趙夢(mèng)涵,俞 琦

(貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550025)

近年來(lái),隨著人口老齡化逐年增加,腦卒中、冠心病等心血管疾病的患病率和死亡率持年上升,已位于死因譜的前列,同時(shí)也是造成死亡和疾病的首要病因[1]。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病的主要病理改變,是一種由脂質(zhì)蓄積所導(dǎo)致的動(dòng)脈內(nèi)膜炎癥性疾病[2]。在AS病變過(guò)程中,大量氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)聚集在受損血管內(nèi)膜,產(chǎn)生細(xì)胞毒性,使內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞損傷,導(dǎo)致細(xì)胞死亡,從而加速AS發(fā)展[3]。鐵死亡是一種受調(diào)控的促炎性的細(xì)胞死亡方式,主要與谷胱甘肽(GSH)的消耗、脂質(zhì)的過(guò)氧化和鐵代謝異常密切相關(guān)[4]。AS發(fā)生時(shí),細(xì)胞內(nèi)鐵離子聚集導(dǎo)致鐵過(guò)載,鐵離子通過(guò)Fenton反應(yīng)造成活性氧(ROS)堆積,使細(xì)胞氧化性死亡。研究表明,鐵沉積是晚期動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的重要特征,鐵過(guò)載可促進(jìn)氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化等進(jìn)程,增加斑塊的不穩(wěn)定性[5]。

研究證實(shí),虎杖及其主要活性成分在抗AS發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用?；⒄染哂星鍩峤舛尽⒗麧耢铒L(fēng)、活血散淤(破血祛淤)等功效,主治腹瀉、發(fā)熱、濕熱黃疸[6]?；⒄戎饕絮?、黃酮類、二苯乙烯類化合物[7]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,虎杖在抗炎、抗血栓、抗氧化、保護(hù)心肌、抗腫瘤等方面表現(xiàn)出良好的藥理作用[8]?；⒄瓤梢哉{(diào)節(jié)AS模型兔的脂質(zhì)代謝,抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖及抗炎機(jī)制綜合發(fā)揮抗AS的作用[9]。同時(shí),虎杖及其主要活性成分也可以調(diào)節(jié)鐵代謝?；⒄戎械幕钚猿煞珠纹に亍邹继J醇可以抑制Fe2+積累和ROS的產(chǎn)生,保護(hù)鐵死亡關(guān)鍵標(biāo)志物GSH與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)活性,降低脂質(zhì)過(guò)氧化,從而抑制鐵死亡的發(fā)生[10-11]。迄今為止,尚未闡明虎杖抑制鐵死亡治療AS的作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可獲取數(shù)目龐大、結(jié)構(gòu)多樣的生物信息,有利于中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展。本研究利用網(wǎng)路藥理學(xué),篩選虎杖的主要成分與靶點(diǎn),系統(tǒng)研究“虎杖成分-靶標(biāo)-疾病-通路”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,為虎杖治療AS的臨床推廣提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),同時(shí)為系統(tǒng)了解鐵死亡在AS中扮演的重要角色提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 虎杖化合物的篩選和靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)TCMSP(https://tcmspw.com/),以虎杖為關(guān)鍵詞檢索其所有化學(xué)成分。根據(jù)藥物在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化,對(duì)虎杖的活性成分按口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18來(lái)篩選虎杖的藥效物質(zhì)及相應(yīng)靶點(diǎn)。其中活性成分虎杖苷和白藜蘆醇的OB值和DL值未能通過(guò)初篩,但林園園[12]、李世環(huán)[13]研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷和白藜蘆醇有抗AS的作用,因此將其列入其中。在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)選取人源基因,限定物種為“human”,對(duì)靶蛋白進(jìn)行匹配,將靶蛋白名稱轉(zhuǎn)換成對(duì)應(yīng)的基因名稱。

1.2 動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)和Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)輸入關(guān)鍵詞“atherosclerosis”,查找相關(guān)的靶點(diǎn)基因。若靶點(diǎn)太多,根據(jù)Score值≥中位數(shù)的方法,篩選出適當(dāng)?shù)幕?保留靶點(diǎn)Score值高的,值越高說(shuō)明靶點(diǎn)與疾病關(guān)系越密切。將虎杖活性成分靶點(diǎn)集與AS靶點(diǎn)集分別輸入Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中獲取交集靶點(diǎn),即為虎杖治療AS的潛在靶點(diǎn)。

1.3 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運(yùn)用Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建虎杖有效成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 虎杖對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將得到的交集靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入到STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org/cgi/ input.pl),選擇物種為“Homo sapiens”,獲得蛋白間相互作用信息,構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network,PPI),再將其導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件進(jìn)行可視化處理。

