襄陽地區(qū)高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)及其風(fēng)味品質(zhì)解析

向凡舒，蔡文超，田龍新，劉菊珍，周加平，葉明波，單春會(huì)，郭 壯1,,

（1.湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽 441053；2.襄陽市醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵企校聯(lián)合創(chuàng)新中心，湖北 襄陽 441053；3.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832000；4.醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵襄陽市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 襄陽 441053；5.湖北東方明珠酒業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 襄陽 441053）

我國白酒種類眾多，包括醬香、濃香和清香等12 種香型的白酒，不同香型白酒所用酒曲的類型亦有所不同[1]。正所謂“曲乃酒之骨”，酒曲通過提供豐富的微生物及酶系推動(dòng)了白酒的發(fā)酵過程[2]。醬香型白酒作為香味最豐富的白酒，其不僅釀造工藝復(fù)雜，所使用的高溫大曲亦較為特殊[3]。相較于其他酒曲，高溫大曲培菌階段的溫度最高，可達(dá)60～70 ℃[4]。較高的發(fā)酵溫度可能使高溫大曲中富集較為特殊的微生物群，又或使微生物在極端環(huán)境下的代謝產(chǎn)物較為特殊，最終賦予了高溫大曲較為獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)[5]。此外，高溫大曲在白酒釀造過程中的投入量較大，與糧食的投入比例相當(dāng)，因而它可能也為醬香型白酒提供了香味基底，其自身的風(fēng)味品質(zhì)不容忽視[4]。然而，由于受到排列方式和發(fā)酵熱的影響，曲房溫度會(huì)在空間尺度上有一定的波動(dòng)，這使得排列在不同位置的高溫大曲其微生物類群和品質(zhì)在空間尺度上亦會(huì)出現(xiàn)波動(dòng)，外觀上通常出現(xiàn)白色、黃色和黑色3 種顏色[4]。白色高溫大曲通常產(chǎn)生于靠門窗和墻壁等溫度相對較低的位置，黃色高溫大曲通常均勻分布在大曲堆中，而黑色高溫大曲通常產(chǎn)生于溫度相對較高的大曲堆中部[6]。目前，已有許多研究人員從理化性質(zhì)、微生物類群及感官特性等方面對不同顏色高溫大曲展開了研究，結(jié)果表明3 種顏色高溫大曲在以上方面均存在顯著差異[7-9]。此外，不同企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)亦存在較大差異。例如貴州茅臺高溫大曲中的微生物主要以芽孢桿菌屬（Bacillus）和曲霉菌屬（Aspergillus）為主，四川古藺郎酒高溫大曲中卻不含有Bacillus，安徽古井貢酒的高溫大曲中真菌主要以嗜熱真菌屬（Thermomyces）為主[10-12]。上述研究結(jié)果表明溫度差異和生產(chǎn)工藝的不同可能均是影響高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)的因素，而以往研究大多只關(guān)注到了其中的一個(gè)方面。此外，作為醬香型白酒的新產(chǎn)區(qū)之一，湖北襄陽地區(qū)生產(chǎn)的高溫大曲在上述方面的研究還尚少。

以MiSeq高通量測序?yàn)榇淼牡诙鷾y序技術(shù)，在實(shí)現(xiàn)快速全面分析和降低實(shí)驗(yàn)成本方面具有顯著優(yōu)勢，目前也作為解析釀酒微生物類群的常用技術(shù)手段之一。例如使用該技術(shù)對低溫大曲微生物類群進(jìn)行解析時(shí)，Cai Wenchao等[13]發(fā)現(xiàn)紅心曲的細(xì)菌豐度和多樣性最高，而清茬曲真菌豐度和多樣性較高；Huang Zirui等[14]使用該技術(shù)解析了不同種類的米酒曲，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紅曲和白曲中的細(xì)菌和真菌類群存在顯著不同。由此可見，MiSeq高通量測序技術(shù)在解析不同分組樣品間微生物類群差異方面亦合適。電子鼻是利用電子傳感器識別食物香氣的設(shè)備，它能夠識別芳香類物質(zhì)、烷烴類、萜類和有機(jī)硫化物等揮發(fā)性香氣成分大類，不需要分離和識別具體的揮發(fā)性化合物類別[15]。因而該技術(shù)具有操作簡單、檢測快速和無需特殊的樣品前處理等優(yōu)點(diǎn)，是替代耗時(shí)且昂貴的色譜分析方法的合適方案，目前已廣泛應(yīng)用于食品、飲料和醫(yī)藥保健領(lǐng)域，例如Viejo等[16-17]使用該技術(shù)有效識別了不同咖啡和啤酒的香氣特征和強(qiáng)度。

