珠子參葉皂苷對脂肪酶抑制機(jī)制及降血脂研究

DOI： 10.11931/guihaia.gxzw202303007

鄭花嬋， 孟令儒， 何苗， 等， 2024.

珠子參葉皂苷對脂肪酶抑制機(jī)制及降血脂研究 ［Ｊ］.

廣西植物， 44（6）： 1182-1194.

ZHENG HC， MENG LR， HE M， et al.， 2024.

Inhibition mechanisms and hypolipidemic effects on lipase of saponins from Panax japonicas var. major leaves" ［J］.

Guihaia， 44（6）： 1182-1194.

摘" 要：" 珠子參葉是五加科（Araliaca）植物珠子參（Panax japonicas var. major）的干燥帶梗葉，為秦巴地區(qū)特色中藥材。為合理開發(fā)利用珠子參葉并闡明其化學(xué)成分，該研究利用HPLC方法分析珠子參葉皂苷部位的主要化學(xué)成分，測定珠子參葉皂苷部位的脂肪酶抑制活性及抑制類型，通過分子對接及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證脂肪酶抑制機(jī)制及降血脂作用。結(jié)果表明：（1）珠子參葉皂苷部位主要成分為20（S）-人參皂苷Rg2、20（R）-人參皂苷Rg2、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rh2。（2）珠子參葉皂苷部位、20（R）-人參皂苷 Rg2對脂肪酶具有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50分別為0.14、2.30 μmol·L-1。（3）珠子參葉皂苷部位、20（R）-人參皂苷Rg2、人參皂苷Rb3對脂肪酶的抑制為可逆性抑制，抑制類型為非競爭型抑制。（4）配體與ARG337B、ASP331B、ILE248B殘基結(jié)合可能有助于提高配體的脂肪酶抑制活性。（5）珠子參葉總皂苷可以顯著降低高脂血癥小鼠血清中膽固醇和甘油三酯的含量。該研究為珠子參葉在降血脂方面的深入開發(fā)和利用提供了理論參考。

關(guān)鍵詞： 珠子參葉， 皂苷， 脂肪酶， 酶動(dòng)力學(xué)， 分子對接， 體內(nèi)驗(yàn)證

中圖分類號：" Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：" A

文章編號：" 1000-3142（2024）06-1182-13

收稿日期：" 2023-06-04" 接受日期： 2023-12-06

基金項(xiàng)目：" 陜西省科技廳項(xiàng)目（2018ZDXM-SF-007）； 陜西中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2019-YL12）； 陜西中醫(yī)藥大學(xué)質(zhì)量提升工程項(xiàng)目（ZG031）。

第一作者： 鄭花嬋（1998—），碩士研究生，主要從事中草藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，（E-mail）zhenghuachan678@163.com。

*通信作者：" 姜祎，教授，主要從事中草藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究，（E-mail）966812@qq.com。

Inhibition mechanisms and hypolipidemic effects on lipase of

saponins from Panax japonicas var. major leaves

ZHENG Huachan1，2， MENG Lingru1，2， HE Miao1，2， HUANG Wenli1，2， DAN Linwei1，2，

XU Hong1，2， DENG Chong1，2， ZHANG Huawei1，2， JIANG Yi1，2*， SONG Xiaomei1，2

（ 1. School of Pharmacy， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， Shaanxi， China; 2. Shaanxi Provincial Key Laboratory of

Basic and New Drug Research in Traditional Chinese Medicine， Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712046， Shaanxi， China ）

Abstract：" The dry aerial part of Panax japonicus var. major is called “Zhuzishen Ye”， it is a characteristic Chinese herbal medicine in Qinba area. In order to rationally develop and utilize “Zhuzishen Ye” and clarify its chemical constituents， the main chemical constituents of the saponin fractions from “Zhuzishen Ye” were analyzed with HPLC， the inhibitory activities and inhibition types of the saponin fractions of “Zhuzishen Ye” on lipase were determined， and the lipase inhibition mechanisms and hypolipidemic effects were verified with molecular docking and animal experiments. The results were as follows： （1） The chemical constituents of saponin fractions from “Zhuzishen Ye” were 20（S）-ginsenoside Rg2， 20（R）-ginsenoside Rg2， ginsenoside Rb2， ginsenoside Rb3， ginsenoside Rd and ginsenoside Rh2. （2） The saponin fractions of “Zhuzishen Ye” and 20（R）-ginsenoside Rg2had strong inhibitory effects on lipase with IC50 values of 0.14 and 2.30 μmol·L-1， respectively. （3） The saponin fractions of “Zhuzishen Ye”， 20（R）-ginsenoside Rg2 and ginsenoside Rb3 were all reversible inhibition， and the inhibition type was non-competitive inhibition. （4） The binding of ligands to ARG337B， ASP331B and ILE248B residues might help to improve the lipase inhibitory activity of ligands. （5） Saponins of “Zhuzishen Ye” could significantly reduce the content of cholesterol and triglyceride in serum of hyperlipidemia mice. This study provides the theoretical references for the further development and utilization of “Zhuzishen Ye”.

