熱殺菌期間胰蛋白酶改性對(duì)蛋清液耐熱性和結(jié)構(gòu)特性的影響

祁騰達(dá)，馬艷秋，遲玉杰,，遲 媛

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

除水分外，蛋清液主要是由蛋白質(zhì)、少量脂質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)等組成的膠狀物質(zhì)[1]，因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和優(yōu)良的功能特性而廣泛應(yīng)用于焙烤食品[2]。為了確保微生物安全性，一般使用的巴氏殺菌條件為55～57 ℃加熱3～4 min[3]，但是蛋清液易受到高溫的影響而變性聚集[4]。因此，改善蛋清液的耐熱性是擴(kuò)大其在食品行業(yè)中應(yīng)用的關(guān)鍵。為研究一種高耐熱性蛋清液，將其應(yīng)用于在實(shí)際生產(chǎn)中，本研究通過胰蛋白酶改性的手段提升蛋清的耐熱性，并研究耐熱性與結(jié)構(gòu)特性之間的關(guān)系。

胰蛋白酶是由胰腺分泌的消化酶之一，通常是從牛、豬、羊的胰臟中提取純化獲得的結(jié)晶，然后再制成凍干制劑[5]。胰蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶家族，主要作用是在小腸內(nèi)將蛋白質(zhì)和多肽分解為大小不等的肽段，對(duì)蛋白質(zhì)的水解起著重要作用[6]。蛋白酶改性是利用蛋白酶在溫和條件下水解蛋白質(zhì)，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而使蛋白質(zhì)獲得更好的熱穩(wěn)定性和功能性。遲玉杰等[7]利用中性蛋白酶水解蛋清粉，發(fā)現(xiàn)可以提高蛋清的起泡性和泡沫穩(wěn)定性。劉劍秋等[8]通過使用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶水解濃度3%的全蛋液，可使其熱凝固溫度提高至75 ℃。涂勇剛等[9]對(duì)木瓜蛋白酶改善蛋清蛋白的起泡性工藝進(jìn)行優(yōu)化，起泡性提高140%。Tian Shuangqi等[10]利用木瓜蛋白酶水解小麥胚芽白蛋白，可有效改善起泡性。

近年來，利用酶改性液態(tài)蛋的功能性質(zhì)研究有很多，但對(duì)于熱殺菌期間胰蛋白酶改性對(duì)蛋清液耐熱性和結(jié)構(gòu)特性影響的分析相對(duì)較少。因此本研究采用胰蛋白酶對(duì)蛋清液進(jìn)行酶改性，通過濁度和上清液蛋白含量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)衡量蛋清液的耐熱性，探究在不同熱殺菌溫度（56、62、68 ℃和72 ℃，3 min）條件下，酶改性對(duì)蛋清液耐熱性和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響，旨在為酶改性技術(shù)在蛋清液中的高效應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋 哈爾濱香坊區(qū)好又多超市。

胰蛋白酶（酶活力8.9×104U/g）上海源葉生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid，ANS）美國(guó)Sigma公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌機(jī) 上海浦東物理化學(xué)儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-7100熒光分光光度計(jì)、SU801場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本日立公司；Nicolet is50傅里葉變換紅外光譜儀、HAAKE MARS60旋轉(zhuǎn)流變儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；SYNC激光粒度儀 美國(guó)麥奇克有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

取新鮮雞蛋，洗凈干燥后打蛋分離蛋清，用紗布過濾得到新鮮蛋清液，勻速攪拌15 min。添加胰蛋白酶，酶改性條件：酶添加量0.15%、水解時(shí)間60 min、反應(yīng)溫度42 ℃。以酶改性（25 ℃）和未改性（25 ℃）蛋清液為對(duì)照，蛋清液常用的巴氏殺菌條件為56 ℃加熱3 min，因此本實(shí)驗(yàn)選用不同的熱殺菌溫度（56、62、68、72 ℃）加熱蛋清液3 min，其中一部分樣品經(jīng)凍干后用于后續(xù)研究。

1.3.2 濁度的測(cè)定

參照杜清普等[11]的方法并稍作修改。將制備好的蛋清液樣品用去離子水稀釋20 倍，采用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定溶液在540 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以此表示蛋清液樣品的濁度。