1.5 基因富集分析

將公共靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(https://metascape.org/)對(duì)虎杖治療 AS 的相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行 GO 富集和 KEGG 通路富集分析,將分析結(jié)果導(dǎo)入微生信(https://bioinformatics.com.cn/)生成GO柱狀圖和KEGG氣泡圖。

1.6 鐵死亡調(diào)控基因獲取及與虎杖、動(dòng)脈粥樣硬化3者靶點(diǎn)綜合分析

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)和FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù),查找與鐵死亡相關(guān)的靶標(biāo)基因。將鐵死亡的靶標(biāo)基因和上述虎杖與AS的交集靶點(diǎn)輸入到Venny2.1.0中,提取其公共靶點(diǎn),為虎杖調(diào)控鐵死亡治療AS的靶點(diǎn)。將公共靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù),構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG 通路富集分析。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.Ncbi.nlm.nih.gov /)中查找虎杖調(diào)控鐵死亡抗AS主要成分的三維結(jié)構(gòu),并使用Chem3D進(jìn)行能量最小化,作為分子對(duì)接的小分子配體。將虎杖調(diào)控鐵死亡抗AS公共基因中Degree排在前3位基因輸入在 UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)中,篩選公共基因所對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì) ID,限定物種為“human”,PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入蛋白質(zhì)ID 獲得蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),作為分子對(duì)接的大分子受體。利用SYBYL-X 2.0軟件對(duì)受體去水、加氫、修復(fù)側(cè)鏈后和配體進(jìn)行對(duì)接。

2 結(jié)果

2.1 虎杖有效成分及靶點(diǎn)篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)中共得到虎杖62個(gè)化學(xué)成分,根據(jù)OB≥30%且DL≥0.18,共得化合物10個(gè),靶點(diǎn)324個(gè),將這324個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù),去除無(wú)靶點(diǎn)者和刪去重復(fù)項(xiàng),加上虎杖苷和白藜蘆醇,得到化合物10個(gè),靶點(diǎn)252個(gè)。為方便后續(xù)研究,將化合物分別編號(hào)HZ1～HZ10,具體信息見(jiàn)表1。

表1 虎杖活性成分信息

2.2 虎杖與動(dòng)脈粥樣硬化交集靶點(diǎn)的篩選

以“atherosclerosis”為關(guān)鍵詞,在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)和Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,篩去Score值低的,共得AS直接靶點(diǎn)1328個(gè)。利用Venny 圖在線工具分析AS靶點(diǎn)與虎杖有效活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的共有部分,獲得虎杖對(duì)抗AS的 146個(gè)預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 虎杖活性成分靶點(diǎn)與動(dòng)脈粥樣硬化交集靶點(diǎn)

2.3 “虎杖-活性成分-交集靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Cytoscape 3.9.1軟件構(gòu)建虎杖-有效活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。圖2中,圈中間的為虎杖,圈的節(jié)點(diǎn)代表虎杖有效活性成分,三層方塊圈為交集靶點(diǎn),邊線代表虎杖活性成分與交集靶點(diǎn)的相互聯(lián)系。見(jiàn)圖2。

圖2 虎杖“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置人源物種,獲得靶標(biāo)相互作用關(guān)系,設(shè)置置信度為0.9,隱藏?cái)嚅_(kāi)節(jié)點(diǎn)靶點(diǎn),得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖,其中包含146個(gè)節(jié)點(diǎn),692條邊。將PPI網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入到Cytoscape軟件進(jìn)行優(yōu)化,然后使用CentiScaPe 2.2 Menu插件進(jìn)行篩選,Degree Centrality為10.134,Betweenness Centrality為232.7164,Closeness Centrality為0.0028,以AKT1、MAPK3、JUN、STAT3、MAPK1為度值前5靶點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

圖3 虎杖抗動(dòng)脈粥樣硬化作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 KEGG通路分析與GO富集

將虎杖抗AS的146個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù),GO富集結(jié)果中,生物過(guò)程(Biological process,BP)有1973條,細(xì)胞組成(cellular component,CC)有76條,分子功能(molecular function,MF)有156條。根據(jù)富集結(jié)果顯著性較強(qiáng)的前10位,導(dǎo)入到微生信在線工具平臺(tái),做出柱狀圖。見(jiàn)圖4。獲取KEGG通路的富集共有189條通路,根據(jù)富集結(jié)果,顯著性較強(qiáng)的前20位導(dǎo)入到微生信在線工具平臺(tái),做出氣泡圖。見(jiàn)圖5。

