賈紅磊, 王 晴, 陳 翠, 魏 婷, 張春平, 吳廣放

(1.陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西 西安 710021; 2.中國(guó)建筑材料工業(yè)建設(shè)西安工程有限公司, 陜西 西安 710061)

0 引言

由于對(duì)有限礦產(chǎn)資源的探測(cè)和大力開(kāi)發(fā)、工業(yè)生產(chǎn)制造、施用化肥農(nóng)藥和污水灌溉等一系列人為因素,使得大量有害重金屬被排放到自然環(huán)境中,造成嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題[1],其中受到重金屬污染的農(nóng)田土壤正面臨土地退化、糧食減產(chǎn)的問(wèn)題.而重金屬污染問(wèn)題中,鎘(Cd)污染問(wèn)題尤為突出[2].調(diào)查發(fā)現(xiàn),廣東、江西、浙江、湖南、河北、陜西等地區(qū)土壤均受到輕重不一的Cd污染[3].Cd由于可以取代酶活性位點(diǎn)中起關(guān)鍵作用的基本元素及對(duì)巰基的高親和力,被認(rèn)為是強(qiáng)毒性物質(zhì)[4].Cd通過(guò)根系進(jìn)入植物體擾亂植物正常生理和代謝,如降低植物生物量[5]、破壞葉綠體結(jié)構(gòu),降低植物光合作用[6]、抑制土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)等[7].植物自身具有響應(yīng)Cd脅迫的應(yīng)答機(jī)制,例如增加可溶性蛋白含量對(duì)生物膜和維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起到保護(hù)作用,調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)提高抗氧化能力,改變細(xì)胞壁組成及結(jié)構(gòu)固定Cd等[8,9].

硫(S)作為植物必須的大量元素,是某些氨基酸(半胱氨酸、甲硫氨酸)、抗氧化劑(還原型谷胱甘肽)、輔酶、維生素、植物螯合素和脂質(zhì)的組成部分,這些物質(zhì)在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育、響應(yīng)非生物脅迫等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4,10].此外,S還以硫化氫(H2S)的形式存在于植物體內(nèi),與NO、CO和生長(zhǎng)素相互作用調(diào)節(jié)根的形成,緩解各種非生物脅迫對(duì)根生長(zhǎng)的抑制[11,12].植物根際通過(guò)吸收土壤中的硫酸鹽完成自身對(duì)S的同化過(guò)程,并激活植物根部的硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(SUT)使該過(guò)程持續(xù)進(jìn)行[13].在不同的含S化合物中,半胱氨酸(Cysteine,Cys)和谷胱甘肽(Glutataione,GSH)在緩解重金屬誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中起著重要作用[14].S可以通過(guò)維持高水平的植物絡(luò)合素(Phytochelatin,PCs)或其前體GSH來(lái)限制重金屬向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn).Khan等[15]發(fā)現(xiàn)外源S可以提高植物的新陳代謝,增加其生物量,降低Cd對(duì)植物產(chǎn)生的毒性.

氮(N)和磷(P)在調(diào)節(jié)植物營(yíng)養(yǎng)平衡和生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用,S、N和P同化途徑可以在逆境條件下通過(guò)改善植物生理增強(qiáng)其抗逆性,它們的同化作用是各種生物合成途徑的基礎(chǔ),是植株調(diào)節(jié)的重要手段[16].目前尚不清楚S是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)植物N和P代謝提高植物響應(yīng)Cd脅迫的能力.本研究旨在通過(guò)對(duì)植物體內(nèi)N、P含量、存在形式、分布及代謝關(guān)鍵酶的研究,為外源S調(diào)控植物響應(yīng)重金屬脅迫提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)植物為番茄(石紅三號(hào),Solanum lycopersicum L.),種子由新疆石河子蔬菜研究所番茄研究開(kāi)發(fā)中心提供.將適量的種子盛于干凈的燒杯中,用3%的次氯酸鈉浸泡30 min后,用去離子水清洗干凈完成消毒.將消毒后的種子均勻播種(每穴5～6顆)在裝有蛭石的穴盤(pán)中,保證蛭石濕度便于種子的萌發(fā).穴盤(pán)避光放置于人工氣候室,待種子發(fā)芽長(zhǎng)至約4～5 cm,用泡沫棉包裹植株莖部轉(zhuǎn)移至含有1/4 Hoagland的水培箱培養(yǎng)兩周,替換為濃度為1/2的營(yíng)養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)2周.人工氣候室設(shè)置:光照周期16 h/8 h(光照/黑暗),相對(duì)濕度40%～60%,溫度26±2 ℃(晝)/20±2 ℃(夜).

番茄幼苗培養(yǎng)至兩葉一心時(shí)即可準(zhǔn)備處理,選取生長(zhǎng)良好且一致的幼苗,移至不同的培養(yǎng)罐中處理,每個(gè)培養(yǎng)罐中移植4株番茄幼苗,根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求收樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo).處理組中缺S營(yíng)養(yǎng)液(0 mmol·L-1S)即為將營(yíng)養(yǎng)液中的27.80 mg·L-1FeSO4換為73.50 mg·L-1FeCl2·4H2O,其余不變;外源S以Na2SO4的形式加入.