Key words： Panax japonicas var. major leaves， saponin， lipase， enzyme kinetics， molecular docking， verification in vivo

珠子參葉是五加科（Araliaceae）植物珠子參（Panax japonicus var. major）的干燥帶梗葉，性微寒，苦，甘；歸肝、肺、胃經(jīng)，具有清肺止咳、生津、潤喉、防暑、滋補(bǔ)強(qiáng)壯的功效，在民間多泡茶飲用（宋小妹，2011; 國家藥典委員會(huì)，2020）。珠子參葉的應(yīng)用歷史可追溯到清朝，由于當(dāng)時(shí)人參和人參葉價(jià)格日漸昂貴，珠子參葉作為人參和人參葉的替代品開始使用 （趙學(xué)敏，1963;陸維承，2016）。

脂肪酶是水解膳食中脂質(zhì)的關(guān)鍵酶（Jaeger amp; Reetz，1998; 廖家樂，2022），參與脂肪消化、吸收、利用的全過程（王哲等，2013）；抑制其活性能有效減少脂質(zhì)的消化吸收，從而降低血脂水平，抑制脂肪酶的活性是治療高脂血癥、肥胖、非酒精性脂肪肝等疾病的有效策略（Yun， 2007; de la Garza et al.， 2011）。三萜皂苷類化合物具有脂肪酶抑制作用，是潛在的有效治療肥胖及其相關(guān)疾病的化合物 （Han et al .， 2005; Yoshizumi et al.， 2006; Ercan amp; El， 2016; Liu et al.， 2017; 馮海燕，2019；邱悅，2020; Navarro Del Hierro et al.， 2020）。

珠子參作為常用中藥材，生長緩慢成藥周期長，目前野生珠子參已處于瀕危狀態(tài)，而珠子參葉作為非藥用部位被遺棄，造成資源浪費(fèi)。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)，珠子參葉的主要化學(xué)成分是三萜類化合物，包括20（22）E，24-達(dá)瑪二烯-3β，6α，12β-三醇、人參皂苷Rd、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3和人參皂苷Rc、人參皂苷Rs2、西洋參皂苷Rl、人參皂苷Rs1、三七皂苷Fe、人參皂苷Rd2、Gypenoside IX、20（21），24-達(dá)瑪二烯-3β，6α，12β-三醇、 20（22）Z，24-達(dá)瑪二烯-3β，6α，12β-三醇、珠子參苷Z等，還有5， 7-二羥基-8-甲氧基黃酮 （趙東東等，2013；何瑞等，2014；楊延等，2019；張化為等，2020）。因此，探究珠子參葉的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和生物活性，對提高珠子參全植株的利用率具有重要意義。目前，珠子參葉皂苷的脂肪酶抑制機(jī)制及降血脂作用尚未見報(bào)道。本研究以珠子參葉為研究對象，依托完善的天然產(chǎn)物開發(fā)研究平臺，綜合利用現(xiàn)代色譜分離手段和現(xiàn)代藥理學(xué)方法，擬探討以下問題：（1）珠子參葉皂苷部位主要成分為哪些； （2）珠子參葉皂苷部位對脂肪酶是否具有抑制作用；（3）珠子參葉皂苷部位對脂肪酶抑制類型為哪種；（4）珠子參葉皂苷部位成分與哪種殘基結(jié)合可提高脂肪酶抑制活性；（5）珠子參葉皂苷部位是否可以降脂。