本研究首先采用MiSeq高通量測序技術(shù)與電子鼻技術(shù)對比分析襄陽地區(qū)A企業(yè)生產(chǎn)的3 種顏色高溫大曲真菌類群及其揮發(fā)性香氣成分；然后從MG-RAST數(shù)據(jù)庫中下載B企業(yè)高溫大曲的真菌序列數(shù)據(jù)，并對兩個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的不同顏色高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行合并分析；最后采用純培養(yǎng)法對其中的酵母菌菌株進(jìn)行分離鑒定。本研究旨在為當(dāng)?shù)蒯u香型白酒企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲風(fēng)味品質(zhì)提供數(shù)字化評價(jià)，為其配曲工藝的提升以及智能化制曲應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）合成培養(yǎng)基 中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；Neasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒 德國QIAGEN公司；TaqDNA聚合酶和T載，正/反向引物ITS3F/ITS4R（ITS3F：5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′；ITS4R：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和引物26S1/26S2（引物26S1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′；引物26S2：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′）上海桑尼生物科技有限公司；Illumina MiSeq測序試劑盒v3美國Illumina公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vetiri聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）梯度基因擴(kuò)增儀 美國AB公司；MiSeq PE300高通量測序平臺 美國Illumina公司；R930機(jī)架式服務(wù)器美國DELL公司；PEN3電子鼻（配備8 個(gè)傳感器）德國Airsense公司；ECLIPSE Ci生物顯微鏡 日本Nikon公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品收集

本研究于2022 年8 月從湖北省襄陽市（E 110°45′～113°06′，N 31°13′～32°37′）生產(chǎn)醬香型白酒的A企業(yè)采集到高溫大曲樣品30 份，其中白色、黃色和黑色高溫大曲（以下分別簡稱為白曲、黃曲和黑曲）各10 份，分別編號為W1～10、Y1～10和B1～10。所有樣本均由A企業(yè)同一批次生產(chǎn)，且儲存于同一庫房中。采樣時(shí)首先根據(jù)大曲堆的高度將大曲堆均分成上中下3 層，然后每種顏色高溫大曲從上層和下層的不同位置分別隨機(jī)選取3 塊，從中間層的不同位置隨機(jī)選取4 塊[6]。將采集到的大曲塊裝入無菌自封袋后在常溫下運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室，并在實(shí)驗(yàn)室條件下將曲塊打碎至粉末狀后置于-80 ℃，以便用于后續(xù)提取宏基因組DNA、電子鼻上機(jī)檢測和酵母菌菌株分離鑒定。此前，已有研究人員對襄陽地區(qū)B企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲微生物類群展開了分析[9]。因而本研究從MG-RAST數(shù)據(jù)庫中下載了B企業(yè)高溫大曲的真菌序列數(shù)據(jù)，以探討不同企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)差異。兩個(gè)企業(yè)在生產(chǎn)高溫大曲時(shí)使用的曲模規(guī)格、翻曲時(shí)間節(jié)點(diǎn)和培養(yǎng)溫度等工藝參數(shù)均有所差異（圖1）。

圖1 高溫大曲制曲流程圖Fig.1 Flow chart of high-temperature Daqu production

1.3.2 宏基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及測序

高溫大曲樣品的宏基因組參照DNA試劑盒中提供的方法進(jìn)行提取，參照姚衡斌等[18]的方法使用引物ITS3F/ITS4R（含有核苷酸標(biāo)簽）對真菌內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）2區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化PCR產(chǎn)物，純化后的PCR產(chǎn)物寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成高通量測序。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