1.3.3 上清液蛋白含量的測(cè)定

參照何大博等[12]的方法。將制備好的蛋清液樣品，8 000 r/min離心30 min，離心后取上清液。使用BCA法總蛋白定量測(cè)定試劑盒測(cè)定上清液蛋白含量。將56.3 g/L的BCA蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品用去離子水稀釋至不同質(zhì)量濃度梯度（1、0.1、0.2、0.4、0.5 mg/mL），使用酶標(biāo)儀在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以蛋白含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。比照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋清液樣品的上清液蛋白含量。

1.3.4 表觀黏度的測(cè)定

參照Liu Xin等[13]方法并略有修改。測(cè)試前樣品在25 ℃放置1 h。樣品置于流變儀感應(yīng)板上，使用C60平板進(jìn)行測(cè)定，設(shè)定剪切速率范圍為0.01～100 s-1，板間距為1 000 nm。以剪切速率為橫坐標(biāo)，表觀黏度為縱坐標(biāo)，繪制剪切速率與表觀黏度的關(guān)系圖。運(yùn)用Ostwald-de Waele冪次定律模型對(duì)關(guān)系圖進(jìn)行回歸擬合，公式如下：

式中：λ為剪切速率/s-1；η為表觀黏度；K為黏稠系數(shù)；n為流體指數(shù)。

1.3.5 粒徑分布的測(cè)定

參照馬艷秋等[14]的方法并稍作修改，制備蛋白質(zhì)量濃度為1～2 mg/mL的蛋清液樣品，使用激光粒度儀測(cè)定蛋清液樣品的粒徑分布，測(cè)定溫度25 ℃，參數(shù)設(shè)置：分散劑為水，分散劑折射率為1.33。以粒徑為橫坐標(biāo)，體積分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)繪制粒徑分布圖。

1.3.6 表面疏水性的測(cè)定

參照Li Xin等[15]的方法略有修改。預(yù)制蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL的蛋清液樣品，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.0）將蛋清液稀釋為5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度0.1～0.5 mg/mL）。然后將20 μL ANS（8 mol/L）與4 mL樣品溶液混合，并在黑暗中放置15 min。使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)390 nm；發(fā)射波長(zhǎng)470 nm；狹縫寬度5 nm。曲線的斜率為測(cè)定蛋清液樣品的表面疏水性。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參照Huang Qun等[16]的方法并稍加修改。用PBS（0.01 mol/L，pH 7.0）稀釋蛋清液蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠、質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE，在80 V電壓下持續(xù)30 min后，調(diào)整電壓至120 V，染料距底部膠1 cm時(shí)停止電泳。凝膠用固定液固定30 min、染色液染色30 min、脫色液脫色過夜至條帶清晰后，使用凝膠成像儀對(duì)凝膠照相。

1.3.8 掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察

參照Li Peishan等[17]的方法并稍加修改。取少許凍干的蛋清樣品固定在導(dǎo)電膠上，噴金處理200 s。將放大倍數(shù)至500 倍，觀察不同蛋清的表觀形貌，并且拍攝照片記錄所觀察到的特征。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析

參照Han Ke等[18]的方法并稍加修改。將凍干蛋清樣品分別與干燥的KBr研磨混合后壓片，使用FTIR進(jìn)行測(cè)定，掃描范圍為4 000～500 cm-1。使用OMNIC軟件對(duì)基線進(jìn)行校正并分析蛋清液樣品蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 熱殺菌期間酶改性對(duì)蛋清液濁度的影響

濁度能夠反映出蛋清液中的粒子大小和數(shù)量，可以描述蛋白質(zhì)的聚集程度，從側(cè)面說明蛋清液耐熱性的變化情況[19]。熱殺菌溫度對(duì)酶改性和未改性蛋清液濁度的影響如圖1所示。在同一殺菌溫度下，酶改性蛋清液的濁度顯著低于未改性蛋清液（P＜0.05）。隨著熱殺菌溫度的升高，改性前后蛋清液的濁度都逐漸升高。結(jié)果表明，經(jīng)酶改性后的蛋清液可以有效抑制蛋清蛋白質(zhì)的熱聚集?？赡苁怯捎诿父男缘扒逡旱牡鞍踪|(zhì)水解為小分子蛋白，粒子變小導(dǎo)致濁度有所下降[20]，之后熱殺菌溫度升高，小分子蛋白重新聚合，導(dǎo)致濁度逐漸上升，這與暢鵬等[21]研究結(jié)果一致。