圖4 GO生物學(xué)功能富集結(jié)果

圖5 KEGG信號(hào)通路

2.6 鐵死亡調(diào)控基因獲取及與虎杖、動(dòng)脈粥樣硬化3者靶點(diǎn)綜合分析

以“ferroptosis”為關(guān)鍵詞,在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)和FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,共得鐵死亡直接靶點(diǎn)887個(gè)。將鐵死亡靶標(biāo)與上述146個(gè)公共基因輸入Venny圖在線工具分析中,獲得44個(gè)公共靶點(diǎn)。這44個(gè)基因既是虎杖作用靶點(diǎn),也是抗AS的靶點(diǎn),同時(shí)也是鐵死亡調(diào)控基因。如圖6。將這44個(gè)公共靶點(diǎn)導(dǎo)入 STRING 數(shù)據(jù)庫(kù),獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖,在Cytoscape 軟件進(jìn)行優(yōu)化,度值前三的靶點(diǎn)為TP53、JUN、IL-6。如圖7。對(duì)這44個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析,根據(jù)富集結(jié)果,顯著性較強(qiáng)的前20位導(dǎo)入到微生信在線工具平臺(tái),做出氣泡圖,富集較強(qiáng)的為MAPK信號(hào)通路。見(jiàn)圖8。

圖6 虎杖調(diào)控鐵死亡抗動(dòng)脈粥樣硬化交集靶點(diǎn)

圖7 虎杖調(diào)控鐵死亡抗動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖8 虎杖調(diào)控鐵死亡抗動(dòng)脈粥樣硬化KEGG信號(hào)通路

2.7 分子對(duì)接

為了驗(yàn)證虎杖調(diào)控鐵死亡抗AS,最后對(duì)分子對(duì)接進(jìn)行研究。受體選用上述44個(gè)公共靶點(diǎn)的前3個(gè),即TP53(PDB ID:1TUP)、JUN(PDB ID:1JNM)、IL-6(PDB ID:4CNI)。配體選用虎杖10個(gè)關(guān)鍵中藥成分。在進(jìn)行對(duì)接時(shí),以總打分值(Total Score)≥ 5為篩選條件篩選對(duì)接結(jié)果較好的化學(xué)成分,總打分值越高說(shuō)明結(jié)合較為穩(wěn)定。對(duì)接結(jié)果中,TP53和IL-6有4個(gè)活性成分的Total Score>5,JUN有3個(gè)活性成分的Total Score>5,1個(gè)活性成分Total Score>4。對(duì)接評(píng)分如圖9。最后對(duì)接結(jié)果較好的化學(xué)成分和蛋白晶體進(jìn)行可視化。如圖10。

圖9 分子對(duì)接結(jié)果

圖10 分子對(duì)接可視化

3 討論

研究表明,AS致病機(jī)制較為復(fù)雜,經(jīng)過(guò)大量的研究,目前存在的學(xué)說(shuō)有炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)、脂質(zhì)代謝學(xué)說(shuō)、糖尿病學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)等[14-16]。對(duì)AS準(zhǔn)確預(yù)防和治療尚不明確。鐵死亡的主要機(jī)制與GSH/GXP4抗氧化系統(tǒng)活性、脂質(zhì)過(guò)氧化程度、鐵代謝等多個(gè)途徑有關(guān),并且參與AS多個(gè)病理過(guò)程,成為研究AS的新靶點(diǎn)[17]。中草藥的功效是多靶點(diǎn)、多途徑、多種活性物質(zhì)共同作用的結(jié)果,在調(diào)控鐵死亡中有獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有系統(tǒng)性和整體性的特點(diǎn),通過(guò)“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”相互作用網(wǎng)路來(lái)分析中草藥的復(fù)雜性[18],為臨床防治提供理論依據(jù)。本研究首次將鐵死亡與網(wǎng)絡(luò)藥理結(jié)合,通過(guò)藥物靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)及鐵死亡相關(guān)靶點(diǎn)三者結(jié)合取交集,同時(shí)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證藥物成分與AS鐵死亡靶點(diǎn)結(jié)合能力,從鐵死亡角度進(jìn)一步證實(shí)虎杖治療AS的部分分子機(jī)制。