本研究通過高通量測序獲得的序列數(shù)據(jù)均基于QIIME（v 1.9.0）平臺完成生物信息學(xué)分析。首先使用PyNAST軟件根據(jù)核苷酸標(biāo)簽信息將下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分和歸并至各樣品，繼而使用FLASH（v 1.2.7）軟件對雙端序列進(jìn)行拼接[19]，參照Caporaso等[20]提出的標(biāo)準(zhǔn)對序列進(jìn)行質(zhì)控，得到的高質(zhì)量序列依據(jù)97%序列相似度進(jìn)行分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）的構(gòu)建[21]，并采用Chimera Slayer軟件去除嵌合體OTU[22]，基于Unite（v 7.2）數(shù)據(jù)庫完成真菌物種信息注釋[23]。此外，真菌發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和Shannon指數(shù)等α多樣性指數(shù)以及基于非加權(quán)和加權(quán)OTU的UniFrac距離主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）均依靠QIIME（v 1.9.0）平臺完成計(jì)算，最后使用線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）Effect Size（LEfSe）甄別不同企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲真菌標(biāo)志物。

1.3.4 基于電子鼻技術(shù)高溫大曲氣味指標(biāo)分析

每份樣品均稱取8.0 g于電子鼻檢測頂空瓶中，裝樣的頂空瓶于45 ℃條件下水浴10 min后進(jìn)行頂空進(jìn)樣，每份樣品均設(shè)置3 組平行實(shí)驗(yàn)。進(jìn)樣條件參照Huang Minzheng等[24]的方法進(jìn)行設(shè)置，選取49、50 s和51 s傳感器響應(yīng)值的平均值作為后續(xù)分析數(shù)據(jù)。

1.3.5 酵母菌菌株的分離與鑒定

稱取10.0 g高溫大曲粉加入至90 mL無菌生理鹽水（內(nèi)含10～15 顆玻璃珠）中，在28 ℃搖床中振蕩30 min后進(jìn)行10 倍系列梯度稀釋，選擇10-2～10-5梯度稀釋液涂布至PDA平板中，在28 ℃條件下培養(yǎng)3～5 d。培養(yǎng)結(jié)束后挑取平板上的單菌落進(jìn)行純化，已純化的菌株采用甘油保藏法將其保藏于-80 ℃。參照徐文歡等[25]的方法提取基因組DNA并對真菌26S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物純化。純化后的PCR產(chǎn)物被送至上海桑尼生物科技有限公司完成測序，測序返回的序列在NCBI網(wǎng)站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用R軟件（v 4.1.2）繪制小提琴圖和PCoA圖分別對高溫大曲真菌α多樣性和β多樣性數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化；采用R軟件（v 4.1.2）繪制氣泡圖對優(yōu)勢真菌類群數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化；使用Origin 2021軟件繪制多因子箱型圖對電子鼻檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，同時(shí)采用SAS（v 8）軟件計(jì)算優(yōu)勢真菌屬與氣味指標(biāo)之間的相關(guān)性，并采用R軟件（v 4.1.2）繪制相關(guān)性熱圖；利用在線作圖網(wǎng)站（http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/）繪制LEfSe圖；使用R軟件（v 4.1.2）繪制upset圖和瀑布圖對各樣品中的OTU數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用MAGE7軟件構(gòu)建分離株系統(tǒng)發(fā)育樹；使用Past3軟件中的Mann-Whitney和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法評估不同組數(shù)據(jù)間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種顏色高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)的比較分析