圖1 熱殺菌期間酶改性對(duì)蛋清液濁度的影響Fig.1 Effect of enzymatic modification on the turbidity of liquid egg white during heat sterilization

2.2 熱殺菌期間酶改性蛋清上清液蛋白含量的變化

如圖2所示，與25 ℃未改性蛋清液相比，經(jīng)酶改性蛋清液的上清液中蛋白含量越多，表明酶改性對(duì)蛋清液中蛋白熱聚集的抑制效果越好，說明蛋白酶改性處理可以改善蛋清液的耐熱性[22]?？傮w上看，隨著熱殺菌溫度的升高，上清液蛋白含量呈下降趨勢(shì)。25 ℃酶改性蛋清液與未改性蛋清液的上清液蛋白含量無顯著差異（P＞0.05）。在同一熱殺菌溫度下，酶改性蛋清液的上清液蛋白含量顯著高于未改性（P＜0.05）。主要原因可能是加熱引起蛋白通過疏水相互作用聚集，導(dǎo)致上清液蛋白含量降低。而酶改性使蛋清蛋白水解為小分子，導(dǎo)致蛋清液里存在的上清液蛋白含量增多，帶電氨基酸暴露出來，增強(qiáng)了蛋白間的靜電斥力[23]，從而抑制了蛋白的熱聚集，改善了蛋清液的耐熱性。

圖2 熱殺菌期間酶改性蛋清上清液蛋白含量的變化Fig.2 Changes in protein content of enzyme-modified egg white supernatants during heat sterilization

2.3 熱殺菌期間酶改性對(duì)蛋清液表觀黏度的影響

在不同熱殺菌溫度下，通過測(cè)定酶改性對(duì)蛋清液體系的靜態(tài)流變學(xué)性質(zhì)，得到黏度的變化。采用Ostwaldde Waele冪次定律模型進(jìn)行擬合，判斷熱殺菌期間經(jīng)過酶改性后體系的流體特性是否發(fā)生變化。

如圖3所示，表觀黏度隨著剪切速率的增加而降低，呈現(xiàn)剪切稀化的現(xiàn)象，說明酶改性和未改性的蛋清液均為非牛頓流體[24]。隨著熱殺菌溫度的升高，蛋清液的黏度呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。在同一熱殺菌溫度下，酶改性蛋清液的黏度均顯著低于未改性蛋清液（P＜0.05）。蛋清液的黏度增加可能是由于熱殺菌溫度的升高，蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，分子間的相互作用力增強(qiáng)。酶改性使得蛋清液結(jié)構(gòu)間的相互作用力和共價(jià)交聯(lián)減少而降低黏度[25]。Li Xin等[26]研究發(fā)現(xiàn)，隨著熱殺菌溫度的升高，蛋白質(zhì)擴(kuò)展，然后通過疏水相互作用和二硫鍵重新聚集形成聚合體，具有更高的表觀黏度。

圖3 熱殺菌期間酶改性對(duì)蛋清液表觀黏度的影響Fig.3 Effect of enzymatic modification on the apparent viscosity of liquid egg white during heat sterilization

由表1可知，R2＞0.98，表示圖3能較好地反映表觀黏度和剪切應(yīng)力的變化關(guān)系。對(duì)圖3中的曲線進(jìn)行擬合Ostwald-de Waele冪次定律模型分析，其中K值越大表示蛋清液η越大[27]。從表1可以看出，酶改性蛋清液黏度降低，隨著熱殺菌溫度的升高，蛋清液黏度呈逐漸上升趨勢(shì)，K值增大。由于酶水解蛋清蛋白使蛋清液的體系分散，降低蛋白質(zhì)分子間的凝集，熱殺菌溫度升高，其K值越大，說明蛋白分子交聯(lián)，重新聚合成較大的不溶性集合體。n變化不規(guī)律，這可能是由于蛋清液中包含多種蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)在不同熱殺菌溫度下變化有所不同，對(duì)n的變化產(chǎn)生影響。