1" 儀器與材料

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器和藥品

分析電子天平［EX125ZH型，奧豪斯儀器（常州）有限公司］；多功能酶標(biāo)儀（Synergy TM H1型，美國寶特Bio-Tek）；高效液相色譜儀（Waters e2695 型，美國Waters公司）；奧利司他膠囊（批號：190204，重慶華森制藥有限公司）；移液器（Research Plus系列，德國艾本德股份公司Eppendorf AG）；低速臺式離心機(jī)（TDL-50B型，上海安亭科學(xué)儀器廠）；高速臺式離心機(jī)（TG16-WS型，湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；皺褶假絲酵母脂肪酶（批號：S25740）、4-硝基苯基棕櫚酸酯（4-nitrophenyl palmitate，4-NPP，批號：EC250112）、檸檬酸鈉（批號：75164），以上試劑均購自美國Sigma公司；色譜乙腈（AH015型，Honeywell）；DMSO（批號：D6370）購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司； D101型大孔樹脂購自天津南開大學(xué)化工廠；20（S）-人參皂苷Rg2（貨號：B21058）、20（R）-人參皂苷Rg2（貨號：B21727）、人參皂苷Rb2（貨號：B21051）、人參皂苷Rb3（貨號：B21052）、人參皂苷Rd（貨號：B21054）均購自上海源葉生物科技有限公司；人參皂苷Rh2（貨號：111748）購自中國藥品生物制品鑒定所；50 mmol·L-1 Tris-HCl（pH：7.8）（批號：BB0512）購自陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD小鼠，共60只，體重為18～22 g，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SCXK（川）2020-030，適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d。

2" 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HPLC法分析化學(xué)成分

2.1.1 色譜條件" 色譜柱：Agela Technologies lnnoval ODS-2 （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）；流動(dòng)相：水溶液（A）-乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～10 min，10%→28%B; 10～27 min，28%→28%B; 27～33 min，28%→31%B；33～46 min，31%→31%B；46～50 min，31%→36%B；50～55 min，36%→39%B；55～70 min，39%→60%B；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL，檢測波長203 nm；流速1.0 mL·min-1。

2.1.2 供試品溶液的制備" 本實(shí)驗(yàn)所用藥材由陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級實(shí)驗(yàn)師鑒定為五加科人參屬珠子參（Panax japonicus var. major）的干燥葉。參照趙東東等（2013）的方法提取珠子參干燥葉。取干燥的70%乙醇洗脫部位粉末約 0.05 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲提取10 min，放冷，稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，得到所需濃度的溶液。

2.1.3 對照品溶液的配制" 精密稱取對照品20（S）-人參皂苷Rg2、20（R）-人參皂苷Rg2、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rh2，用甲醇分別制成濃度為0.10、0.25、0.10、0.25、0.11、0.50 mg·mL-1的溶液。

2.2 脂肪酶抑制實(shí)驗(yàn)及動(dòng)力學(xué)機(jī)制研究

2.2.1 不同皂苷對脂肪酶活性的影響" 脂肪酶抑制活性測定參考 （Liu et al.， 2018；王亞鳳等，2020；黃桂等，2021）報(bào)道的方法稍加修改，脂肪酶Tris-HCl溶液濃度為280 U·mL-1。4-NPP 的DMSO溶液濃度750 μmol·mL-1，奧利司他的濃度為250 μmol·mL-1，珠子參葉皂苷部位以DMSO為溶劑配制成濃度為2.52 mg·mL-1的溶液，20（S）-人參皂苷Rg2、20（R）-人參皂苷Rg2、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rh2以DMSO為溶劑配制成500 μmol·mL-1的溶液，使用時(shí)稀釋成不同濃度，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將25 μL珠子參葉皂苷部位（珠子參葉皂苷部位摩爾質(zhì)量按奧利司他摩爾質(zhì)量算，終濃度為0、0.625、6.25、62.5、125 μmol·mL-1）、人參皂苷Rb3（終濃度為0、5、12.5、125、250 μmol·mL-1）、20（S）-人參皂苷Rg2（終濃度為0、1、2.5、5、12.5 μmol·mL-1）、20（R）-人參皂苷Rg2（終濃度為0、25、50、125、250 μmol·mL-1）、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd、人參皂苷Rh2（終濃度為0、12.5、25、125、250 μmol·mL-1）和45 μL胰脂肪酶于96孔板中37 ℃孵育30 min，再加入90 μL 的4-NPP （終濃度為750 μmol·mL-1）37 ℃恒溫反應(yīng)20 min，加入檸檬酸鈉終止反應(yīng)，405 nm下測定吸光度。

