紅豆杉進行凈化、萃取鮮有報道，本研究結果為其在紫杉烷類化合物的定量分析提供一定的參考。

分散劑與樣品質量比作為影響目標化合物萃取檢出量的重要因素，其比例需根據萃取柱大小等情況進行調節(jié)，如Chu等（2017）建立了基于基質固相分散萃取技術與高效液相色譜測定五味子中的木脂素類化合物的分析方法，在五味子樣品與分散劑質量比為1∶2、甲醇洗脫時，分析物檢出量最高。本研究選擇樣品質量為0.25 g，堿性氧化鋁的質量為0.75 g時，目標分析物可被分散劑充分吸附且易于洗脫，達到較好的萃取效果。

在基質固相分散萃取中，洗脫劑的選擇需要考慮目標分析物與分散劑吸附的性質等因素，可采用單一或者混合有機溶劑（陳馳，2015），也可采用水作為洗脫劑（Bogialli et al.， 2006）。在本研究中，我們選用了甲醇、乙腈、丙酮、乙醇4種極性較強溶劑對目標化合物進行洗脫，研究結果表明甲醇更適合于紫杉烷類化合物的洗脫，說明甲醇更適合于從堿性氧化鋁中解析紫杉烷類化合物。在萃取過程中，洗脫劑體積、濃度等因素對目標分析物檢出量也會產生影響，文獻報道洗脫劑體積在4～25 mL范圍內時大部分目標分析物均能被洗脫出來。例如，Salemi等（2012）采用基質固相分散法結合氣相色譜-電子捕獲檢測器對土壤中的16種有機氯農藥及其衍生物進行定量分析。本研究結果顯示，以10% C18的硅膠為分散劑，8 mL氯仿-正己烷為洗脫劑，目標分析物檢出量較高。本研究以6 mL甲醇洗脫，在節(jié)省溶劑的基礎上，目標化合物可得到較高的檢出量。

本文以堿性氧化鋁為分散劑，6 mL甲醇為洗脫劑，樣品與分散劑的質量比為1∶3為基質固相萃取條件，建立了MSPD-HPLC同時測定云南紅豆杉中10-DAB Ⅲ和Taxol的分析方法，并且通過比較分析，證明堿性氧化鋁作為正相填料，在基質固相萃取過程中對紫杉烷類化合物具有凈化和富集作用，并采取方法學實驗對其可行性進行驗證表明該方法回收率高，重現(xiàn)性好，在一定范圍內具有良好的線性關系，適用于云南紅豆杉中紫杉烷類化合物的快速分析。

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（責任編輯" 李" 莉" 王登惠）