山柰酚對(duì)溴氰菊酯誘導(dǎo)鹵蟲(chóng)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用

馬丹丹，隋麗英，周慶禮，郭慶彬，潘娜敏，李貞景

(1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457)

我國(guó)是世界上從事水產(chǎn)養(yǎng)殖歷史最悠久的國(guó)家之一。近年來(lái)，隨著越來(lái)越多的消費(fèi)者對(duì)海鮮等水產(chǎn)制品的喜愛(ài)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，已經(jīng)成為我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要產(chǎn)業(yè)之一。然而，目前水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病率和死亡率不斷升高，導(dǎo)致水產(chǎn)品質(zhì)量下降，影響水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。2020 年安徽省水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物因疫病死亡而帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失約為4.18 億元人民幣，動(dòng)物平均發(fā)病率為 7.59% ，平均死亡率為4.85%[1]。隨著農(nóng)藥施用量的增加，生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)多次從水生動(dòng)物養(yǎng)殖水體中檢測(cè)到農(nóng)藥殘留，樣品中農(nóng)藥檢出率高達(dá) 55.36% ，其中溴氰菊酯(deltamethrin，DEL)的檢出率為14.41%[2]。溴氰菊酯的化學(xué)式為C22H19Br2NO3，是一種Ⅱ型擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑，被廣泛用于農(nóng)作物等生物靶向防蟲(chóng)除害和水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物寄生蟲(chóng)防治[3-4]。然而，隨著溴氰菊酯的廣泛使用，該物質(zhì)很可能通過(guò)地表徑流和生活廢水流入河流和湖泊。在珠江河口、福建近海和渤海灣近海沉積物中檢測(cè)到DEL 的殘留濃度為10～100 μg/L，已超過(guò)歐盟推薦標(biāo)準(zhǔn)[5]。溴氰菊酯疏水性較強(qiáng)，且在水生生物體內(nèi)的代謝和排泄能力較弱，極易導(dǎo)致水生動(dòng)物中毒死亡[6]。目前，溴氰菊酯的生態(tài)毒性已經(jīng)在魚(yú)、蝦、蟹等不同種類(lèi)的水生動(dòng)物身上得到了研究，溴氰菊酯暴露能顯著引起中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis) 、斑 馬 魚(yú)(Danio rerio) 、尼 羅 羅 非 魚(yú)(Oreochromis niloticus)等水生生物產(chǎn)生組織損傷、代謝紊亂、免疫毒性和細(xì)胞凋亡[7]，導(dǎo)致生物體內(nèi)丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)水平顯著升高，以及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和過(guò)氧化氫酶(CAT)的活性降低[8-10]?？寡趸瘎┤缃S素、槲皮素和莧籽提取物在小鼠[11]、翠澧(Channa punctata)[12]和烏澧(Channa argus)[13]等動(dòng)物中對(duì)溴氰菊酯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和神經(jīng)毒性具有明顯的改善作用。這說(shuō)明抗氧化劑是用于緩解溴氰菊酯誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和不良影響的潛在治療劑。

山柰酚(kaempferol，Ka)是一種天然多酚類(lèi)黃酮，主要以山柰酚苷的形式廣泛存在于西蘭花、茶葉、豆類(lèi)和草莓中[14]，具有抗氧化、抗癌、抗炎和神經(jīng)保護(hù)的作用[15-16]。山柰酚能夠降低油酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞的脂質(zhì)堆積和氧化應(yīng)激[17]。山柰酚通過(guò)調(diào)控Nrf2/HO-1 信號(hào)通路改善由H2O2和百草枯暴露血管損傷小鼠的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[18]。但是，關(guān)于山柰酚對(duì)水生生物氧化應(yīng)激改善作用的研究較少。