按照如下公式計(jì)算胰脂肪酶活性：

胰脂肪酶活力=（A樣品-A樣品對照）/（A空白-A空白對照）×100%。

式中： A樣品為加入樣品和活性酶反應(yīng)后的吸光度；A樣品對照為加入樣品和失活酶反應(yīng)后的吸光度；A空白為加入活性酶和DMSO反應(yīng)后的吸光度；A空白對照為加入失活酶和DMSO反應(yīng)后的吸光度。所有反應(yīng)中均有4-NPP。

2.2.2 不同皂苷對脂肪酶活性的抑制機(jī)理" 按照“2.2.1”項(xiàng)下的珠子參葉皂苷部位、人參皂苷Rb3、20（S）-人參皂苷Rg2樣品濃度和4-NPP底物濃度，參照陳靜等（2021）的方法稍加修改，通過改變脂肪酶濃度（終濃度為0、70、140、280、560 U·mL-1）測定不同濃度樣品在不同濃度脂肪酶催化下水解4-NPP底物產(chǎn)生的吸光度。將25 μL不同樣品及濃度的皂苷和45 μL胰脂肪酶于96孔板中37 ℃孵育30 min，加入90 μL 4-NPP（終濃度為750 μmol·mL-1），405 nm下測定吸光度。按下式計(jì)算相對酶活力：

相對酶活力=（A2-A1）/（A4-A3） ×100%。

式中： A1和A2是不同皂苷、脂肪酶與4-NPP反應(yīng)初末的吸光度；A3和A4是脂肪酶與4-NPP反應(yīng)初末的吸光度。

2.2.3 不同皂苷對脂肪酶活性的抑制類型和抑制常數(shù)" 按照“2.2.2”項(xiàng)下的測定方法，固定脂肪酶的濃度，改變4-NPP（終濃度為0.375、0.75、1.5、3 mmol·mL-1），測定不同濃度皂苷對脂肪酶催化水解4-NPP后產(chǎn)生的吸光度。

2.3 分子對接數(shù)據(jù)庫及軟件

所用軟件包括 ChemBioDraw3D、AutoDockTools1.5.6、PyMOL、CADD1.5.6、Vision1.5.6。從PubChem數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)化合物的2D結(jié)構(gòu)文件，靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫中獲取，利用PyMOL軟件對靶蛋白進(jìn)行去除水分子、加氫等前處理，使用軟件AutoDock Tools1.5.6對化合物和靶蛋白進(jìn)行分子對接。靶蛋白及其結(jié)合位點(diǎn)為ILPB蛋白的A-BOG位點(diǎn)。

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.4.1 藥物的制備及給藥" 實(shí)驗(yàn)前將小鼠隨機(jī)分為6組：空白組（10只）、高脂血模型組（10只）、奧利司他組（10 只）、皂苷部位高中低劑量組（各10只）。其中，空白組飼喂基礎(chǔ)飼料，其他組飼喂高脂飼料，建立高脂血癥模型。

高脂飼料配方如下：15%豬油、5%蛋黃、20%糖、0.5%鹽、0.5%香油。

給予小鼠高脂飼料35 d后開始給藥，空白組及高脂血模型組給予一定劑量的生理鹽水，奧利司他組按照 46.8 mg·kg-1 灌胃給藥，各給藥組劑量按人每日服用量和提取物收率計(jì)算，高劑量組按照 117.0 mg·kg-1 給予小鼠珠子參葉皂苷部位提取物（相當(dāng)于70 kg 的成人每日服用 20 g 提取物），中劑量組按照 58.5 mg·kg-1 給予小鼠珠子參葉皂苷部位提取物，低劑量組按照 29.3 mg·kg-1 給予小鼠珠子參葉皂苷部位提取物，每日給藥一次，連續(xù)灌胃3周，于末次給藥后稱量體重。空白組、高脂血模型組小鼠給藥期間分別繼續(xù)飼喂基礎(chǔ)飼料及高脂飼料，期間受試小鼠均正常攝食攝水。

2.4.2 樣本采集及處理" 末次給藥后，所有小鼠禁食不禁水，16 h 后眼球取血，全血靜置，于 4 ℃下保存，再以 3 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心 15 min，分離血清，按組依次分裝，于-80 ℃冰箱中保存，備用。

2.4.3 生化指標(biāo)的測定" 血清總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）的含量分別按照試劑盒的說明書進(jìn)行測定。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有的統(tǒng)計(jì)分析均使用 Graphpad Prism 8.0.1 軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（x±s）表示，兩組比較用t檢驗(yàn)，多組之間兩兩比較采用單因素方差分析。

