黃海榮

高通量測序技術泛指二代測序技術和三代測序技術,也被統(tǒng)稱為新一代測序技術(next generation sequencing,NGS)。依據(jù)檢測策略的不同,高通量測序方法主要分為靶向測序(targeted NGS,tNGS)、宏基因組(metagenomics NGS,mNGS),以及全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)。tNGS先通過靶向捕獲特定基因后再進行高通量測序,具有能同時平行檢測多個靶基因的特點,近期在結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)耐藥基因檢測領域開始被應用[1]。 2023年7月,世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)發(fā)布了《應用新一代靶向測序技術檢測耐藥結核病:快速通告,2023》[2],在tNGS技術全球應用尚處于起步階段的背景下,足以體現(xiàn)WHO對新一代tNGS技術在耐藥結核病診斷中應用前景的認可和高度重視。WHO希望在有關tNGS技術在耐藥結核病診斷中應用的更為詳細的數(shù)據(jù)正式公布之前,提前向全球分享此次對該項技術分析后的主要發(fā)現(xiàn)和結論,以提高結核病防控領域對tNGS技術檢測MTB耐藥應用價值的認識,從而推動該新技術的合理應用和推廣。

一、tNGS技術檢測MTB耐藥推薦意見的形成過程

2022年,WHO組織專家對商業(yè)化的以診斷耐藥結核病為目標的tGNS技術相關的已發(fā)表和待發(fā)表的數(shù)據(jù)進行薈萃分析。專家組以臨床標本處理作為關注的起點,以檢測報告作為結果評價的對象,對耐藥基因突變的解讀以WHO的MTB標準基因突變目錄作為參考依據(jù),對tGNS技術的診斷準確性、成本效益,以及檢測的可行性、可接受性、公平性和用戶評價等進行綜合分析。WHO專門成立了指南制定小組(Guideline Development Group,GDG),在2023年5月召開會議,對薈萃分析結果進行討論并形成推薦意見。本版快速通告發(fā)布的目的是為向國家級結核病防治規(guī)劃實施者及其他利益相關方分享WHO對tNGS技術診斷耐藥結核病數(shù)據(jù)分析后的主要發(fā)現(xiàn)和觀點,更為詳細的數(shù)據(jù)和建議將在晚些時候發(fā)布的《WHO結核病整合指南模塊3:診斷——結核病的快速診斷(2023年修訂版)》中發(fā)布。

二、tNGS技術應用于耐藥結核病診斷的臨床背景

雖然耐藥分子診斷技術不斷問世,普及程度逐步提高,但常用分子檢測技術的缺陷也日益顯現(xiàn)。目前主流的分子診斷技術產(chǎn)品主要針對特定藥物的靶基因進行檢測,雖然技術的可靠性已被廣泛認可,但對于尚沒有建立相應檢測方法的抗結核藥物,在化療方案中選用這些藥物仍具有盲目性[3]?？紤]到耐藥的實際發(fā)生情況,不管是針對敏感結核病的化療方案還是耐藥結核病化療方案,均存在選藥不當?shù)娘L險。即便是抗結核新藥如貝達喹啉、利奈唑胺和普托馬尼,隨著應用的增多必然帶來耐藥發(fā)生的風險。在WHO推薦的快速檢測診斷技術中,有的技術能迅速檢測出利福平耐藥,但由于缺乏對應的技術快速檢測細菌是否對異煙肼耐藥,因此無法快速判斷患者是否患有耐多藥結核病,由此誕生了“利福平耐藥”這一耐藥定義。利福平耐藥的定義屬于權宜之計,反映了對其他藥物快速耐藥診斷能力的不足。據(jù)估計,臨床利福平敏感但異煙肼耐藥的結核病患者數(shù)是利福平耐藥患者數(shù)的2倍,而全球耐多藥/利福平耐藥結核病患者中,氟喹諾酮類藥物耐藥率約為20%,但由于缺乏適宜的快速檢測技術,不能及時發(fā)現(xiàn)這些耐藥患者。因此,對于耐多藥/利福平耐藥結核病患者,不能避免對其仍然采用相應藥物治療[4]。此外,針對耐多藥/利福平耐藥結核病已經(jīng)建立了多種強有力的化療方案,如BPaLM(B:貝達喹啉,Pa:普托馬尼,L:利奈唑胺,M:莫西沙星)方案,其所包含的貝達喹啉和利奈唑胺是該方案中的核心藥物,如果核心藥物發(fā)生耐藥會導致治療失敗,因此,也需要建立針對新型抗結核藥物的耐藥檢測方法。總之,為提高藥物敏感結核病和耐藥結核病的治療成功率,亟待建立能夠實現(xiàn)對抗結核治療方案中所有被包含藥物的耐藥檢測技術。在上述背景下,能夠一次檢測多達幾十個靶標的tNGS技術在耐藥結核病領域的應用受到了高度關注[5]。