水生甲殼類(lèi)動(dòng)物對(duì)溴氰菊酯的毒性也非常敏感[8]。鹵蟲(chóng)是一種小型、低等的甲殼動(dòng)物，廣泛分布于鹽田和咸水湖泊，是水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物苗種的重要開(kāi)口餌料[19]。鹵蟲(chóng)因其生命周期短、后代產(chǎn)量大、對(duì)污染物高度敏感等特點(diǎn)，成為水生生態(tài)毒理學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[20]。本研究以鹵蟲(chóng)為研究對(duì)象，評(píng)估山柰酚對(duì)溴氰菊酯誘導(dǎo)鹵蟲(chóng)抗氧化能力的影響，旨在進(jìn)一步為黃酮類(lèi)化合物減輕水生動(dòng)物氧化損傷提供直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及有效的干預(yù)措施。同時(shí)，將Ka 作為餌料添加劑投喂水生動(dòng)物也會(huì)降低養(yǎng)殖成本，提高水產(chǎn)行業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益，具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 鹵蟲(chóng)孵化與養(yǎng)殖條件

本實(shí)驗(yàn)所用的孤雌生殖鹵蟲(chóng)由天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院亞洲區(qū)域鹵蟲(chóng)參考中心提供。

鹵蟲(chóng)的孵化條件：溫度28 ℃，鹽度30 g/L，光照強(qiáng)度 2 000 lx，連續(xù)充氣[21]。孵化24 h 后收集鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體，轉(zhuǎn)移至水族箱中進(jìn)行培養(yǎng)，鹽度30 g/L，保持密度為1 個(gè)/mL。養(yǎng)殖管放入水箱中，28 ℃恒溫養(yǎng)殖，光/暗周期為 14 h/10 h，每天分別在 9：00 和21：00 投喂Chlorella，每天的總投喂量為105個(gè)/mL，每2 天換1 次水，每隔12 h 及時(shí)補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水。

1.2 試劑與儀器

人造海水(ASW)，鹽度 30 g/L，美國(guó) Instant Ocean 公司；MDA、SOD、CAT、GSH-Px 試劑盒，南京建成生物工程研究所；總 RNA 提取試劑盒、PrimeScriptTMRT 試劑盒，日本Takara 公司。

SZ61型立體顯微鏡，Olympus 公司；SZX12 型體視顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；FLX800TBI 型熒光酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek 儀器公司；NanoDrop 2000 型微量紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Scientific 公司；

1.3 指標(biāo)分析

1.3.1 溴氰菊酯對(duì)鹵蟲(chóng)的急性毒性實(shí)驗(yàn)

設(shè)定 7 個(gè)梯度組(0、0.001、0.01、0.1、1、5、10 μg/L)進(jìn)行溴氰菊酯暴露實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中停止投喂餌料。每組設(shè)計(jì)3 個(gè)平行，每個(gè)平行為100 只鹵蟲(chóng)無(wú)節(jié)幼體，36 h 后對(duì)各組鹵蟲(chóng)進(jìn)行觀察并記錄鹵蟲(chóng)的存活率，采用Probit 回歸模型計(jì)算溴氰菊酯對(duì)鹵蟲(chóng)的半致死濃度(LC50)。以36 h-LC50為1 個(gè)毒性單位(toxic unit)，記為1 TU。

1.3.2 鹵蟲(chóng)孵化率、體長(zhǎng)和存活率的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照(Control)組、二甲基亞砜(DMSO)組、DEL 組、Ka 組和DEL＋Ka 組，其中選擇0.105 μg/L(0.5 TU)溴氰菊酯和山柰酚(0.01、0.1、0.5、1 mg/mL)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Control 組鹵蟲(chóng)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，各處理組鹵蟲(chóng)分別加入DEL 或Ka 配制培養(yǎng)液，其他培養(yǎng)條件均與Control 組一致。

鹵蟲(chóng)孵化率的測(cè)定：1.60 g 孤雌生殖鹵蟲(chóng)卵置于含有1 L 孵化液(人造海水)的錐形孵化管中孵化。孵育24 h 后，用50 μL 移液槍分6 次隨機(jī)取樣，置于24孔板內(nèi)，通過(guò)SZ61 型立體顯微鏡在計(jì)數(shù)室中記錄不同處理組中樣品的無(wú)節(jié)幼體、傘狀幼體和未孵化卵的數(shù)量，每個(gè)處理組設(shè)置3 個(gè)平行。孵化率(H)按式(1)計(jì)算。

