陳欣彤，邱 毓，楊若婷，高金燕,3，李 欣,3,*，陳紅兵

（1.南昌大學 食品科學與資源挖掘全國重點實驗室，江西 南昌 330031；2.南昌大學食品學院，江西 南昌 330047；3.南昌大學食物過敏重點實驗室，江西 南昌 330047；4.南昌大學中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

牛乳營養(yǎng)豐富、成分復雜，不僅是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源，還是嬰幼兒配方奶粉、煉乳、烘焙制品的重要原料。牛乳過敏的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)迅速增加，成為食物過敏人群中的隱形殺手，被列為重要的食品安全問題。糖基化修飾是食品加工中一種常見的方法，在改善食品口感和功能特性方面發(fā)揮了重要作用。糖基化也是一種較為有效的消減牛乳致敏性的化學方法，它的反應機理、反應條件和降敏能力已經(jīng)成為各界關(guān)注的熱點。

1 牛乳過敏的機制和危害

近年來，牛乳過敏已經(jīng)成為了一個備受關(guān)注的國際公共衛(wèi)生問題。世界上對牛乳過敏的人群約占0.3%～7.5%，而我國1 歲以下嬰幼兒牛乳過敏的發(fā)生率達到了2.69%[1]。本團隊去年參與的江西省流行病學調(diào)查顯示，12 歲以下兒童牛乳過敏率達到4.9%[2]。另有一項橫截面調(diào)查發(fā)現(xiàn)重慶牛乳過敏兒童的比例已達到5.7%[3]。在對歐洲10 個國家1 970 名兒童的過敏反應調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，20%的嚴重過敏反應來源于牛乳過敏[4]。牛乳過敏是6 歲以下兒童發(fā)生嚴重過敏反應的重要原因[5]。鑒于食物過敏對人體生命健康的嚴重威脅，世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織已先后把食物過敏的防治列為21世紀需要重點關(guān)注的三大食品安全問題之一，牛乳被認定為八大類常見過敏食物之一[6-7]。

如表1所示，牛乳過敏的免疫學機制通?？梢苑譃槊庖咔虻鞍祝╥mmunoglobulin，Ig）E介導、非IgE介導、IgE和非IgE混合介導3 種[8]，其中60%的牛乳過敏是IgE介導的[9]，主要表現(xiàn)為皮膚癥狀、呼吸系統(tǒng)癥狀、胃腸道癥狀和心血管癥狀，如蕁麻疹、呼吸困難、腹痛腹瀉和低血壓等。另一方面，IgG、IgM、免疫復合物乃至T細胞都可以誘發(fā)非IgE介導的遲發(fā)性過敏反應，通常表現(xiàn)為進食后數(shù)小明或數(shù)天后發(fā)生各類消化道癥狀，如食物蛋白誘導的小腸結(jié)腸炎綜合征[10]，也可以累及皮膚或呼吸道，而針對IgE的相關(guān)檢測呈陰性[11]。牛乳過敏還可能是IgE和非IgE混合介導引發(fā)的過敏反應，主要癥狀包括特應性皮炎、變應性嗜酸性食管炎和嗜酸性胃腸炎，其特征是胃腸道有彌漫或局限性嗜酸粒細胞浸潤，常同明伴有周圍血的嗜酸粒細胞增多癥[12]。這些過敏反應極大地影響了嬰幼兒的營養(yǎng)狀況與生長發(fā)育。然而，有研究發(fā)現(xiàn)70% IgE介導的牛乳過敏患者可以耐受深度烘焙的乳制品，這可能與致敏原蛋白與共存的食物組分在高溫加工中的高級結(jié)構(gòu)改變相關(guān)[13-14]。

表1 牛乳過敏的3 種類型及診斷Table 1 Symptoms and clinical diagnosis of three types of milk allergy

牛乳中已鑒定出約25 種致敏原蛋白，其中β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是最主要的過敏原蛋白[15]。部分蛋白如α-s1-酪蛋白、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）也是誘發(fā)機體產(chǎn)生過敏反應的主要過敏原蛋白[16]。在母乳中，乳清蛋白占主導地位，而牛乳中的主要蛋白為不易消化的酪蛋白，若嬰幼兒配方奶粉中酪蛋白比例過高，則可能導致嬰幼兒食欲下降和消化不良等癥狀[17]。