3" 結(jié)果與分析

3.1 色譜數(shù)據(jù)采集

由圖1可知，珠子參葉皂苷部位的主要成分為20（S）-人參皂苷Rg2、20（R）-人參皂苷Rg2、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rb3、人參皂苷Rd、人參皂苷Rh2。

3.2 脂肪酶活性測定結(jié)果

以“2.2.1”所述方法測定各皂苷的脂肪酶抑制活性，測試結(jié)果見表1。由圖2可知，珠子參葉皂苷部位、20（R）-人參皂苷 Rg2、人參皂苷Rb3反應(yīng)體系吸光度隨時(shí)間的延長而逐漸增大，吸光度隨時(shí)間變化的曲線通過原點(diǎn)，不存在遲滯效應(yīng)。在相同反應(yīng)時(shí)間下，隨著珠子參葉皂苷部位、20（R）-人參皂苷 Rg2、人參皂苷Rb3樣品濃度的增大，曲線的斜率不斷減小，即脂肪酶催化水解4-NPP的速度不斷降低，說明其具有抑制脂肪酶活性的作用。在反應(yīng)0～7.5 min時(shí)A405 nm -Time曲線近似呈線性關(guān)系，隨著時(shí)間的延長，曲線逐漸平坦，斜率降低，反應(yīng)的速度也隨之降低，此時(shí)測得的酶活力不能代表真實(shí)的酶活力，故取反應(yīng)7.5 min時(shí)的反應(yīng)速度為初速度。由表1和圖3可知，珠子參葉皂苷部位、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rd、人參皂苷Rh2、20（S）-人參皂苷Rg2、20（R）-人參皂苷 Rg2、人參皂苷Rb3的IC50分別為0.14、28.00、31.00、18.00、8.73、2.30、60.76 μmol·L-1。

3.3 不同皂苷對脂肪酶的抑制作用機(jī)理

按照“2.2.2”項(xiàng)下的測定方法，將反應(yīng)液置于酶標(biāo)儀中37 ℃恒溫，間隔20 s測定1次共7.5 min，選?。?～7.5 min吸光度隨時(shí)間的改變擬合方程，其斜率）即為酶活力值。以相對酶活力對酶濃度作圖，根據(jù)圖像判斷不同皂苷對脂肪酶活性的抑制作用是否可逆。如果作圖結(jié)果為一組直線且

通過原點(diǎn)，則為可逆抑制；如果只得到一組平行直線，則為不可逆抑制。

由圖4可知，以酶活力對酶濃度作圖時(shí)，得到一組通過原點(diǎn)的直線，該直線的斜率隨著珠子參葉皂苷部位、20（R）-人參皂苷Rg2、人參皂苷Rb3濃度的增大而逐漸降低，表明珠子參葉皂苷部位、20（R）-人參皂苷Rg2、人參皂苷Rb3是通過抑制脂肪酶活力導(dǎo)致脂肪酶催化水解4-NPP的速度減慢，而不是通過降低有效酶量所導(dǎo)致的，說明珠子參葉皂苷部位、20（R）-人參皂苷Rg2、人參皂苷Rb3對脂肪酶活性的抑制屬于可逆型抑制。

3.4 不同皂苷對脂肪酶活性的抑制類型和抑制常數(shù)

利用“2.2.3”項(xiàng)下的測定結(jié)果按照V=ΔA405/t計(jì)算催化反應(yīng)速度，以反應(yīng)速度的倒數(shù)（1/V）對底物濃度的倒數(shù)（1/S）作圖，判斷珠子參葉皂苷部位、人參皂苷Rb3、20（S）-人參皂苷Rg2對脂肪酶活性的抑制類型和抑制常數(shù)。

由Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖（圖5）可知，3個(gè)樣品圖均為相交于橫軸一點(diǎn)的線，隨著樣品濃度的增大，Km值不變，Vm值逐漸減小，符合非競爭型抑制類型的特征。以Lineweaver-Burk曲線中的斜率對3個(gè)樣品濃度作圖，得到3個(gè)樣品的Km值分別為1.07，0.83，8.64（圖5），抑制劑的結(jié)合常數(shù)KI分別為0.27、2.53、0.17（圖6），以截距對濃度得到抑制常數(shù)KIS分別為21.46、28.00、3.80（圖7）。