經(jīng)高通量測序共得到1 952 058 條序列，過濾掉低質(zhì)量和嵌合體序列共33 041 條后，余下1 919 017 條有效序列，有效序列按97%序列相似度歸并得到8 689 個(gè)OTU，平均每個(gè)樣品含有63 595 條有效序列和2 150 個(gè)OTU。通過計(jì)算α多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)，白曲、黃曲和黑曲的平均發(fā)現(xiàn)物種數(shù)分別為1 824、1 944和1 719，平均Shannon指數(shù)分別為5.67、5.40和4.94（圖2a、b）。經(jīng)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3 種顏色高溫大曲間亦或是任意兩種顏色高溫大曲間的發(fā)現(xiàn)物種數(shù)和Shannon指數(shù)均不存在顯著差異（P＞0.05），這表明3 種顏色高溫大曲間的真菌豐富度和多樣性差異均不顯著?；诜羌訖?quán)OTU的UniFrac距離PCoA顯示3 種顏色高溫大曲的95%置信區(qū)間均有重疊，且白曲和黃曲的95%置信區(qū)間完全重疊（圖2c）。此外，在基于加權(quán)OTU的UniFrac距離PCoA中，3 種顏色高溫大曲的95%置信區(qū)間亦出現(xiàn)較多重疊區(qū)域，且白曲和黑曲的95%置信區(qū)間完全重疊（圖2d），這表明不管考慮物種豐度與否，3 種顏色高溫大曲間真菌群落結(jié)構(gòu)均無明顯差異。由此可見，3 種顏色高溫大曲的真菌α多樣性和β多樣性均較為相似。

圖2 不同顏色高溫大曲真菌發(fā)現(xiàn)物種數(shù)（a）、Shannon指數(shù)（b）、非加權(quán)OTU的UniFrac距離（c）和加權(quán)OTU的UniFrac距離（d）PCoAFig.2 Observed species index (a),Shannon index (b) and PCoA plots of UniFrac distance based on unweighted OTU (c) and weighted OTU (d) of different colored high-temperature Daqu

2.2 3 種顏色高溫大曲的真菌類群解析

測序獲得的所有有效序列經(jīng)Unite數(shù)據(jù)庫比對后共鑒定到6 個(gè)門、14 個(gè)綱、26 個(gè)目、44 個(gè)科和71 個(gè)屬，其中平均相對含量＞1.0%的門和屬被定義為優(yōu)勢門和屬。本研究進(jìn)一步從優(yōu)勢門和屬水平上分別解析了3 種顏色高溫大曲中的真菌類群。所有高溫大曲樣品中共有2 個(gè)優(yōu)勢門，分別為子囊菌門（Ascomycota，96.67%）和毛霉菌門（Mucoromycota，2.55%）（圖3a）。經(jīng)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3 種顏色高溫大曲在2 個(gè)優(yōu)勢門的相對含量上均存在顯著差異，主要表現(xiàn)為黃曲和黑曲中的Ascomycota相對含量顯著高于白曲，而Mucoromycota相對含量則相反（P＜0.05）。所有樣品共含有7 個(gè)優(yōu)勢屬，分別為隸屬于Ascomycota的嗜熱絲孢菌屬（Thermomyces，36.50%）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus，27.15%）、酵母菌屬（Saccharomycopsis，9.23%）和雙足囊菌屬（Dipodascus，1.19%）；隸屬于Mucoromycota的曲霉屬（Aspergillus，9.36%）、根霉菌屬（Rhizopus，1.44%）和毛霉菌屬（Rhizomucor，1.03%）（圖3b）。經(jīng)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3 種顏色高溫大曲在Saccharomycopsis、Rhizopus、Dipodascus和Rhizomucor的相對含量上存在高度顯著差異（P＜0.001），且這些優(yōu)勢屬在黑曲中的相對含量顯著偏低（P＜0.05）。由此可見，盡管3 種顏色高溫大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)較為相似，但它們在各個(gè)優(yōu)勢門和屬的相對含量分布上仍表現(xiàn)出了較大差異。

圖3 高溫大曲優(yōu)勢真菌門（a）和真菌屬（b）相對含量分析Fig.3 Relative abundance of the dominant fungal phyla (a) and genera (b) in high-temperature Daqu