式中：n1、n2、n3分別為無(wú)節(jié)幼體、傘狀幼體和未孵化卵的數(shù)量。

鹵蟲(chóng)生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)：將同一時(shí)間孵化的、大小均勻的Ⅰ期無(wú)節(jié)幼體轉(zhuǎn)移到1 L 孵化管中培養(yǎng)，養(yǎng)殖密度為1 個(gè)/mL。在16 d 的培養(yǎng)過(guò)程中，每2 d 從孵化管中分3 次隨機(jī)取出150 mL 培養(yǎng)液，統(tǒng)計(jì)各組取樣液中鹵蟲(chóng)的存活率。同時(shí)，每2 d 從各處理組中取出15 只鹵蟲(chóng)，用SZX12 型體視顯微鏡及其軟件進(jìn)行圖像采集并測(cè)定其體長(zhǎng)。

1.3.3 鹵蟲(chóng)抗氧化酶活性和脂質(zhì)過(guò)氧化物含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)設(shè)置Control 組、DEL 組、Ka 組和DEL＋Ka 組，其中DEL 質(zhì)量濃度為0.105 μg/L，根據(jù)不同處理組鹵蟲(chóng)個(gè)體水平相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇0.1 mg/mL Ka 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將大小均勻、生長(zhǎng)良好的無(wú)節(jié)幼體鹵蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至200 mL 錐形培養(yǎng)管中，培養(yǎng)液中分別溶解不同濃度的DEL 或Ka，每組約200 只鹵蟲(chóng)，培養(yǎng)至成熟期(約16 d)，每組設(shè)置3 個(gè)平行。從各給藥組中隨機(jī)取出50 只鹵蟲(chóng)，用相同溫度的清水清洗3 次，除去鹵蟲(chóng)表面的鹽漬；收集各處理組的鹵蟲(chóng)置于5 mL 離心管中，用生理鹽水(質(zhì)量體積比1∶9)均質(zhì)。組織勻漿在4 ℃、12 000 g 條件下離心15 min，取上清液。上清液用試劑盒測(cè)定抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)及丙二醛(MDA)的含量。

采用熒光染料2′，7′-二氯乙酸熒光素(DCFHDA)測(cè)定不同處理組鹵蟲(chóng)的ROS 水平。將上清液轉(zhuǎn)移至96 孔板，用10 μmol/L DCFH-DA 在37 ℃黑暗環(huán)境下孵育30 min，利用FLX800TBI 型熒光酶標(biāo)儀測(cè)定不同處理組鹵蟲(chóng)的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)驗(yàn)按照1.3.3 節(jié)的方法處理鹵蟲(chóng)。處理結(jié)束后，隨機(jī)取出10 只鹵蟲(chóng)成體，除去表面的鹽漬，收集在1.5 mL 離心管中，在冰上進(jìn)行RNA 提取。鹵蟲(chóng)總RNA 采用Trizol 法提取，采用NanoDrop 2000 型微量紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的RNA 進(jìn)行定量和定性測(cè)定。僅采用高質(zhì)量RNA(A260/A280范圍為1.8～2.2，RIN 8.0)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析。使用PrimeScriptTMRT 試劑盒進(jìn)行cDNA 合成。以β-actin基因?yàn)楣芗一騕22]，利用實(shí)時(shí)熒光定量引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物(表1)。采用SYBR Green 法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR。將20 μL(0.8 μL正向引物、0.8 μL 反向引物、10 μL 2×TB Green Premic Ex TaqⅡ、2.4 μL cDNA 和6.0 μL RNase-free water)反應(yīng)物混合，95 ℃擴(kuò)增30 s，95 ℃ 5 s，退火30 s，循環(huán)40 次，72 ℃擴(kuò)增30 s，每組樣品進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)。靶基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 引物Tab.1 Primers