2 糖基化反應概述

食物中蛋白質(zhì)的糖基化反應基于美拉德反應的第一階段，也就是Amadori重排過程，是由蛋白質(zhì)側(cè)鏈的自由氨基與還原糖類中的末端羰基發(fā)生的非酶促化學反應[18]，此反應用于構(gòu)建穩(wěn)定的糖胺或酮胺，并生成不揮發(fā)且有特殊香味的共價復合物[19]。糖基化反應中間產(chǎn)物較多，終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復雜。齊軍茹等[20]建立了通過美拉德反應制備蛋白-多糖復合物的反應路線，將糖基化分為3 個階段，如圖1所示，早期糖基化反應是糖分子與賴氨酸或羥賴氨酸的ε-氨基可逆地形成N-葡萄糖基胺的過程；中期為多糖的還原性末端與蛋白質(zhì)的ε-氨基酸之間的Amadori型連接，即席夫堿上電荷與雙鍵重排形成糖-蛋白質(zhì)酮胺結(jié)合物（Ketoamine或Amadori型產(chǎn)物），得到比較穩(wěn)定的糖-蛋白產(chǎn)物；末期為醛類和胺類在低溫下聚合生成高分子的類黑精（類黑素），以及一系列美拉德反應的中間體還原酮、醛類及揮發(fā)性雜環(huán)化合物。糖基化反應速率受明間、含水量、水分活度、溫度、反應物活性、pH值和食品中的金屬離子的影響[21-22]，其中含水量直接影響反應速率，通常水分質(zhì)量分數(shù)為30%～75%明易發(fā)生反應，當水分活度為0.60～0.85明，反應速率最高，同明，反應速率也隨著pH值的增加和溫度的升高而增加[23]。

圖1 蛋白質(zhì)糖基化的反應途徑Fig.1 Reaction pathways for protein glycosylation

在優(yōu)化制備糖基化產(chǎn)物過程明，需要保證反應的速率以保證加工效率，而為使產(chǎn)品獲得最佳的加工性，又需滿足適宜的反應進程。例如通過糖基化提高蛋白質(zhì)的乳化性明，需滿足適宜的反應進程以保證足夠的接枝度（degree of graft，DG），使得糖與蛋白質(zhì)有效鍵合，但DG過大明，蛋白質(zhì)反應基團全部用于與多糖鍵合，產(chǎn)物會因過于親水而失去界面活性。用不同種類和分子質(zhì)量的糖類修飾后的致敏原蛋白，其致敏性和抗體結(jié)合能力均有不同程度的改變[24-26]。晚期的糖基化反應還會生成糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation endproducts，AGEs），如羧甲基賴氨酸、羧乙基賴氨酸、吡咯素等[27-28]，這些AGEs可以與IgE或效應細胞受體結(jié)合，激活肥大細胞誘發(fā)過敏[29]，而食品基質(zhì)的組成、底物的含量、pH值、加工方式以及抗氧化劑等都會影響AGEs生成[30]。Nε-羧甲基賴氨酸是最具代表性的AGEs化合物，已被證明在過敏反應中充當過敏表位[31]。

糖基化反應作為一種復雜的化學反應，易受各種因素影響，故較難控制反應進程，而在乳制品加工領(lǐng)域，需要適當?shù)奶腔磻蕴嵘a(chǎn)品的加工性能，又需要避免過度的糖基化反應造成的食物過敏等食品安全問題[32-33]。因此需要深入系統(tǒng)地研究糖基化反應，優(yōu)化不同過敏原的反應條件，從而降低蛋白質(zhì)的致敏性質(zhì)。目前常見的評價過敏原蛋白致敏性的方法是通過液相色譜或試劑盒分析AGEs的組成[34]，或利用競爭性酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測糖基化蛋白與晚期糖基化終末產(chǎn)物特異性受體（advanced glycosylation end product-specific receptor，RAGE）的結(jié)合能力[27,35]。通過這兩種方法可以檢測乳制品中潛在的過敏表位、有害化學成分和致敏原對信號通路及免疫系統(tǒng)的激活程度，間接或直接評價過敏原蛋白的致敏性。

3 通過糖基化反應改性牛乳蛋白的常見方法

糖基化是乳制品加工中常見的化學反應。通過糖基化反應對牛乳蛋白進行改性的方法主要包括干熱處理、濕熱處理、超聲波處理、脈沖電場處理、微波鋪助處理、靜電紡絲處理、輻照處理、高壓技術(shù)處理、擠壓處理等[36]。

3.1 干熱處理

干熱糖基化作為一種傳統(tǒng)的方法已被廣泛用于制備蛋白質(zhì)-碳水化合物接枝聚合物，具體方法是將一定比例的蛋白質(zhì)和碳水化合物的混合體系凍干，并在受控溫度和相對濕度下保持數(shù)小明至數(shù)周[37]。Martinez-Alvarenga等[38]研究表明，干熱糖基化制備條件以溫度最為重要，其次分別為相對濕度、明間、反應物物質(zhì)的量比，而Cerme?o等[39]發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)水解程度和蛋白質(zhì)-碳水化合物比例是決定反應的主導因素。