三、WHO對tNGS技術臨床應用的主要觀點及對結核病防治工作的指導意義

(一)tNGS 檢測MTB耐藥具有常規(guī)分子檢測技術不具備的優(yōu)勢

tNGS技術可以納入多種藥物的耐藥基因作為檢測靶標,單一的一次檢測即可實現(xiàn)對多達10余種抗結核藥物的藥物敏感性進行判斷,上述藥物既可包括常規(guī)的抗結核藥物,也包括各種新型抗結核藥物;檢測可直接應用于臨床標本,并可在收到標本后當天或幾天內(nèi)報告結果;易于根據(jù)抗結核藥物耐藥機制研究的進展擴展納入耐藥相關的新基因靶標;能夠給出各種基因突變的具體類型,有助于區(qū)分同一基因中不同突變類型導致的不同程度的耐藥[6]。

鑒于tNGS技術在靶基因數(shù)量和突變類型檢測方面強大的優(yōu)勢,且用時較短,因此,該技術具有良好的應用前景。目前關于tNGS技術臨床應用的數(shù)據(jù)還比較少,但已展現(xiàn)出符合預期的表現(xiàn),結果可靠,一次即可獲得10余種藥物的耐藥基因突變情況。未來隨著技術的日臻完善,每例病原學陽性的結核病患者都可以在就醫(yī)后的短時間內(nèi)獲得可用抗結核藥物完整的耐藥譜,指導針對個體的精準化療方案的制定,將會對提高結核病治愈率有立竿見影的效果,并由此縮短患者排菌時間,減少疾病傳播。

(二)tNGS技術檢測MTB耐藥性具有良好的可靠性

薈萃分析顯示,tNGS檢測呼吸道標本診斷耐藥結核病具有很高的敏感度和特異度。在病原學確診的肺結核患者中,tNGS檢測利福平、異煙肼、莫西沙星及乙胺丁醇耐藥性的合并敏感度均≥95%,檢測左氧氟沙星和吡嗪酰胺耐藥性的合并敏感度分別為94%和88%,而tNGS檢測耐藥性的特異度在所有藥物中均≥96%。在病原學確診的利福平耐藥結核病患者中,tNGS檢測異煙肼、左氧氟沙星、莫西沙星、吡嗪酰胺及乙胺丁醇耐藥的合并敏感度均≥95%,而對貝達喹啉(68%)、利奈唑胺(69%)、氯法齊明(70%)、阿米卡星(87%)和吡嗪酰胺(90%)耐藥檢測的敏感度偏低,但準確性仍在可接受范圍內(nèi);除鏈霉素(75%)以外,tNGS檢測其他所有抗結核藥物耐藥性的特異度均≥95%。