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Excel 和GraphPad Prism 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄、統(tǒng)計(jì)分析并作圖。對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s 多重比較分析檢測(cè)顯著性差異，不同字母表示組間具有顯著性差異(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溴氰菊酯對(duì)鹵蟲(chóng)的急性毒性

不同質(zhì)量濃度溴氰菊酯脅迫鹵蟲(chóng)的存活率如圖1 所示。溴氰菊酯和鹵蟲(chóng)存活率之間具有良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。溴氰菊酯對(duì)鹵蟲(chóng)的 LC50為0.210 μg/mL，95%可信區(qū)間為0.097～0.401，回歸方程為 y ＝-0.634-0.909 x，R2＝0.983。按照 GB/T 15670—2017《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》農(nóng)藥毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，溴氰菊酯的安全質(zhì)量濃度為0.001 2 μg/L，因此溴氰菊酯對(duì)于鹵蟲(chóng)屬于劇毒性污染物。

圖1 不同質(zhì)量濃度溴氰菊酯脅迫鹵蟲(chóng)的存活率Fig.1 Survival rates of Artemia when exposed to different concentrations of deltamethrin for 36 h

2.2 山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)孵化率、存活率和體長(zhǎng)的影響

溴氰菊酯和不同濃度的山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)孵化率的影響如圖2 所示。DMSO 組鹵蟲(chóng)孵化率與Control 組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。DEL 組鹵蟲(chóng)的孵化率和Control 組相比顯著下降(P＜0.05)。在溴氰菊酯暴露鹵蟲(chóng)培養(yǎng)液中加入不同質(zhì)量濃度Ka 后，和DEL 組相比，DEL＋0.01 Ka 組、DEL＋0.1 Ka 組和DEL＋0.5 Ka 組鹵蟲(chóng)的孵化率顯著提高(P＜0.05)，DEL＋1 Ka 組鹵蟲(chóng)孵化率顯著下降(P＜0.05)。當(dāng)不同質(zhì)量濃度Ka 單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，和Control 組相比，0.01 Ka 組鹵蟲(chóng)孵化率顯著下降(P＜0.05)，0.1 Ka 組和0.5 Ka組鹵蟲(chóng)的孵化率沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，1 Ka 組鹵蟲(chóng)的孵化率顯著下降(P＜0.05)。

圖2 溴氰菊酯和不同質(zhì)量濃度的山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)孵化率的影響Fig.2 Hatching percentage of Artemia when exposed to DEL and different concentrations of Ka

溴氰菊酯和不同質(zhì)量濃度的山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)存活率和體長(zhǎng)的影響如圖3 所示。由圖3(a)可知：DMSO組鹵蟲(chóng)存活率與Control 組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。在溴氰菊酯誘導(dǎo)鹵蟲(chóng)的1～5 d，各處理組鹵蟲(chóng)的存活率和Control 組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，DEL 組鹵蟲(chóng)的存活率顯著低于Control 組(P＜0.05)。在DEL 處理鹵蟲(chóng)的培養(yǎng)液中同時(shí)加入不同濃度Ka，與DEL 組相比，DEL＋0.01 Ka 組存活率沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，DEL＋0.1 Ka 組和DEL＋0.5 Ka 組存活率顯著提高(P＜0.05)，DEL＋1 Ka 組存活率顯著降低(P＜0.05)，但以上處理組和Control組相比，存活率顯著降低(P＜0.05)。在鹵蟲(chóng)的培養(yǎng)液中單獨(dú)加入Ka 時(shí)，Ka 對(duì)鹵蟲(chóng)的存活率也有顯著的影響。與Control 組相比，0.01 Ka 組存活率沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，0.1 Ka 組和0.5 Ka 組存活率顯著提高(P＜0.05)，1 Ka 組存活率顯著降低(P＜0.05)。通過(guò)整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期的存活率測(cè)定，溴氰菊酯和山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)存活率的影響主要體現(xiàn)在鹵蟲(chóng)的成體期。