表1 不同熱殺菌溫度的蛋清液表觀黏度擬合參數(shù)Table 1 Fitting parameters of apparent viscosity of liquid egg white at sterilization temperatures

2.4 熱殺菌期間蛋白酶改性對(duì)蛋清液粒徑分布的影響

如圖4所示，不同熱處理下未改性和酶改性蛋清液的粒徑分布呈現(xiàn)出明顯差異。隨著熱殺菌溫度不斷升高，蛋清液的粒徑鋒正向移動(dòng)，平均粒徑逐漸增大。酶改性蛋清液的粒徑分布更加接近正態(tài)分布，表現(xiàn)出單一的鋒。根據(jù)Wang Baoli等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，樣品較小的粒徑可以降低顆粒在熱應(yīng)力下的聚集程度，從而提高蛋清蛋白顆粒的熱穩(wěn)定性。相比之下，未改性蛋清液的粒徑分布更加分散，呈現(xiàn)雙峰，且大粒徑顆粒所占比例更大。而隨著熱殺菌溫度的升高，粒徑大小逐漸增大，這可能是因?yàn)榧訜釋?dǎo)致蛋白質(zhì)的熱聚集，所以粒徑有所增加[29]。

圖4 不同熱殺菌溫度下蛋清液的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of egg white liquid under different heat sterilization temperatures

2.5 熱殺菌期間酶改性對(duì)蛋清液表面疏水性的影響

如圖5所示，蛋清液的表面疏水性隨著溫度的升高，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露時(shí)，蛋清液的疏水性提高。在同一熱殺菌溫度條件下，酶改性蛋清液的表面疏水性顯著高于未改性蛋清液（P＜0.05）。在25 ℃時(shí)，酶改性蛋清液的表面疏水性顯著高于未改性蛋清液（P＜0.05），原因可能是酶改性促進(jìn)了蛋白質(zhì)的色氨酸殘基、酪氨酸殘基等疏水性基團(tuán)的暴露，提高其表面疏水性。從蛋清液粒徑分布可以看出酶改性改變蛋白質(zhì)分子的聚集和分散，影響疏水基團(tuán)的暴露情況，從而改變蛋清液的疏水性。與未改性蛋清液相比，酶改性使蛋清液蛋白的表面疏水性顯著降低（P＜0.05）。熱殺菌溫度達(dá)到68 ℃時(shí)，未改性蛋清液和酶改性蛋清液的表面疏水性均達(dá)到最大值，分別為600.68±6.22和809.90±4.01。根據(jù)王晨等[30]研究，蛋白酶酶解處理可能會(huì)使蛋清蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，從而導(dǎo)致蛋白表面疏水性的增加。而過高的熱殺菌溫度使蛋白分子重新聚合，疏水基團(tuán)被掩埋，表面疏水性降低[31]。

圖5 熱殺菌期間酶改性對(duì)蛋清液表面疏水性的影響Fig.5 Effect of enzymatic modification on the surface hydrophobicity of liquid egg white during heat sterilization