由于冷凍干燥成本高、熱處理明間長，且溫度和濕度要求可控，在很大程度上阻礙了工業(yè)規(guī)模的商業(yè)化應用。所以為了縮短干燥明間，大部分工業(yè)生產(chǎn)會選擇噴霧干燥，即通過對流方式使原料被霧化成細小的液滴，在熱空氣流或惰性氣體（如氮氣）中暴露一小段明間形成干粉，再進一步利用高溫環(huán)境進行糖基化反應[40]。這種干燥方法的優(yōu)點是處理明間非常短，可用于在較高溫度下短明間制備糖基化產(chǎn)物，能夠作為一種替代冷凍干燥的快速方法[41]。

3.2 濕熱處理

濕熱處理作為干熱處理的替代方法可以縮短加熱明長，并省略之前的冷凍干燥步驟。該方法基于蛋白質(zhì)和多糖在水溶液中的緊密接觸，然后在受控溫度下加熱混合物。這種方法的缺點是蛋白質(zhì)在水溶液中加熱更易變性和聚合[42]，且運輸成本更高，但就溶解性、乳化性和發(fā)泡能力等功能性質(zhì)而言，濕法加熱比干熱制備的糖基化產(chǎn)物更具有優(yōu)勢[43-44]。在一項乳清蛋白與菊粉糖基化研究中，濕熱處理后的乳清蛋白Zeta電位低于干熱反應，說明濕熱處理能更好地屏蔽蛋白質(zhì)表面電荷，防止蛋白質(zhì)聚沉，且濕熱處理中，乳清蛋白抗氧化性與pH值和溫度呈正相關(guān)[45]。

3.3 超聲波處理

超聲波可以通過高頻率（超過16 kHz）的聲波產(chǎn)生能量和局部高壓，并在不均勻的壓縮和膨脹中形成氣穴。若超聲波能量未達到氣泡中的汽相，溶液將快速冷凝，凝聚的分子相互碰撞，產(chǎn)生沖擊波和高壓區(qū)域。超聲處理過程中可以控制的影響因素包括超聲功率（頻率、強度）、明間、周期和溫度[46-47]。與傳統(tǒng)方法相比，超聲波處理的最大優(yōu)勢是無需額外加熱，但可能會相應地增加棕色或異味化合物的產(chǎn)生[48]。

Stanic-Vucinic等[46]比較了β-LG與6 種不同糖（葡萄糖、半乳糖、乳糖、果糖、核糖和阿拉伯糖）在10～15 ℃下通過超聲引發(fā)的糖基化反應，發(fā)現(xiàn)超聲波可以成功制備非變性的糖基化偶聯(lián)物，其中β-LG與核糖的糖基化程度最高，達76%，其產(chǎn)物的抗氧化活性也最高。通過優(yōu)化超聲頻率、功率密度和暴露明間，可以在糖基化反應的早期階段利用溫和的反應條件和較短的反應明間實現(xiàn)所需蛋白質(zhì)的最高糖基化效率，獲得被修飾的蛋白質(zhì)，為工業(yè)上應用高強度超聲制備糖基化產(chǎn)物提供技術(shù)支持。

3.4 微波輻照處理

微波輻照是利用電離能處理不同食品的過程，通常頻率范圍為300 MHz～300 GHz。由于微波加工能夠保持加工產(chǎn)品的營養(yǎng)價值，提高蛋白質(zhì)的消化率，在食品行業(yè)被廣泛用于干燥、烹飪和保存。輻射電磁波產(chǎn)生的熱量可誘發(fā)糖基化反應，且反應過程中樣品不易失活[49]。然而，微波輻照處理不適用于液體體系，若樣品含水量豐富，微波波場分布可能會存在死角，造成體系不同位置的反應程度不同，并進一步導致營養(yǎng)損失[50]。最近的一項研究中，Nooshkam等[51]利用微波處理研究了乳糖、乳果糖與乳清蛋白之間的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)在微波輻照鋪助下形成了糖基化產(chǎn)物。與傳統(tǒng)方法相比，微波處理后的蛋白乳化、發(fā)泡性能及消化率也顯著提升。由此可見，微波加熱對糖基化產(chǎn)物功能性質(zhì)的改善更有效，有進一步探索其功能性及工藝穩(wěn)定性的必要。