圖3 溴氰菊酯和不同質(zhì)量濃度的山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)存活率和體長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of DEL and different concentrations of Ka on the survival rate and body length of Artemia

由圖3(b)可知：DMSO 組鹵蟲(chóng)體長(zhǎng)與Control 組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。溴氰菊酯在給藥第4 天開(kāi)始對(duì)鹵蟲(chóng)生長(zhǎng)具有抑制作用。同時(shí)給藥DEL 和不同質(zhì)量濃度Ka 后，DEL＋0.01 Ka 組、DEL＋0.5 Ka 組、DEL＋1 Ka 組與DEL 組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，DEL＋0.1 Ka 組鹵蟲(chóng)體長(zhǎng)在第10 天開(kāi)始顯著提高(P＜0.05)，但仍低于Control 組。鹵蟲(chóng)單獨(dú)給藥Ka時(shí)，與Control 組相比，0.01 Ka 組和0.5 Ka 組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，1 Ka 組顯著降低(P＜0.05)，0.1 Ka組顯著提高(P＜0.05)。山柰酚的改善作用主要從第10 天開(kāi)始體現(xiàn)。

2.3 山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)抗氧化酶及脂質(zhì)過(guò)氧化物含量的影響

溴氰菊酯和山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA 含量的影響如圖4 所示。

圖4 溴氰菊酯和山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA含量的影響Fig.4 Effects of DEL and Ka on the SOD，CAT，GSH-Px enzyme activities and MDA contents in Artemia

與Control 組相比，溴氰菊酯能夠顯著降低鹵蟲(chóng)體內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px 活性，MDA 含量顯著上升(P＜0.05)。當(dāng)單獨(dú)加入0.1 mg/mL 山柰酚時(shí)，鹵蟲(chóng)的SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA 含量與Control 組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。在溴氰菊酯暴露鹵蟲(chóng)的培養(yǎng)液中加入0.1 mg/mL 山柰酚后，鹵蟲(chóng)的CAT 和GSH-Px 活性和DEL 組相比顯著提高(P＜0.05)，但仍低于Control 組；MDA 含量下降，但沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)；鹵蟲(chóng)的SOD 活性和Control 組相比沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。

2.4 山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)ROS含量的影響

溴氰菊酯暴露和山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)ROS 水平的影響如圖5 所示。與Control 組相比，DEL 組ROS 水平顯著增加(P＜0.05)。與DEL 組相比，Ka 組和DEL＋Ka 組鹵蟲(chóng)的ROS 水平顯著下降(P＜0.05)，但與Control 組沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。

圖5 溴氰菊酯和山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)ROS水平的影響Fig.5 Effect of DEL and Ka on ROS production in Artemia

2.5 山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)Nrf2 信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響

溴氰菊酯和山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)Nrf2 信號(hào)通路中相關(guān)基因的影響如圖6 所示。

圖6 溴氰菊酯和山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)Nrf2 信號(hào)通路關(guān)鍵基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of DEL and Ka on the expression of key genes in the Nrf2 signaling pathway of Artemia

與Control 組相比，DEL 組中基因SOD、GST、NOQ1 和HO-1 的表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)，基因CAT 和Nrf2 表達(dá)量下降，但沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，基因Keap1 的表達(dá)量顯著上升(P＜0.05)。Ka組鹵蟲(chóng)中基因SOD、CAT、GST、Keap1、NOQ1 和HO-1 的表達(dá)量和Control 組均沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，Nrf2 的表達(dá)量高于Control 組(P＜0.05)。與DEL 組相比，DEL＋Ka 組鹵蟲(chóng)中基因CAT、GST、Nrf2、NOQ1 和HO-1 顯著上升(P＜0.05)，但基因SOD 表達(dá)量沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，基因Keap1 表達(dá)量顯著下降(P＜0.05)。