3.5 分子對接結(jié)果

采用分子對接技術(shù)探討配體與蛋白ILPB的相互作用。20（R）-人參皂苷Rg2與ILPB的ARG38A、LEU41A、ASP331B、SER333B、ARG337B、LYS367B形成氫鍵結(jié)合，與HIS30A、ALA40A、 ILE248B等氨基酸殘基形成疏水互作，見圖8：A；20（S）-人參皂苷Rg2與ILPB的結(jié)合方式與20（R）-人參皂苷Rg2相似見圖8：B，其不同之處在于20（S）-人參皂苷Rg2糖苷基4位和5位氫鍵同時(shí)與SER333B氨基酸殘基連接；人參皂苷Rb2與ILPB的結(jié)合方式見圖8：C，人參皂苷Rb2與GLU13A、GLN29A、ASP31A、LEU36A、SER35A、ARG13A、CYS39A、ASP331B、ARG337B、LYS367B形成氫鍵結(jié)合，與GLU13A殘基形成疏水互作，人參皂苷Rb2與LYS367B之間形成π-陽離子相互作用力，嵌入ILPB蛋白活性口袋中實(shí)現(xiàn)與ILPB的結(jié)合；人參皂苷Rb3與ILPB的結(jié)合方式見圖8：D，人參皂苷Rb3與ASP31A、LEU36A、LEU41A、LYS42A、CYS61A形成氫鍵結(jié)合，GLU13A、ARG38A、ALA40A等氨基酸殘基形成疏水互作，嵌入ILPB蛋白活性口袋中實(shí)現(xiàn)與ILPB的結(jié)合；人參皂苷Rd與ILPB的結(jié)合方式見圖8：E，人參皂苷Rd與ASP31A、ARG38A、ALA40A、ALA43A、ARG44A形成氫鍵結(jié)合，與GLU13A、ALA40A、LEU41A、ALA43A等氨基酸殘基形成疏水互作，嵌入ILPB蛋白活性口袋中實(shí)現(xiàn)與ILPB的結(jié)合；人參皂苷Rh2與ILPB的結(jié)合方式見圖8：F，人參皂苷Rh2與GLN29A、LYS42A、GLU48A、CYS61A形成氫鍵結(jié)合， 與GLU13A、ALA40A、LEU41A、ILE248B、ALA332B氨基酸殘基形成疏水互作，嵌入ILPB蛋白活性口袋中實(shí)現(xiàn)與ILPB的結(jié)合；奧利司他與ILPB的結(jié)合方式見圖8：G，奧利司他與ARG337B、ALA332B、ASP331B 形成氫鍵結(jié)合， ILE248B和LEU41A 氨基酸殘基形成疏水互作，嵌入ILPB蛋白活性口袋中實(shí)現(xiàn)與ILPB的結(jié)合。

3.6 膽固醇和甘油三酯測定結(jié)果

由圖9可知，高脂血模型組小鼠血清中TG、TC含量均明顯高于空白組（P＜0.01），說明高血脂模型造模成功；皂苷部位的低、中、高劑量組小鼠血清中的TG、TC含量均明顯低于高脂血模型組（P＜0.01），其中高劑量組降低TG作用與奧利司他組相當(dāng)，降低TC作用優(yōu)于奧利司他組。

4" 討論與結(jié)論

長期以來，由于對合理開發(fā)利用中藥植物資源認(rèn)識不足，導(dǎo)致對中藥植物資源進(jìn)行掠奪式過度采收，使得一些中藥資源處于瀕危狀態(tài)。為了保護(hù)和合理開發(fā)珠子參資源，對珠子參整株植物進(jìn)行系統(tǒng)化學(xué)研究和藥用價(jià)值探索，以提高珠子參資源的利用率。珠子參地下部分為傳統(tǒng)藥用部位，其地上部分的藥用價(jià)值有待開發(fā)，而在地下部分采收過程中地上部分大多被遺棄，藥農(nóng)僅保留少量在民間泡茶飲用，造成一定的資源浪費(fèi)。另外，珠子參為多年生草本植物，每年秋季種植基地和野生資源的珠子參地上部分自然枯萎腐爛，未被合理采收使用。前期研究發(fā)現(xiàn)，珠子參葉主要成分為三萜皂苷類化合物且具有脂肪酶抑制作用，本研究采用HPLC確定珠子參葉皂苷部位的主要單體成分，測定其體內(nèi)外脂肪酶抑制作用，為珠子參資源合理開發(fā)利用提供了依據(jù)。