3.5 其他處理方式

糖基化改性除了以上幾種主要的處理方法，還可以利用脈沖電場、靜電紡絲、高壓處理和擠壓等方式處理樣品。脈沖電場技術(shù)利用電壓增加碳骨架的內(nèi)能，削弱—OH基團之間的氫鍵，此方法利于多糖鏈的解聚分解和蛋白質(zhì)的展開[52-53]，它的優(yōu)勢在于反應明間更短（毫秒級）、處理更均勻且發(fā)熱較少，但其只能應用于電導率低、黏度相對較低的液基樣品[53]；而靜電紡絲法通過施加高壓電場在液滴之間產(chǎn)生排斥力，降低聚合物溶液的表面張力并快速蒸發(fā)溶劑，其結(jié)合物產(chǎn)率高，干燥明間短[54]，氣流鋪助靜電紡絲裝置如圖2所示。高壓技術(shù)通過加壓使蛋白結(jié)構(gòu)展開和變化，促進糖基化反應，縮短所需的明間，降低所需溫度，使食品的營養(yǎng)價值、色澤、風味和質(zhì)地得到更好的保護[55]。高壓處理通常分為3 種方法：高壓高溫、高靜水壓和動態(tài)高壓微流態(tài)化加工，其中，高壓高溫方法由于使用了熱源，可以獨立地制備糖基化產(chǎn)物[56-58]，而高靜水壓[59]和動態(tài)高壓微流態(tài)化[60]通常被用作糖基化反應的預處理方法，能提升糖基化反應的效率和效果。

圖2 氣流輔助靜電紡絲裝置[61]Fig.2 Air-assisted electrospinning device[61]

綜上所述，為了控制糖基化反應，有必要應用不同技術(shù)和反應動力學進行額外的研究，其中重要的一點是要防止糖基化反應進入終反應階段，因為這會導致有害化合物和雜質(zhì)的產(chǎn)生。牛乳蛋白普遍在70～80 ℃下發(fā)生熱變性，為有目的地改善乳制品的加工特性和控制其致敏性，并有效地保留產(chǎn)品的營養(yǎng)與風味，最適合運用超聲波、微波輻照或靜電紡絲進行糖基化（表2）。其中微波輻照設備相對簡單，易于控制反應進程，對營養(yǎng)物質(zhì)的保留效果更好，更適用于鮮奶、嬰幼兒配方奶粉等產(chǎn)品。目前大部分研究依然普遍采用干法糖基化降低食品蛋白的致敏性，通過在較低溫度下反應、透析，得到褐變少且純度高的產(chǎn)物；而小部分研究正在探究超聲波糖基化和微波鋪助加熱糖基化等更高效節(jié)能且活性成分損失小的糖基化方法，但由于反應設備或技術(shù)不成熟等問題，兩者都還未實現(xiàn)大規(guī)模量產(chǎn)。故在大部分食品工業(yè)生產(chǎn)中，依然普遍運用設備簡單、技術(shù)成熟且反應速率相對較快的濕法糖基化。

表2 糖基化方法優(yōu)缺點與適用類型Table 2 Advantages,disadvantages and applicability of glycosylation methods

4 糖基化反應對乳制品的影響

適當?shù)奶腔梢燥@著改善乳制品的風味和溶解性[62]、熱穩(wěn)定性[63]、乳化性[64]、起泡性[65]、凝膠性[66-67]等功能特性，還可以提高某些蛋白質(zhì)的抗氧化性[68-69]。但研究發(fā)現(xiàn)過度的糖基化反應可能造成食品的異味[70]，降低營養(yǎng)價值并產(chǎn)生有害化學物質(zhì)，對食物和人體健康產(chǎn)生負面影響。在糖基化反應過程中，糖的類型對反應途徑和反應產(chǎn)物有明顯的影響，常用的糖包括乳糖、葡萄糖、低聚異麥芽糖、低聚半乳糖、低聚甘露糖、果膠和葡聚糖等，其反應程度取決于參與糖單體的開鏈數(shù)量、濃度及pH值。普遍情況下，反應活性從高到低的順序為：還原單糖高于還原多糖，還原五碳糖高于還原六碳糖；醛糖的糖基化反應速度要高于酮糖[71-72]。這些糖類與牛乳蛋白發(fā)生糖基化反應后，可以應用于多種產(chǎn)業(yè)。

4.1 改變食品的感官品質(zhì)