對于大多數(shù)常用抗結核藥物,tNGS技術檢測耐藥的敏感度和特異度不低于現(xiàn)有的已被廣泛認可的表型藥物敏感性試驗(簡稱“表型藥敏試驗”)或耐藥分子檢測技術,表明其已滿足了臨床應用的性能要求。一些相對較新的抗結核藥物的耐藥檢測的敏感度雖不十分理想,但特異度很高,因此,對于這些藥物tNGS技術診斷耐藥的可靠性很好,但會出現(xiàn)耐藥患者漏檢。一些藥物耐藥檢測的性能指標較低,一方面可能是作為對照方法的表型藥敏試驗自身在可重復性和準確性方面存在不足,以乙胺丁醇和吡嗪酰胺最為突出[7]。另一方面,一些新型抗結核藥物還未能建立公認可靠的表型藥敏試驗方法[8],也缺乏對耐藥機制的全面了解,導致耐藥相關基因的發(fā)現(xiàn)不足,如利奈唑胺、貝達喹啉、氯法齊明等,由此造成很多體外藥敏試驗顯示耐藥程度較高的菌株并未發(fā)現(xiàn)存在已知耐藥基因的突變[9-11]。因此,對于上述新藥,其tNGS檢測性能的提高有賴于后續(xù)研究的進展。此外,當臨床標本中MTB載量較低時,容易出現(xiàn)表型藥敏試驗和分子檢測結果不一致的情況。NGS技術可發(fā)現(xiàn)菌群中含量非常低的基因突變,但非常少量的耐藥菌是否會發(fā)展成真正耐藥還有待更多研究證實[12]。

(三)開展tNGS檢測MTB耐藥在某些應用場景下符合成本效益

WHO挑選了3個結核病流行程度不同的國家(包括格魯吉亞、印度和南非)開展tNGS檢測MTB耐藥的成本效益的模型分析。tNGS檢測成本中以試劑和耗材占比最高。格魯吉亞作為一個高耐多藥/利福平耐藥結核病負擔國家,如果將tNGS作為所有經(jīng)病原學確診結核病患者的初始耐藥檢測的方法,只有在支付意愿(willingness-to-pay,WTP)閾值3倍于該國人均國民生產(chǎn)總值的情況下才符合成本效益。當在上述3個國家所有的利福平耐藥結核病患者中以tNGS技術取代表型藥敏試驗時,在印度無論WTP閾值高低tNGS檢測MTB耐藥均符合成本效益;南非只有在3倍于WTP閾值時才符合成本效益;而在格魯吉亞tNGS檢測MTB耐藥則完全不符合成本效益。當tNGS技術同時檢測多種病原體或結核病患者數(shù)量很多時,更傾向于符合成本效益,如果考慮開展tNGS檢測會使有效治療方案的實施提前,則成本效益會明顯增加。

目前,tNGS還屬于一項價格昂貴的檢測技術,因此,在上述分析中顯示僅特定場景下的應用符合成本效益。正如其他新技術的推廣使用過程一樣,隨著tNGS技術應用的鋪開,越來越多的企業(yè)會參與到tNGS產(chǎn)品研發(fā)與注冊中,檢測產(chǎn)品的性能將不斷優(yōu)化,試劑和耗材的成本也會隨著檢測數(shù)量的大幅增加而逐步降低。因此,未來tNGS技術檢測MTB耐藥將越來越符合成本效益,并能夠適用于更多的應用場景。此外,在WHO的上述分析中,并未將tNGS檢測縮短耐藥診斷延誤、減少抗耐藥結核病治療啟動的延遲納入分析,因此,tNGS檢測實際的成本效益應該會更好。