通過(guò)在數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索,篩選出10個(gè)有效活性成分和146個(gè)抗AS作用靶點(diǎn),最終得到虎杖抗AS的重要活性成分——白藜蘆醇和槲皮素。這146個(gè)靶點(diǎn)再與鐵死亡調(diào)控基因分析,得到44個(gè)公共靶點(diǎn),而 TP53、JUN與IL-6是AS鐵死亡過(guò)程中的主要靶點(diǎn)。研究顯示,越來(lái)越多的基因被發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控鐵死亡的進(jìn)程,其中這三位關(guān)鍵靶點(diǎn)也包含其中。研究報(bào)道,TP53是鐵死亡中的樞紐基因[19]。TP53基因調(diào)控細(xì)胞死亡模式,影響氧化還原狀態(tài),從而改變代謝過(guò)程和對(duì)鐵死亡的反應(yīng)[20]。何信用[21]等研究發(fā)現(xiàn),TP53激活鐵死亡的病理過(guò)程,谷胱甘肽(GSH)合成降低,引起GPX4活性降低,抗氧化能力降低,ROS升高,誘發(fā)細(xì)胞死亡,導(dǎo)致氧化損傷,加劇AS病情發(fā)展。IL-6在驅(qū)動(dòng)鐵死亡表達(dá)中起著關(guān)鍵作用[22]。Yang[23]等研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)NF-κB途徑誘導(dǎo)IL-6,增加血清鐵濃度和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度的表達(dá),增加了鐵死亡。Zheng[24]等研究表明,經(jīng)過(guò)體內(nèi)驗(yàn)證得出,JUN是鐵死亡的相關(guān)靶點(diǎn)和生物標(biāo)記物,并可作為預(yù)防心血管事件的重要靶點(diǎn)。研究報(bào)道,白藜蘆醇顯著降低血清與胸主動(dòng)脈中IL-6水平,減緩炎癥反應(yīng),從而減輕AS的發(fā)展[25]。同時(shí),白藜蘆醇誘導(dǎo)TP53蛋白水平增加,加強(qiáng) TP53基因的啟動(dòng)子活性[26]。研究發(fā)現(xiàn),槲皮素抑制脂多糖誘導(dǎo)炎癥動(dòng)物模型中JUN和IL-6蛋白水平的上調(diào),減輕炎癥反應(yīng)[27]。TP53、IL-6、JUN靶點(diǎn)可能與AS的鐵死亡發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而白藜蘆醇和槲皮素可能抑制這些基因在AS的表達(dá)發(fā)揮治療作用。

通過(guò)KEGG富集分析結(jié)果顯示,MAPK信號(hào)通路在AS的鐵死亡中至關(guān)重要。Mu[28]等研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞發(fā)生鐵死亡后,能激活炎性信號(hào)通路,增加炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)鐵代謝可以改變T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能,控制炎癥發(fā)生。因此,鐵死亡和炎癥也有密切關(guān)系。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信號(hào)從細(xì)胞外向細(xì)胞核傳遞途徑之一,包括P38MAPK、ERK和JUN信號(hào)通路,參與炎癥信號(hào)傳導(dǎo),并響應(yīng)各種細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外刺激(包括氧化應(yīng)激),細(xì)胞凋亡等多種病理生理過(guò)程,與AS“炎癥學(xué)說(shuō)”發(fā)病機(jī)制最為密切[29]。Zhao[30]等研究發(fā)現(xiàn),AS模型的大鼠中通過(guò)促進(jìn)P38、ERK、JUN表達(dá),激活MAPK信號(hào)通路,加重AS癥狀,該發(fā)現(xiàn)與本文所得出研究結(jié)果相符。另外,槲皮素降低促炎因子的表達(dá),如IL-6和IL-17A,抑制TNF-α誘導(dǎo)MAPK通路激活[31]。Meng[32]等研究發(fā)現(xiàn),槲皮素可以提高抗氧化能力并抑制磷酸化MAPK和NF-κB的表達(dá)。

虎杖可能通過(guò)槲皮素和白藜蘆醇介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路,減緩AS的鐵死亡炎癥反應(yīng)。白藜蘆醇也可消除大鼠血清ROS水平升高,下調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá),抑制MAPK通路,減緩炎癥反應(yīng)[33]。因此,虎杖可能通過(guò)槲皮素和白藜蘆醇介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路,減輕AS的鐵死亡炎癥反應(yīng)。

本研究將關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)對(duì)接在分子水平,結(jié)果表明,槲皮素和白藜蘆醇能夠與TP53、JUN、IL-6成功對(duì)接,總分在5.0以上,表明關(guān)鍵成分于靶標(biāo)具有較強(qiáng)的結(jié)合力。

4 結(jié)論

綜上所述,利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)對(duì)虎杖調(diào)控鐵死亡治療AS的作用機(jī)制進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)槲皮素和白藜蘆醇作為虎杖有效活性成分,可通過(guò)TP53、IL-6、JUN等靶點(diǎn),介導(dǎo) MAPK信號(hào)通路,從細(xì)胞鐵死亡途徑證明虎杖改善AS癥狀,并通過(guò)分子對(duì)接進(jìn)行了驗(yàn)證,也為下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供參考。