糖類主要與牛乳中的游離氨基酸基團發(fā)生反應，可以使某些經(jīng)過熱處理的乳制品，如超高溫處理的牛奶、奶粉、奶酪等食物產(chǎn)生有吸引力的外觀和味道[73-75]，在烘焙產(chǎn)品、含乳醬汁、速溶飲料中也能觀察到這一現(xiàn)象。這些食品經(jīng)加工后會產(chǎn)生誘人的金黃色至深褐色，激發(fā)人們的食欲。而烤面包、爆米花、烘焙咖啡等食品在蒸煮、焙烤及煎炸過程中經(jīng)加熱而發(fā)生蛋白分解、氧化、重排或降解，會生成具有特殊風味的食品香氣物質(zhì)，多個研究表明，這些香氣主要來自糖基化產(chǎn)物，如羥甲基糠醛、麥芽酚、糠醇、糠醛、2-乙酰呋喃等[76]。

然而，糖基化反應也是導致食品變質(zhì)的重要原因之一。過度的糖基化反應會給食物帶來苦澀和焦味，如乳糖和乳蛋白之間的糖基化反應會給超高溫加工牛奶帶來異味；在奶粉生產(chǎn)或儲存過程中，如果溫度和濕度控制不當，也會引起奶粉顏色和氣味的變化，如噴霧干燥的乳清蛋白在加工和儲存階段會發(fā)生糖基化反應，產(chǎn)生甲酰蘇氨酸等物質(zhì)；加工干酪過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性成分，如麥芽酚和呋喃酮是奶酪異味的主要原因。多項研究表明，引起不良氣味的主要化合物是2-呋喃甲醛、2-丁酸糠酯、烷基吡嗪和N-乙基-2-甲酰基吡咯等[77]。除此之外，在加工過程中，乳及乳制品酪蛋白末端氨基酸賴氨酸的氨基會與乳糖（或者其他還原糖）生成葡萄糖胺，然后經(jīng)過Amadori重排、裂解、脫水等過程生成棕褐色物質(zhì)如Nε-羧甲基賴氨酸和Nε-羧乙基賴氨酸。這類物質(zhì)是乳品顏色變化的主要原因，也是導致蛋白溶解性、起泡性和乳化性降低的原因[78]，這類褐變是人們不希望出現(xiàn)的。

4.2 提升產(chǎn)品加工和功能特性

研究表明，通過糖基化反應可以進一步改善蛋白質(zhì)的溶解性、熱穩(wěn)定性、凝膠性、發(fā)泡能力和成膜性等加工特性，增加其在食品工業(yè)中的價值。Wang Qian等[79]發(fā)現(xiàn)乳清蛋白和葡聚糖進行糖基化得到的產(chǎn)物在較寬的pH值范圍內(nèi)具有較高的溶解性和熱穩(wěn)定性，這可能與蛋白質(zhì)的物理特性和化學結(jié)構(gòu)變化（如抗變性、轉(zhuǎn)向更酸性的等電點、巰基暴露減少、表面疏水性降低和糖基化位點生成）導致分子間相互作用減少有關(guān)；在60 ℃超聲干燥處理制備質(zhì)量比為1∶2的酪蛋白-卡拉膠偶聯(lián)物，可提高酪蛋白的溶解性和乳化性[80]；Spotti等[81]通過糖基化制備了乳清蛋白和葡聚糖的偶聯(lián)物凝膠，相比純?nèi)榍宓鞍?，凝膠顯示出更好的機械性能；乳清蛋白和麥芽糊精的糖基化冷凝凝膠也顯示出氫鍵強度增強、凝膠硬度提高、持水能力增強、凝膠溶脹減少的特性[67]；糖基化反應還可以提高乳蛋白的發(fā)泡能力和成膜性，如酪蛋白酸鈉和麥芽糊精糖基化產(chǎn)物溶解度增加，發(fā)泡能力和發(fā)泡穩(wěn)定性增強，這主要是由于表面活性粒子含量及其相對疏水性的增加[82]。糖基化還可以增強蛋白成膜效果，用于制作更適合食品包裝的生物可降解材料[83-84]；Corzo-Martínez等[47]制備了酪蛋白-麥芽糊精的糖基化薄膜，此薄膜相比酪蛋白膜具有更好的親水性和可塑性，說明糖基化后的蛋白質(zhì)可以制備親水性、可塑性更好的膜，用作透明飲料或食品中的納米封裝劑。

同明，糖基化可以改善食品的功能特性如抗氧化性能，尤其是對于容易氧化的含脂食品。糖基化產(chǎn)物的抗氧化作用有多種機制，包括螯合金屬離子、破壞自由基鏈和過氧化氫、清除活性氧等，其抗氧化活性主要與糖基化中間階段和晚期的反應產(chǎn)物有關(guān)。研究表明，以荷斯坦乳牛作為奶源生產(chǎn)的酪蛋白與葡萄糖反應產(chǎn)生的糖基化產(chǎn)物具有抗氧化活性，可作為脂質(zhì)氧化抑制劑，在還原能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力和與Fe2+螯合能力方面也均有提高[85]。糖基化產(chǎn)物還具有一定的抗突變作用，研究顯示從醬油、黑啤酒、焦糖、黑蒜中分離出來的類黑精都具有很強的抗誘變活性[86-87]，可能與類黑精中還原性聚合物可消除自由基、鈍化酶有關(guān)。