3 討 論

甲殼類(lèi)動(dòng)物是對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯化合物最敏感的物種群[23]。將甲殼類(lèi)動(dòng)物草蝦(Palaemonetes pugio)作為毒性測(cè)試物種進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，5 種擬除蟲(chóng)菊酯均具有不同程度的毒性作用。其中，溴氰菊酯是毒性最大的化合物，在4 ng/L 時(shí)造成約20%的草蝦死亡，在11 ng/L 時(shí)導(dǎo)致約100%的草蝦死亡[23]。鹵蟲(chóng)是海水魚(yú)、蝦、蟹育苗的重要生物餌料，同時(shí)也是毒理學(xué)優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在本研究中，首先采用急性毒性實(shí)驗(yàn)觀察鹵蟲(chóng)暴露溴氰菊酯36 h 后的毒性反應(yīng)，計(jì)算LC50并進(jìn)行毒性分級(jí)。研究結(jié)果顯示溴氰菊酯對(duì)鹵蟲(chóng)36 h 的LC50為0.210 μg/L，按照GB/T 15670—2017《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》農(nóng)藥毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，判定溴氰菊酯為劇毒性農(nóng)藥。卵的孵化和生長(zhǎng)是評(píng)估鹵蟲(chóng)發(fā)育狀況最直接的指標(biāo)。與Control 組相比，溴氰菊酯暴露的鹵蟲(chóng)的孵化率、存活率和體長(zhǎng)均顯著降低(P＜0.05)，而0.1、0.5 mg/mL山柰酚能夠顯著提高溴氰菊酯暴露鹵蟲(chóng)的孵化率和存活率，0.1 mg/mL 山柰酚能夠顯著提高鹵蟲(chóng)的體長(zhǎng)(P＜0.05)，這可能是山柰酚發(fā)揮了其抗氧化活性，有效緩解了由溴氰菊酯暴露引起的氧化損傷，從而提高了鹵蟲(chóng)的孵化率和存活率。此外，1 mg/mL 山柰酚會(huì)抑制鹵蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，表明山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)的作用效果呈現(xiàn)高濃度抑制，需要控制山柰酚對(duì)鹵蟲(chóng)的給藥濃度。在溴氰菊酯暴露下給藥一定濃度的山柰酚，鹵蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)和單獨(dú)暴露溴氰菊酯時(shí)相比有一定的緩解作用，但仍然低于Control 組，這表明山柰酚僅能對(duì)鹵蟲(chóng)的生長(zhǎng)起到一定的改善作用，但無(wú)法完全治療氧化損傷的鹵蟲(chóng)。此外，通過(guò)對(duì)鹵蟲(chóng)整個(gè)發(fā)育周期的暴露實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成熟時(shí)期鹵蟲(chóng)對(duì)溴氰菊酯最敏感，并且山柰酚的改善作用最為顯著。

在水生動(dòng)物中，ROS 對(duì)正常細(xì)胞功能不可或缺，并在細(xì)胞防御過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，過(guò)量的ROS 會(huì)導(dǎo)致組織或細(xì)胞的氧化損傷[24]。為防止過(guò)多ROS 對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮了作用。SOD 將超氧陰離子(·O2-)和H+代謝為O2和H2O2，隨后通過(guò)CAT 和GSH-Px 轉(zhuǎn)化為H2O[25]。因此，這些抗氧化酶常被用作生態(tài)毒理學(xué)研究中的生物標(biāo)志物，評(píng)估一些污染物對(duì)甲殼類(lèi)動(dòng)物的亞致死影響[13,26]。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，其含量反映了脂質(zhì)過(guò)氧化程度[27]。在本研究中，溴氰菊酯暴露于成體鹵蟲(chóng)之后，鹵蟲(chóng)的SOD、CAT 和GSH-Px 活性受到抑制，MDA 含量和ROS 水平顯著上升，這些抗氧化酶活性的降低可能是過(guò)量ROS 產(chǎn)生造成相應(yīng)蛋白的損傷所致，這說(shuō)明溴氰菊酯能夠引起鹵蟲(chóng)嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)。單獨(dú)加入山柰酚之后，鹵蟲(chóng)的酶活性與Control 組相比沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。然而，在溴氰菊酯暴露鹵蟲(chóng)的培養(yǎng)液中加入0.1 mg/mL 山柰酚，和DEL 組相比，加入山柰酚0.1 mg/mL 組鹵蟲(chóng)的SOD、CAT 和GSH-Px 活性顯著上升，MDA 含量和ROS 水平下降，山柰酚可能增強(qiáng)了應(yīng)激狀態(tài)下鹵蟲(chóng)的抗氧化能力，并消除鹵蟲(chóng)氧化應(yīng)激期間產(chǎn)生的過(guò)量ROS 。研究[28]發(fā)現(xiàn)，DEL 暴露導(dǎo)致虹鱒魚(yú)(Oncorhynchus mykiss)體內(nèi)SOD、CAT 和GST 活性持續(xù)降低。相反，山柰酚能夠顯著提高鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠的抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化物含量[29]，這與本研究結(jié)果一致。