脂肪進(jìn)入小腸后被胰脂肪酶水解，中鏈甘油三酯被水解為游離脂肪酸和甘油，中鏈脂肪酸與白蛋白結(jié)合，通過門靜脈轉(zhuǎn)移到肝臟；長鏈甘油三酯被水解為游離脂肪酸、單?；视王ズ透视?，長鏈脂肪酸在小腸中形成乳糜微粒，經(jīng)淋巴管流入靜脈系統(tǒng)被輸送到脂肪組織和肌肉等外周組織，一部分被氧化，另一部分重新合成甘油三酯儲存在組織中（Buhman et al.， 2002; Takeuchi et al.， 2002; Siddiqi， et al.， 2006;姚曉琳等，2018）。脂肪酶負(fù)責(zé)水解胃腸中50%～70%膳食脂肪，是防治肥胖的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，而脂肪酶抑制劑可通過降低該酶的活性減少消化器官中膳食脂肪的分解和吸收，進(jìn)而改善肥胖和高脂血癥等代謝性疾?。缰緡?，2009）。奧利司他是臨床上常用的胰脂肪酶抑制劑，是美國FDA批準(zhǔn)的唯一的脂肪酶抑制劑 （Kang amp; Park， 2012），能夠抑制胰脂肪酶、胃腸道的羧基酯酶和磷脂酶A2的活性，減慢胃腸道中食物脂肪的水解過程，進(jìn)而減少飲食中25%～30%的脂肪水解和吸收 （Zhi et al.， 1999；Benet et al.， 2011），進(jìn)而減少熱量攝入，控制體重，降低因肥胖帶來的一系列健康問題。因此，本研究選擇奧利司他作為陽性藥。皺褶假絲酵母脂肪酶和4-NPP 常用于測定化合物的脂肪酶抑制活性（Doolittle amp; Ben-Zeev， 1999；侯成波，2016）。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明

珠子參葉皂苷部位和20（R）-人參皂苷 Rg2表現(xiàn)出良好的脂肪酶抑制作用，是潛在的脂肪酶抑制劑。

由于珠子參葉皂苷部位和20（R）-人參皂苷 Rg2具有較強(qiáng)的脂肪酶抑制作用，并且人參皂苷Rb3在珠子參葉皂苷部位峰面積最高，因此本研究測定3個(gè)樣品對脂肪酶的抑制機(jī)制。動(dòng)力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，珠子參葉皂苷部位、20（R）-人參皂苷 Rg2、人參皂苷Rb3對脂肪酶均為可逆性非競爭性抑制，表明該化合物不僅與游離酶結(jié)合，還與酶-底物復(fù)合物結(jié)合，為闡明其脂肪酶抑制機(jī)制提供了依據(jù)。

分子對接技術(shù)是一種模擬生物大分子與配體小分子結(jié)合及計(jì)算結(jié)合強(qiáng)度的手段，通過分子對接的方式來篩選活性分子，從而評價(jià)配體小分子與受體的相互作用（歐海亞等，2021；席佳越等，2022）。分子對接結(jié)果顯示，珠子參葉皂苷成分與ARG337B、ASP331B、ILE248B殘基結(jié)合可能有助于提高配體的脂肪酶抑制活性。抑制脂肪酶的活性可有效減少脂質(zhì)的消化吸收，從而降低血脂水平。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，珠子參葉皂苷部位能顯著降低高血脂小鼠血清中的TG和TC含量，提示珠子參葉皂苷部位可能是通過抑制脂肪酶的活性來發(fā)揮降脂作用。

中藥中常含有多種活性成分，而中藥治療疾病往往是多種活性成分相互協(xié)同作用的結(jié)果 （王四旺，2008）。珠子參葉皂苷部位的脂肪酶抑制活性強(qiáng)于6個(gè)單體成分，可能是珠子參葉皂苷部位多組分之間相互協(xié)同作用的結(jié)果，也可能是珠子參葉中含有高活性脂肪酶抑制作用的單體化合物尚未被發(fā)現(xiàn)。本課題組將在今后的研究中，繼續(xù)分離珠子參葉的化學(xué)成分，進(jìn)一步闡明化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及生物活性。

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（責(zé)任編輯" 李" 莉" 王登惠）