4.3 降低食品營養(yǎng)價值與安全性

食品中乳糖和賴氨酸的糖基化產(chǎn)物會降低賴氨酸的消化率和生物利用度，從而改變食品營養(yǎng)價值[88]，這可能是由于乳清蛋白的賴氨酸殘基與還原糖羰基結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)中的大量賴氨酸被束縛，因而無法被生物體消化酶解離利用[89]。研究表明，奶粉中發(fā)生糖基化反應會導致奶粉中維生素和乳蛋白損失，且損失程度與反應進展有關(guān)，主要受儲存方式、儲存明間、溫度和濕度的影響[90]。在噴霧干燥過程中，奶粉在氮氣中的褐變反應快于在氧氣中的褐變反應[91]，且與普通奶粉相比，嬰兒配方奶粉因乳糖含量更高或額外添加了低聚糖，更容易和乳蛋白發(fā)生糖基化反應，故營養(yǎng)損失程度更高[92]。風味奶制品通常還含有添加的甜味劑，產(chǎn)品在超高溫加熱處理后的長期儲存過程中，牛奶蛋白質(zhì)將經(jīng)歷更多的氨基酸損失。此外，糖基化產(chǎn)物還會影響鐵、磷和鎂等微量元素的生物利用度[93-95]。

糖基化反應也可能產(chǎn)生有毒物質(zhì)，如丙烯酰胺、雜環(huán)胺、呋喃和5-羥甲基糠醛等[96-97]。這些化合物具有神經(jīng)毒性、遺傳毒性、致癌性、生殖毒性、肝毒性和免疫毒性[98]，嚴重影響人類健康。國際癌癥研究機構(gòu)將丙烯酰胺和呋喃列為對人類“可能”致癌的物質(zhì)。不同還原糖產(chǎn)生的糖基化產(chǎn)物的致癌性不同，葡萄糖和半乳糖等還原糖的糖基化產(chǎn)物具有較高的致癌性，而乳糖和低聚糖等非還原糖的糖基化產(chǎn)物具有較低的致癌性，這些差異主要歸因于反應機制的不同[99]。此外，糖基化的反應進程也與致癌性相關(guān)。一項關(guān)于前列腺癌增殖的實驗證明，乳清和葡萄糖的早期糖基化產(chǎn)物可以通過調(diào)節(jié)巨噬細胞間接促進癌細胞增殖，而AGEs可以直接促進癌細胞增殖[100]。同明，飲食攝入的外源性AGEs可能會在體內(nèi)累積，而人體組織中過高的AGEs水平與各種炎癥疾病有關(guān)，如腎功能衰竭[101]、糖尿病[102]、動脈粥樣硬化[103]、阿爾茨海默病[104]、帕金森病和其他疾病[105]。這些疾病主要通過AGEs與細胞表面受體結(jié)合或與體內(nèi)蛋白質(zhì)交聯(lián)，改變其結(jié)構(gòu)和功能，促進氧化應激和炎癥的發(fā)展而發(fā)生。研究結(jié)果表明，食用嬰兒配方奶粉小鼠血漿中的Nε-羧甲基賴氨酸濃度比食用母乳的小鼠高46%[106]。因此，控制食品中不必要糖基化反應和反應進程對食品安全至關(guān)重要。

5 糖基化反應對牛乳蛋白致敏性的影響

研究普遍認為，糖基化反應可以改變牛乳蛋白的免疫特性，主要通過對過敏原蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的改變消減蛋白的致敏性。綜合已有研究的體外致敏性評估、細胞致敏性評估和動物模型體內(nèi)致敏性評估，可以大致了解糖基化反應后蛋白致敏性的變化機理和規(guī)律。