2.3 基于電子鼻技術(shù)高溫大曲氣味品質(zhì)解析

本研究進(jìn)一步利用電子鼻傳感器W1C（對芳香類物質(zhì)靈敏）、W3C（對芳香類物質(zhì)靈敏）、W6S（對氫氣有選擇性）、W5C（對芳香類物質(zhì)靈敏）、W3S（對烷烴類物質(zhì)靈敏）、W5S（對氫氧化物靈敏）、W1W（對有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)靈敏）和W2S（對乙醇靈敏）對其中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示傳感器W1W對高溫大曲的響應(yīng)值最高，傳感器W5S、W2S、W3S和W6S次之，而傳感器W5C、W3C和W1C響應(yīng)值均較低（圖4a、b）。這表明A企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲中有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)、氫氧化物、乙醇和烷烴類物質(zhì)含量相對較高。此外，除了傳感器W3S以外，其他傳感器對3 種顏色高溫大曲中的響應(yīng)值間均存在顯著差異（P＜0.05）（圖4a、b）。值得注意的是，對芳香類物質(zhì)靈敏的WC傳感器（W5C、W3C和W1C）對黃曲的響應(yīng)值均顯著高于黑曲（P＜0.05），而傳感器W1W、W5S和W2S則表現(xiàn)出相反的趨勢。上述結(jié)果表明，相較于黑曲，黃曲中的揮發(fā)性芳香類物質(zhì)含量顯著偏高，而有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)、氫氧化物和乙醇等含量顯著偏低（P＜0.05）。此外，絕大多數(shù)傳感器對白曲的響應(yīng)值大小均位于黃曲和黑曲之間，這表明黃曲的風(fēng)味品質(zhì)可能相對較優(yōu)，白曲次之。本研究進(jìn)一步計(jì)算了優(yōu)勢屬與電子鼻傳感器響應(yīng)值之間的相關(guān)性（圖4c）。結(jié)果顯示，Rhizomucor與傳感器W3C 響應(yīng)值之間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（R=-0.409，P＜0.05），而其他優(yōu)勢屬與傳感器響應(yīng)值之間均未表現(xiàn)出顯著相關(guān)關(guān)系。由此可見，高溫大曲中的優(yōu)勢真菌與高溫大曲氣味指標(biāo)間的關(guān)聯(lián)性較弱。

圖4 3 種顏色高溫大曲的氣味指標(biāo)（a、b）及其與優(yōu)勢真菌屬間的相關(guān)性（c）分析Fig.4 Odor indicators (a) and their correlation with dominant fungal genera (b) in three colored high-temperature Daqu

2.4 不同企業(yè)高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)比較分析

本研究從MG-RAST數(shù)據(jù)庫中下載了襄陽地區(qū)B企業(yè)生產(chǎn)的30 份高溫大曲（白色、黃色和黑色高溫大曲各10 份）樣品序列，進(jìn)一步探究了不同企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)差異。結(jié)果顯示，A企業(yè)和B企業(yè)高溫大曲真菌的平均發(fā)現(xiàn)物種數(shù)分別為1 829和1 235，平均Shannon指數(shù)分別為5.44和4.76（圖5a、b）。經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲其平均發(fā)現(xiàn)物種數(shù)高度顯著高于B企業(yè)（P＜0.001），而Shannon指數(shù)極顯著高于B企業(yè)（P＜0.01），這表明A企業(yè)高溫大曲其真菌豐富度和多樣性均顯著偏高（P＜0.05）。基于非加權(quán)OTU的UniFrac距離PCoA亦顯示出了A企業(yè)和B企業(yè)高溫大曲樣品點(diǎn)在空間結(jié)構(gòu)上較明顯的分離趨勢。A企業(yè)高溫大曲樣品主要分布在2、4象限對角線的上半部分，而B企業(yè)高溫大曲樣品主要分布在2、4象限對角線的下半部分，且兩個(gè)企業(yè)高溫大曲樣品的95%置信區(qū)間重疊區(qū)域較小，這表明不同企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)間差異較大（圖5c）。此外，本研究進(jìn)一步將不同顏色和不同企業(yè)生產(chǎn)兩個(gè)因素同時(shí)考慮在內(nèi)，采用馬氏距離對兩個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的3 種顏色高溫大曲展開了聚類分析（圖5d）。結(jié)果顯示，來源于同一企業(yè)的3 種顏色高溫大曲距離更近，且B企業(yè)的樣品均聚在了同一大分支上。此外，兩個(gè)企業(yè)樣品分支間的差異高度顯著（P＜0.001），這表明不同企業(yè)生產(chǎn)工藝上的差別對高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響較大。