Keap1/Nrf2/ARE 信號(hào)通路是水生動(dòng)物抗氧化應(yīng)激最重要的機(jī)制[30]。研究[31]表明，溴氰菊酯暴露使烏澧(Channa argus)的肝臟和腸道中基因SOD、Nrf2、NOQ1 和HO-1 表達(dá)水平降低。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)該通路中的關(guān)鍵基因發(fā)現(xiàn)，溴氰菊酯暴露導(dǎo)致鹵蟲(chóng)體內(nèi)SOD、Nrf2、GST、NQO1、HO-1和CAT 的mRNA 表達(dá)減少，Keap1 的mRNA 表達(dá)增加。在鹵蟲(chóng)的培養(yǎng)液中單獨(dú)加入山柰酚之后，鹵蟲(chóng)的Nrf2 信號(hào)通路中相關(guān)基因的表達(dá)量與Control 組相比沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)。然而，與DEL 組相比，DEL＋Ka 組中SOD、Nrf2、GST、NQO1、HO-1 和CAT 的mRNA 表達(dá)水平上調(diào)，而Keap1 基因的mRNA 表達(dá)水平下調(diào)。當(dāng)溴氰菊酯暴露時(shí)，鹵蟲(chóng)過(guò)量的ROS 暴露導(dǎo)致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間失去平衡。山柰酚能夠激活Keap1/Nrf2/ARE 信號(hào)通路，促使Nrf2 從Keap1 中解離，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，并與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。然后，復(fù)合物與Maf 蛋白結(jié)合形成二聚體后與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合，促進(jìn)抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄。Keap1 是一種負(fù)調(diào)節(jié)Nrf2 活性的胞漿蛋白[32]。研究顯示溴氰菊酯暴露提高了鹵蟲(chóng)基因Keap1 的表達(dá)，山柰酚顯著抑制了溴氰菊酯誘導(dǎo)的Keap1 的高表達(dá)，表明山柰酚緩解溴氰菊酯誘導(dǎo)鹵蟲(chóng)氧化應(yīng)激可能是通過(guò)抑制Keap1 的表達(dá)和激活Nrf2/ARE 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

4 結(jié) 論

溴氰菊酯暴露鹵蟲(chóng)的孵化率、存活率和體長(zhǎng)顯著降低，并誘導(dǎo)鹵蟲(chóng)產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。山柰酚能夠促進(jìn)溴氰菊酯誘導(dǎo)鹵蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)能夠提高鹵蟲(chóng)的抗氧化能力和Nrf2 通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)，對(duì)溴氰菊酯誘導(dǎo)鹵蟲(chóng)的氧化應(yīng)激具有緩解作用。本研究以鹵蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)一步拓寬了山柰酚的應(yīng)用領(lǐng)域，同時(shí)也為農(nóng)藥殘留物對(duì)水生甲殼類(lèi)動(dòng)物的氧化應(yīng)激損傷提供了一種有效的解決方法，有助于水生動(dòng)物的健康發(fā)展。