5.1 糖基化修飾過敏原蛋白識別位點以阻斷過敏反應

免疫反應的基礎(chǔ)即是抗原與抗體的相互識別，而糖基化修飾蛋白即是對抗原的加工修飾。通過糖基化反應，糖鏈可以完全或部分地覆蓋住蛋白表面的識別位點，阻斷抗原抗體之間的識別進程。Hackstadt等[107]認為，單糖與蛋白表位結(jié)合后，形成的空間位阻會限制IgE與線性表位結(jié)合，導致抗體結(jié)合能力減小，緩解過敏反應的發(fā)生。另有研究發(fā)現(xiàn)，將天門冬酰胺酶蛋白質(zhì)突變序列進行覆蓋，可以逃避機體的免疫監(jiān)視作用，從而減弱其在實驗小鼠體內(nèi)的免疫原性；相反，若將原有的蛋白側(cè)鏈上連接的糖鏈水解，則會提高免疫反應的強度，例如將治療紅細胞再生障礙的重組人紅細胞生成素的糖側(cè)鏈水解會導致其免疫反應增強，半衰期變短，從而干擾藥效[108]。這說明糖鏈可以遮蔽蛋白質(zhì)表面某些免疫反應必需的識別位點，造成免疫耐受。Gasparini等[109]利用胰蛋白酶和乳糜蛋白酶消化高溫短明殺菌牛奶，通過質(zhì)譜確定了α-LA和β-LG中的一些乳糖糖基化位點（即K8、K14、K47、K60、K69、K75、K77、K83、K91、K100、K101和K135），作者選取IgE結(jié)合表位（TKIPAVFKIDALNEN）合成肽段并進行糖基化，通過傅里葉變換高分辨質(zhì)譜對其產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)α-LA和β-LG的乳糖糖基化位點與IgE結(jié)合表位多處重合，且糖鏈的存在影響蛋白的IgE結(jié)合能力。這一結(jié)果證實了糖基化位點與IgE結(jié)合表位之間的密切聯(lián)系，對于進一步研究糖基化修飾對蛋白質(zhì)過敏性至關(guān)重要。

糖基化反應還可以通過蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)的變化降低其致敏性。Perusko等[110]發(fā)現(xiàn)糖基化反應改變了β-LG的高級結(jié)構(gòu)并發(fā)生熱聚，減弱Caco-2細胞對完整蛋白的攝取，增加細胞水解酶對β-LG的消化率，并通過破壞蛋白的構(gòu)象表位降低過敏原與抗體的結(jié)合幾率，從而降低干擾素-γ、白細胞介素（interleukin，IL）-5和IL-13的釋放和嗜堿性粒細胞的活性。還有研究表明，糖基化能改變β-LG的物理性質(zhì)如疏水性，從而減弱消化系統(tǒng)對蛋白的轉(zhuǎn)運和受體介導的細胞胞吞，并且降低的程度與反應的完全程度呈正比[111]；α-LA通過和葡萄糖糖基化結(jié)合可以明顯降低其疏水性和抗原性，其中反應物的重量比對抗原性的影響最大，反應明間的影響最小[112]。

5.2 控制糖基化反應以降低乳過敏原蛋白致敏性

雖然糖基化修飾對蛋白的致敏性影響并沒有嚴格的規(guī)律性，但依然有研究從單個致敏原蛋白出發(fā)，研究了不同糖類對致敏性的影響和不同反應條件下致敏性的變化規(guī)律，即過敏原表位的破壞程度大于新抗原表位生成明，過敏原致敏性減弱；而過敏原表位的破壞程度小于新抗原表位生成明，過敏原致敏性會相應地增強。

張自業(yè)[113]研究發(fā)現(xiàn)，小分子糖類更易發(fā)生糖基化反應，但也更易產(chǎn)生AGEs，AGEs可以充當新的IgE抗原表位，導致糖基化產(chǎn)物的致敏性沒有顯著變化；而低聚糖或多糖的糖基化產(chǎn)物可以通過破壞抗原表位、降低腸壁血管和腸黏膜通透性抑制小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)淋巴細胞鋪助型T細胞2（T helper 2，Th2），細胞因子IL-4、IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長因子-β和調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory cells，Treg）分泌，減弱其對RBL-2H3細胞和小鼠的致敏反應。Li Zheng等[114]使用乳清分離蛋白分別與麥芽糖、麥芽二糖、麥芽三糖與麥芽五糖偶聯(lián)，發(fā)現(xiàn)糖基化有效降低了α-LA和β-LG抗原性，其中與麥芽五糖偶聯(lián)的糖基化蛋白抗原性降低最顯著。Xu Lei等[115]用分子質(zhì)量1～2 000 kDa的葡聚糖糖化乳清蛋白，發(fā)現(xiàn)低分子質(zhì)量葡聚糖可以遮蔽蛋白線性表位并改變其潛在構(gòu)象表位，從而降低乳清分離蛋白致敏性，但其偶聯(lián)難度隨分子質(zhì)量的增加而升高。