圖5 不同企業(yè)高溫大曲真菌發(fā)現(xiàn)物種數(shù)（a）、Shannon指數(shù)（b）、基于非加權(quán)OTU的UniFrac距離PCoA（c）和馬氏距離聚類分析（d）Fig.5 Observed species index (a),Shannon index (b),PCoA plot of UniFrac distance based on unweighted OTU (c),cluster analysis based on Euclidean distance (d) of fungal communities in high-temperature Daqu produced by different companies

本研究進(jìn)一步通過LEfSe甄別了兩個(gè)企業(yè)高溫大曲各自的生物標(biāo)志物。A企業(yè)高溫大曲中的真菌標(biāo)志物主要隸屬于酵母菌綱（Saccharomycetes）和毛霉菌綱（Mucoromycetes）這兩個(gè)分支，而B企業(yè)高溫大曲中的真菌標(biāo)志物主要隸屬于散囊菌綱（Eurotiomycetes）分支（圖6a）。當(dāng)LDA得分大于3.5時(shí)，A企業(yè)高溫大曲中含有7 個(gè)生物標(biāo)志物，在屬水平上的生物標(biāo)志物為Saccharomycopsis；B企業(yè)高溫大曲中含有5 個(gè)生物標(biāo)志物，在屬水平上的生物標(biāo)志物為Aspergillus（圖6b）?？梢姡噍^于B企業(yè)，A企業(yè)高溫大曲中Saccharomycopsis豐度較高，而Aspergillus豐度較低。

圖6 不同企業(yè)高溫大曲基于LEfSe分析的微生物群支系圖（a）和LDA值分布柱狀圖（b）Fig.6 LEfSe analysis of fungal communities in high-temperature Daqu produced by different companies: clade diagram (a) and LDA value distribution (b)

2.5 基于OTU水平不同企業(yè)高溫大曲核心真菌類群解析

本研究進(jìn)一步從OTU水平上對兩個(gè)企業(yè)高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，并將僅出現(xiàn)在一個(gè)企業(yè)高溫大曲中的OTU定義為該企業(yè)高溫大曲中的特殊OTU，而將出現(xiàn)在每一份高溫大曲（即60 份樣品）中的OTU定義為核心OTU。OTU統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，A企業(yè)高溫大曲中含有679 個(gè)獨(dú)特OTU，B企業(yè)高溫大曲中僅含有178 個(gè)獨(dú)特OTU，而有2 001 個(gè)OTU在兩個(gè)企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲中均有出現(xiàn)，其中包含2 個(gè)核心OTU，即OTU 5907和OTU 10836，它們分別被鑒定為Thermomyces（23.53%）和Aspergillus（6.05%），占總OTU比例的29.58%（圖7）?？梢姾诵恼婢惾褐饕蒚hermomyces和Aspergillus組成。

圖7 基于OTU水平不同企業(yè)高溫大曲的核心真菌類群解析Fig.7 Analysis of core fungal taxa in high-temperature Daqu from different companies based on OTU level

2.6 基于純培養(yǎng)技術(shù)酵母菌的分離鑒定

酵母菌通常是酒曲中極為重要的一類能夠發(fā)揮糖化作用和產(chǎn)酒精作用的微生物類群[26]，因而本研究采用純培養(yǎng)法對其中的可培養(yǎng)酵母菌進(jìn)行了分離鑒定，以豐富大曲來源的酵母菌菌株，為后續(xù)篩選具有優(yōu)良發(fā)酵特性的酵母菌菌株奠定基礎(chǔ)。本研究共分離出4 株酵母菌分離株，其菌落形態(tài)均為白色，呈凸起狀，且表面干燥；細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則橢圓形或棒球形（圖8a、b）。由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，4 株分離株與扣囊覆膜孢酵母（S.fibuligeraATCC36309）聚為一支（圖8c），且它們的序列相似度均大于99.9%，因而分離株均被鑒定為S.fibuligera。

圖8 酵母菌分離株的菌落形態(tài)（a）、細(xì)胞形態(tài)（b）及其系統(tǒng)發(fā)育樹（c）Fig.8 Colony morphology (a),cell morphology (b) and phylogenetic tree (c) of yeast isolates