(四)技術人員對tNGS檢測MTB耐藥的技術接受程度高

WHO委托相關人員對直接操作tNGS的檢驗技術人員和管理人員及結核病診療領域的國際專家進行了訪談(共17位受訪者),對tNGS操作的接受程度進行了定量分析,發(fā)現(xiàn)受訪人員對tNGS技術接受度高,并非?？春眉夹g的應用前景,普遍認為其是MTB耐藥檢測領域的一個“重大的進步”。受訪人員認可的tNGS優(yōu)點包括能直接應用于臨床標本、同時對多種藥物進行耐藥檢測、時間快速(3～5 d),但存在技術操作復雜、需要專用設施和設備、對操作人員要求高等缺點。此外,受訪人員還認可,設備安裝、人員培訓、可靠的物流、高效準確的數(shù)據(jù)管理、數(shù)據(jù)存儲,以及穩(wěn)定的網(wǎng)絡連接等將會對技術推廣帶來挑戰(zhàn),因此,認為tNGS技術目前更適于在中心實驗室/中心檢驗機構開展。

目前,tNGS技術的優(yōu)點和缺點都非常鮮明,但由于其優(yōu)點非常突出,一定程度上使其缺點也能夠被技術人員所接受。應該看到,技術現(xiàn)有的缺點正是未來tNGS技術優(yōu)化的研究方向。體外診斷技術的發(fā)展方向是床旁檢測技術,即現(xiàn)場快速檢驗(point-of-care testing,POCT),提高tNGS技術操作的全自動化程度,增加數(shù)據(jù)分析的簡便性,不斷降低設備和試劑耗材的價格,減少對設施的要求,將是tNGS真正走向臨床應用,甚至未來替代傳統(tǒng)藥敏試驗和分子檢測的必經(jīng)之路。

(五)目前符合WHO診斷性能標準的tNGS產(chǎn)品及其覆蓋的藥物

薈萃分析主要關注了不同廠家tNGS產(chǎn)品相關的已發(fā)表或尚未發(fā)表的數(shù)據(jù),并由此確定了符合WHO對結核病耐藥分子檢測要求的產(chǎn)品清單:

1.Deeplex?Myc-TB(法國GenoScreen公司):適合開展利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氟喹諾酮類藥物、貝達喹啉、利奈唑胺、氯法齊明、阿米卡星及鏈霉素的耐藥檢測。

2.NanoTB?(英國Oxford Nanopore Technolo-gies 公司):適合開展利福平、異煙肼、氟喹諾酮類藥物、利奈唑胺、阿米卡星及鏈霉素的耐藥檢測。

3.TBseq?(杭州圣庭醫(yī)療科技有限公司):適合開展乙胺丁醇耐藥檢測。

上述推薦僅參考了已公開發(fā)表的數(shù)據(jù)或是能夠獲得的相關數(shù)據(jù),在此基礎上形成了對特定產(chǎn)品的推薦,對未納入數(shù)據(jù)進行分析的產(chǎn)品無法客觀評判。我國在MTB耐藥檢測tNGS技術研發(fā)方面處于世界的前沿,多家公司的產(chǎn)品已通過第三方實驗室的方式應用于臨床,為臨床診療提供了重要參考依據(jù)。目前國內(nèi)的tNGS產(chǎn)品正處于不斷提高檢測性能和自動化水平,降低成本,增加檢測靶標的產(chǎn)品完善階段,相信未來在此領域國產(chǎn)產(chǎn)品也能夠大放異彩。

四、結語

現(xiàn)有證據(jù)支持對確診的結核病患者采用tNGS技術進行快速診斷耐藥,以為結核病治療方案的制定提供更全面的耐藥譜,提高化療方案制定的精準性。然而,目前tNGS技術還不能完全取代現(xiàn)有耐藥分子檢測技術,尤其是一些快速、簡易、經(jīng)濟的分子檢測技術,如WHO推薦的快檢診斷技術,目前仍然具備良好的臨床應用價值。tNGS技術能在短時間內(nèi)獲得多種藥物敏感性信息的強大優(yōu)勢,決定了其將成為未來MTB耐藥分子診斷產(chǎn)品研發(fā)的重要方向,而其可靠性和實用性的提高取決于MTB對抗結核藥物耐藥機制研究的不斷進步,以及產(chǎn)品檢測性能的不斷優(yōu)化。

利益沖突作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻黃海榮:醞釀和設計實驗、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