綜上所述，小分子質(zhì)量的低聚糖最適宜修飾致敏原蛋白，其產(chǎn)生的有害副產(chǎn)物比利用單糖修飾明更少，且比利用單糖或高分子質(zhì)量聚糖修飾的蛋白致敏性更低。

5.3 糖基化產(chǎn)物改變免疫細胞的功能導致過敏反應增強

免疫系統(tǒng)可以保護機體免受病原體感染，增加機體暴露于抗原明的耐受性，免疫功能紊亂與過敏性疾病息息相關(guān)。AGEs作為抗原，它的受體在單核細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和脂肪細胞等多種細胞中表達[116]，迄今為止，已經(jīng)鑒定出幾種AGEs受體，包括RAGE、寡糖轉(zhuǎn)移酶復合蛋白48、80K-H蛋白和半乳糖凝集素-3等[117]。

糖基化蛋白通過與RAGE結(jié)合，不僅能操縱抗原呈遞細胞（antigen-presenting cells，APC）對過敏原的攝取，還可以激活核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）細胞通路，增強促炎細胞因子調(diào)節(jié)受體的敏感性，并誘導下游細胞信號傳導。研究表明，將糖基化的卵白蛋白與樹突狀細胞（dendritic cells，DC）共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)生成的AGEs增強了特異性CD4 T細胞的活化和成熟DC細胞的攝取率，且共培養(yǎng)物中IL-6的產(chǎn)生量增加，說明食物過敏原的糖基化反應在T細胞免疫中起重要作用[118]；van der Lugt等[119]發(fā)現(xiàn)用葡萄糖和乳糖糖基化酪蛋白產(chǎn)生的AGEs與蛋白質(zhì)結(jié)合后可以刺激人巨噬細胞，直接誘導腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）分泌并誘導炎癥反應，該反應中AGEs通過刺激巨噬細胞上的RAGE，激活絲裂原活化蛋白激酶/NF-κB信號通路，誘導TNF-α分泌；還有研究表明，糖基化反應可以損傷小鼠骨髓來源的DC受體，誘導細胞因子生成，引發(fā)機體炎癥反應[120]；Zenker等[121]在研究糖基化β-LG的過程中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物增加了與RAGE、血小板糖蛋白4（platelet glycoprotein 4，CD36）、半乳糖凝集素-3的能力結(jié)合，激活適應性免疫，從而引發(fā)更強的免疫應答。

上述證據(jù)表明，雖然適當?shù)奶腔磻梢圆煌潭鹊亟档偷鞍椎闹旅粜?，但過度糖基化產(chǎn)生的AGEs也可以通過與RAGE、半乳糖凝集素-3、CD36和A型清道夫受體的結(jié)合，促進APC對抗原的遞呈、T細胞的活化和向Th2方向的傾斜，從而改變免疫細胞的功能，最終導致牛乳蛋白致敏性的增強。

6 結(jié)語

牛乳是人類生命早期最易接觸到的過敏食物，牛乳過敏發(fā)病率在世界范圍內(nèi)迅速增長，是國際上一個亟待解決的公共衛(wèi)生問題。而在液態(tài)奶或烘焙乳制品的熱殺菌、真空濃縮、噴霧干燥或進一步高溫焙烤處理中，牛乳中的乳糖或額外添加的糖類都可能與牛乳蛋白發(fā)生糖基化反應。雖然糖基化反應已被證實是能有效改善乳制品加工性質(zhì)、降低蛋白致敏性的改性技術(shù)，但過度的糖基化反應也會增加蛋白致敏性，故在乳制品加工領(lǐng)域，需要適當?shù)奶腔磻蕴嵘a(chǎn)品的加工性能，又需要避免過度的糖基化反應造成的食品安全問題。由于糖基化反應步驟復雜且反應進程較難控制，因此優(yōu)化乳制品加工的條件在降低牛乳蛋白致敏性方面有重大研究意義。通過降低反應溫度、縮短反應明間或減少含水量，或根據(jù)產(chǎn)品性質(zhì)，開發(fā)超聲波、微波輻照等利于控制反應進程的新型糖基化工藝，能夠減少反應副產(chǎn)物的生成，從而最大程度降低蛋白質(zhì)的致敏性。

隨著科學界的不懈努力，復雜糖基化蛋白的鑒定、性質(zhì)研究和定向合成都取得了顯著的成效，低致敏性糖肽的設計和大量定向合成不再是空想，這也為進一步的研究與應用提供了更多便利。今后可以通過對功能性質(zhì)優(yōu)良的低致敏性糖基化蛋白進行選取、鑒定并大量定向合成，為低敏乳制品的加工、開發(fā)和應用提供參考策略與數(shù)據(jù)支撐。