2.6 SDS-PAGE分析

蛋清蛋白主要成分為卵黏蛋白（28 kDa）、卵清蛋白（45 kDa）、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白（78 kDa）和溶菌酶（14.3 kDa）[32]。以未改性25 ℃（泳道6）為對(duì)照，結(jié)果如圖6所示，未改性蛋清液的條帶顏色因?yàn)闊釟⒕鷾囟壬叨兓畲?，酶改性蛋清液的蛋白大部分為小分子蛋白，酶改?2 ℃的蛋清液（泳道5）在卵黏蛋白處的條帶變深，而未改性62 ℃的蛋清液（泳道8）在卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和卵清蛋白處的條帶變深，開始出現(xiàn)蛋白聚集物，且隨著熱殺菌溫度的升高，蛋白聚集物越多。這說明酶改性使蛋清中高分子質(zhì)量的蛋白水解，且熱殺菌處理后，酶改性蛋清液的高分子質(zhì)量條帶顏色依然較淺，說明熱處理酶改性蛋清液形成的大分子顆粒較少，抑制了蛋清液蛋白的熱聚集，從而改善了蛋清液的耐熱性。更小的粒徑大小與分布很好地佐證了這一結(jié)果。當(dāng)泳道顏色變淺時(shí)，表明蛋白質(zhì)聚集體已被β-巰基乙醇和SDS分解，酶改性促進(jìn)了疏水相互作用和巰基二硫鍵交換的反應(yīng)，從而增強(qiáng)了疏水相互作用并斷裂二硫鍵。當(dāng)?shù)扒宓鞍踪|(zhì)被蛋白酶水解后，蛋白質(zhì)中的自由氨基和巰基減少，與考馬斯亮藍(lán)發(fā)生顯色反應(yīng)的基團(tuán)減少，從而使條帶變淺或不顯色。

圖6 不同熱殺菌溫度下酶改性與未改性蛋清液SDS-PAGE圖像Fig.6 SDS-PAGE images of enzyme-modified and unmodified liquid egg white at different sterilization temperatures

2.7 熱殺菌期間酶改性對(duì)蛋清結(jié)構(gòu)的影響

如圖7所示，未改性25 ℃的蛋清樣品顆粒尺寸較大，這些顆粒之間有些黏連在一起，導(dǎo)致總體呈現(xiàn)不規(guī)則且不均勻的分布。隨著熱殺菌溫度的升高，未改性蛋清蛋白顆粒數(shù)量明顯減少，且分布更加松散。酶改性25 ℃的蛋清樣品微觀顆粒的表面孔洞和縫隙增多，經(jīng)過熱殺菌處理后，顆粒表面出現(xiàn)黏連，其顆粒數(shù)量減少。與未改性蛋清樣品的SEM圖像進(jìn)行對(duì)比，在同一熱殺菌溫度下，酶改性蛋清蛋白的顆粒數(shù)量多于未改性蛋清蛋白。

SEM圖像表明酶改性處理可以改善蛋清蛋白的熱聚集，酶改性后蛋清粉的顆粒結(jié)構(gòu)被破壞并分裂成大量碎片，產(chǎn)生不規(guī)則的孔狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)一定程度的片狀凸起，顆粒大小也變得更小。由于熱殺菌處理使蛋清蛋白發(fā)生熱聚集，經(jīng)過離心后凍干的不同蛋清樣品SEM圖像也不同，其結(jié)果與上述蛋清上清液蛋白含量的結(jié)果一致。酶改性處理可使結(jié)構(gòu)緊密的蛋白質(zhì)分子展開，并暴露活性殘基，經(jīng)過熱殺菌處理仍保留較多的蛋清蛋白，表明酶改性處理改善了蛋清的耐熱性。

2.8 FTIR分析

2.8.1 圖譜分析

紅外光譜學(xué)可以通過多肽鏈的主干吸收紅外輻射，從而激發(fā)其組成酰胺鍵的振動(dòng)模式[33]。其中，酰胺I帶是在1 700～1 600 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)的振動(dòng)帶[34]，它的振動(dòng)主要是由羰基（C＝O）雙鍵導(dǎo)致，是分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的重要帶位。如圖8所示，處理前后的蛋清液蛋白紅外圖譜并無明顯變化，但在酰胺I帶處，未改性蛋清組中峰值由1 652.63 cm-1處偏移到1 622.37 cm-1處，酶改性蛋清組的峰值位于1 657.41 cm-1處，酶改性使得蛋白質(zhì)的酰胺I帶向高波數(shù)偏移，熱殺菌處理使蛋白質(zhì)的酰胺I帶向低波數(shù)偏移，偏移到1 636.85 cm-1處。通過氫鍵的斷裂，可以提高化學(xué)鍵的力常數(shù)，從而吸收頻率移向高波數(shù)方向。因此，蛋白酶改性處理可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開，并改變官能團(tuán)。