3 討論與結(jié)論

本研究采用MiSeq高通量測序技術(shù)對湖北襄陽醬香型白酒A企業(yè)生產(chǎn)的3 種顏色高溫大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示，3 種顏色高溫大曲中真菌群落的豐富度和多樣性均不存在顯著差異（P＞0.05），β多樣性分析結(jié)果也顯示3 種顏色高溫大曲在空間排布上均有較大程度的重疊。這表明發(fā)酵過程中由空間異質(zhì)性所引起的溫度差異對高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)影響較小，前人對該地區(qū)B企業(yè)高溫大曲的研究結(jié)果與本研究結(jié)果相吻合[9]。然而，3 種顏色高溫大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對此所表現(xiàn)出的結(jié)果與真菌截然不同，它們之間往往存在顯著差異[6]。值得注意的是，此前Zhou Qingfeng等[27]對低溫大曲（頂溫在40～50 ℃之間）、中溫大曲（頂溫在50～60 ℃之間）和高溫大曲（頂溫在60～70 ℃之間）的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明上述3 種大曲的真菌群落結(jié)構(gòu)之間存在顯著差異。此外，在其他已有研究中還能發(fā)現(xiàn)Thermomyces含量在低溫、中溫和高溫大曲中含量依次升高[13,28]，這表明大曲中的真菌類群亦會(huì)受到發(fā)酵溫度的影響，只是對溫度波動(dòng)的敏感度低于細(xì)菌。

物種注釋結(jié)果顯示Thermomyces、Thermoascus、Aspergillus和Saccharomycopsis等為主要的真菌類群，其中Saccharomycopsis中的部分菌種在釀酒領(lǐng)域的應(yīng)用已十分廣泛，例如釀酒酵母（S.cerevisiae）是常見的商業(yè)釀酒菌種[26,29]。Thermomyces和Thermoascus都屬于嗜熱菌群，它們在高溫條件下仍具有優(yōu)異的產(chǎn)酶特性，是高溫大曲中不可或缺的微生物類群[30-32]。此外，Aspergillus中的A.niger不僅能夠產(chǎn)酶，還能產(chǎn)檸檬酸，可在一定程度上為大曲增添風(fēng)味物質(zhì)[33-34]。通過電子鼻檢測發(fā)現(xiàn)，A企業(yè)高溫大曲中的揮發(fā)性有機(jī)硫化物、萜類、乙醇和烷烴類物質(zhì)檢測值相對較高，芳香類物質(zhì)檢測值較低。有趣的是，3個(gè)WC傳感器（對芳香類物質(zhì)敏感）對黃曲的響應(yīng)值均極顯著高于黑曲（P＜0.01），而W1W（對有機(jī)硫化物、萜類物質(zhì)敏感）等其他傳感器對黃曲的響應(yīng)值則顯著低于黑曲（P＜0.05）。揮發(fā)性有機(jī)硫化物具有低檢測閾值和強(qiáng)烈的感官特性，是酒精飲料中的一類重要香氣物質(zhì)，但濃度較高時(shí)會(huì)產(chǎn)生類似洋蔥和熟白菜等令人不愉快的香氣[9,35]。這說明黃曲的風(fēng)味品質(zhì)相對較優(yōu)，在釀造醬香型白酒時(shí)可適當(dāng)提高它在3 種顏色高溫大曲中的投入比例。相關(guān)性分析結(jié)果顯示僅有Rhizomucor與傳感器W3C響應(yīng)值間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），其他優(yōu)勢真菌屬與氣味指標(biāo)間均不存在顯著相關(guān)關(guān)系。同樣采用電子傳感技術(shù)，Cai Wenchao等[9]針對B企業(yè)高溫大曲的研究結(jié)果顯示對芳香類物質(zhì)靈敏的傳感器在黑曲中的響應(yīng)值最高，且優(yōu)勢真菌屬與高溫大曲氣味指標(biāo)間的相關(guān)性密切，這與本研究結(jié)果有明顯不同。不過，Zhu Qi等[36]在甄別貴州地區(qū)高溫大曲核心功能菌群時(shí)的結(jié)果與本研究較為相似，其研究結(jié)果顯示細(xì)菌是產(chǎn)生揮發(fā)性香氣成分的主要菌群，真菌與香氣成分含量間存在的相關(guān)關(guān)系較少，且大多表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)關(guān)系。這些研究結(jié)果的差異體現(xiàn)出不同企業(yè)高溫大曲的微生物類群與其風(fēng)味品質(zhì)間的相關(guān)關(guān)系可能亦有所不同。此外，制曲過程中的高溫發(fā)酵會(huì)促使大曲發(fā)生美拉德反應(yīng)，其產(chǎn)物亦可能是高溫大曲風(fēng)味的主要來源之一[8]。可見，不同來源高溫大曲中的微生物類群以及發(fā)酵過程中的美拉德反應(yīng)對大曲風(fēng)味品質(zhì)形成所產(chǎn)生的貢獻(xiàn)有所不同，這或許是不同企業(yè)生產(chǎn)的醬香型白酒風(fēng)味特征各異的原因之一。