圖8 熱殺菌期間酶改性對(duì)蛋清蛋白紅外光譜的影響Fig.8 Effect of enzymatic modification on the infrared spectrum of egg white proteins during heat sterilization

2.8.2 酰胺I帶的反卷積和曲線擬合

為進(jìn)一步了解酶改性對(duì)蛋清蛋白質(zhì)的影響，對(duì)不同處理的蛋清蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)改性后，C＝O數(shù)量以及C＝O和N—H之間的氫鍵都發(fā)生了變化。

蛋清蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化情況如表2 所示，蛋清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為α-螺旋35.74%、β-折疊28.45%、β-轉(zhuǎn)角25.71%、無規(guī)卷曲10.10%。這與康鵬等[35]的研究結(jié)果基本一致。熱處理使未改性和酶改性蛋清液中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。未改性蛋清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量變化不規(guī)律，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量隨溫度的升高不斷增大，在72 ℃時(shí)無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量達(dá)到13.28%，而α-螺旋相對(duì)含量先增大后減小，超過68 ℃后α-螺旋相對(duì)含量顯著升高（P＜0.05）。酶改性后蛋清液α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)在68 ℃條件下相對(duì)含量分別為最高和最低，使得蛋白同時(shí)具有穩(wěn)定性和靈活性，在此時(shí)酶改性蛋清液α-螺旋結(jié)構(gòu)相對(duì)含量顯著高于未改性蛋清液（P＜0.05），無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量明顯低于未改性蛋清液，且酶改性后蛋清液二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化幅度明顯小于未改性蛋清液，這說明酶改性改變了蛋清液蛋白質(zhì)內(nèi)的氫鍵，適當(dāng)熱處理對(duì)蛋白質(zhì)的有序性有促進(jìn)作用。

表2 熱殺菌期間酶改性對(duì)蛋清蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的影響Table 2 Effect of enzymatic modification on the relative contents of secondary structures of egg white protein during heat sterilization%

3 結(jié)論

本研究通過胰蛋白酶對(duì)蛋清液進(jìn)行改性，探究熱殺菌期間胰蛋白酶對(duì)蛋清液耐熱性和結(jié)構(gòu)特性的影響。結(jié)果顯示，蛋白酶改性處理使蛋清液濁度顯著降低（P＜0.05），與未改性蛋清液相比，改性后的上清液蛋白含量無顯著差異（P＞0.05）。在熱殺菌過程中，酶改性蛋清液濁度顯著低于未改性蛋清液，其上清液蛋白含量顯著高于未改性蛋清液（P＜0.05），證明蛋白酶改性是一種改善蛋清液耐熱性的有效方法。通過分析表觀黏度、表面疏水性發(fā)現(xiàn)，酶改性蛋清液在熱殺菌過程中蛋白質(zhì)表觀黏度逐漸升高，表面疏水性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在同一熱殺菌溫度下，酶改性蛋清液的表觀黏度顯著低于未改性蛋清液，表面疏水性顯著高于未改性蛋清液（P＜0.05）。FTIR結(jié)果顯示，酶改性處理可以使蛋白酰胺I帶向高波數(shù)偏移，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示熱殺菌溫度低于68 ℃時(shí)，酶改性蛋清液蛋白質(zhì)的α-螺旋相對(duì)含量顯著高于未改性蛋清液，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量顯著低于未改性蛋清液（P＜0.05）。酶改性蛋清液的粒徑分布趨于正態(tài)分布，在同一熱殺菌溫度下，其粒徑顯著小于未改性蛋清液（P＜0.05）。SDS-PAGE結(jié)果表明蛋白酶改性能抑制蛋白熱聚集。酶改性25 ℃的蛋清液顆粒的表面孔洞和縫隙增多，經(jīng)過熱殺菌處理后，其顆粒數(shù)量減少。在同一熱殺菌溫度下，酶改性蛋清蛋白的顆粒數(shù)量多于未改性蛋清蛋白。因此，在熱殺菌過程中，胰蛋白酶對(duì)蛋清液有積極作用，可有效改善蛋清蛋白的熱聚集，提高蛋清液的耐熱性，對(duì)擴(kuò)大其銷售半徑有重要意義。