前人研究與本研究結(jié)果表明發(fā)酵過程中的溫度波動(dòng)對高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)的影響較小，這與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)對此呈現(xiàn)出的結(jié)果恰恰相反[6,9]。因而本研究進(jìn)一步對同一地區(qū)不同企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行了解析，即探討生產(chǎn)工藝上的差別是否會(huì)對真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。α多樣性分析結(jié)果顯示，不同企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲其真菌在豐富度和多樣性上均存在極顯著差異（P＜0.01），且β多樣性分析結(jié)果與α多樣性結(jié)果相吻合。聚類分析顯示同一企業(yè)生產(chǎn)的3 種顏色高溫大曲間距離更近，這表明生產(chǎn)工藝的差異會(huì)對高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。LEfSe結(jié)果顯示A企業(yè)高溫大曲中的生物標(biāo)志物主要為Saccharomycopsis；B企業(yè)高溫大曲中的生物標(biāo)志物主要為Aspergillus。核心OTU的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示不同企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲中仍含有近三分之一的核心菌群，它們由Thermomyces和Aspergillus組成。此外，Zhu Min等[37]在探討環(huán)境因素對中高溫大曲發(fā)酵過程中微生物群落變化的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，環(huán)境濕度、CO2和水分對微生物群落的影響是顯著的，這表明在發(fā)酵過程中除溫度以外的環(huán)境因素亦會(huì)對真菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。

本研究通過純培養(yǎng)法從A企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲中僅分離到4 株酵母菌菌株，它們均被鑒定為S.fibuligera。S.fibuliger具有高效分泌α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶和酸性蛋白酶等特性，是谷物發(fā)酵中重要的功能微生物[38]。然而值得注意的是，本研究并未通過純培養(yǎng)法分離得到較豐富的酵母菌菌種，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是較高的發(fā)酵溫度或是樣品經(jīng)過低溫貯存后使得大多數(shù)酵母菌菌種失活或是活性較弱，而富集酵母菌常用的PDA培養(yǎng)基成分較為單一，并不能滿足菌株恢復(fù)活性所需的全部營養(yǎng)組分。此前，其他研究人員亦關(guān)注到了純培養(yǎng)法的不足之處，并開發(fā)出了培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)以更多地從樣品中獲得微生物資源[40]。例如，Lagier等[39]通過培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)使從人類腸道中分離出的物種數(shù)量增加了一倍。此外，Yao Su等[40-41]從高溫大曲中先后發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新物種，它們分別被命名為大曲高溫放線菌（Thermoactinomyces daqus）和大曲巖石芽孢桿菌（Scopulibacillus daqui）。因而，高溫大曲中目前仍可能含有大量未知物種，采用培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)挖掘出更多的大曲源物種是極為必要的。綜上所述，襄陽地區(qū)A企業(yè)生產(chǎn)的3 種顏色高溫大曲在部分優(yōu)勢真菌類群含量和風(fēng)味特征上存在顯著差異，且該地區(qū)A企業(yè)和B企業(yè)生產(chǎn)的高溫大曲真菌群落結(jié)構(gòu)間亦存在顯著差異。由此可見，襄陽地區(qū)高溫大曲中的真菌在發(fā)酵過程中受到溫度波動(dòng)的影響較小，而受到生產(chǎn)工藝的影響較大。