本試驗(yàn)Cd濃度為3 mg·L-1,試驗(yàn)共設(shè)置8組處理,分別為0 mmol·L-1S(缺S)、1 mmol·L-1S(對(duì)照)、2 mmol·L-1S、4 mmol·L-1S、0 mmol·L-1S+Cd(脅迫缺S)、1 mmol·L-1S+Cd(脅迫對(duì)照)、2 mmol·L-1S+Cd、4 mmol·L-1S+Cd.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脯氨酸和可溶性蛋白含量的測(cè)定

采用茚三酮法測(cè)定脯氨酸含量[16],0.50 g待測(cè)樣品加入5 mL磺基水楊酸溶液,沸水浴浸提10 min,過(guò)濾浸提液,顯色反應(yīng)后在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算脯氨酸含量.

利用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定可溶性蛋白含量.稱(chēng)取0.50 g鮮樣加入少量蒸餾水研磨,直至呈現(xiàn)勻漿狀態(tài)倒入10 mL離心管,用6 mL蒸餾水反復(fù)沖洗,洗滌液也一并收集在離心管中,4 000 r/min離心10 min后取出定容得到提取液.顯色后在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量[16].

1.2.2 氮(N)代謝相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

硝酸還原酶(NR)活性測(cè)定根據(jù)北京索萊寶科技有限公司的NR活性檢測(cè)試劑盒(Griess顯色法)進(jìn)行.取植物鮮樣0.2 g于預(yù)冷的NR Lysis緩沖液中,冰浴研磨勻漿、離心,留取上清液即為硝酸還原酶粗提液(4 ℃保存待用).取適量的亞硝態(tài)氮標(biāo)準(zhǔn)樣制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用酶標(biāo)儀檢測(cè)計(jì)算活性.其單位為μg·g-1·h-1

谷氨酰胺合成酶(GS)活性的測(cè)定參照Lillo C[19]的方法.稱(chēng)取植物鮮樣0.2 g于3 mL提取緩沖液(pH 8.0,0.05 mol·L-1Tris-HCL)中,冰浴上研磨勻漿,4 ℃,15 000 g離心20 min,上清液即為粗酶液.取1.6 mL反應(yīng)混合液B(pH 7.4,含鹽酸羥胺),加入0.7 mL粗酶液和40 mmol·L-1ATP溶液,混勻,于37 ℃下保溫半小時(shí),加入顯色劑1 mL,5 000 g離心10 min,取上清液在540 nm處測(cè)定吸光值.單位為A·mg-1protein·h-1.

1.2.3 磷(P)代謝相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

總磷(TP)含量的測(cè)定參照現(xiàn)有方法并稍作修改[20-22].稱(chēng)取植物干樣0.25 g(精確至0.001 g)加入6 mL HNO3浸泡1 h后加入2 mL H2O2.置于電熱消解儀上按照如下程序消解:120 ℃-10 min,150 ℃-15 min,190 ℃-25 min,冷卻后取出,100 ℃-30 min后取出冷卻并定容,利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometer,ICP-MS)進(jìn)行測(cè)定.

醋酸鈉溶液研磨浸提后得到含酸性磷酸酶(Acid Phosphatase,APA)提取液,過(guò)濾后取1 mL置于試管中,加入0.05 mol·L-1對(duì)硝基苯磷酸二鈉溶液2 mL,100 ℃條件下反應(yīng)10 min后依次加入2 mL CaCl2和NaOH溶液終止反應(yīng).離心后測(cè)定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其活性[20].

2 結(jié)果與討論

2.1 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株生物量累積的影響

為了確定外源S對(duì)番茄植株生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用,分析了不同濃度S在-Cd或+Cd條件下每個(gè)培養(yǎng)罐中番茄植株指定位置的葉片鮮重.結(jié)果如圖1(a)所示,無(wú)Cd情況下,與0 mmol·L-1(缺S組)相比1 mmol·L-1S,2 mmol·L-1S與4 mmol·L-1S均顯著提升番茄植株地上、地下鮮重,與1 mmol·L-1(對(duì)照組)相比2 mmol·L-1S顯著提升番茄植株地上、地下鮮重(P<0.05),但4 mmol·L-1S處理與對(duì)照組無(wú)顯著性差異,缺S組生物量最低,這說(shuō)明Cd顯著抑制植物的生長(zhǎng),外源S明顯緩解由于Cd脅迫導(dǎo)致的生物量下降(P<0.05).

圖1 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株生長(zhǎng)的影響

S對(duì)根生物量累積的影響與地上部相似,2 mmol·L-1S處理具有較好的調(diào)控效果(如圖1(b)所示).在-Cd情況下,2 mmol·L-1S處理生物量累積分別是缺S和對(duì)照組的2.1倍和1.25倍(P<0.05).Cd脅迫導(dǎo)致0 mmol·L-1S和1 mmol·L-1S組別中生物量下降32%～36%,S濃度為2 mmol·L-1時(shí)生物量提升42%(P<0.05).結(jié)果表明,S具有顯著增加植物生物量的效果且能夠緩解由于Cd對(duì)番茄植株造成的生物量減少效應(yīng).

2.2 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株抗逆代謝物的影響

脯氨酸和可溶性蛋白伴隨植物N代謝生成,是一種調(diào)節(jié)植物滲透勢(shì)的大分子物質(zhì),是植物體內(nèi)響應(yīng)逆境脅迫抵抗脂質(zhì)過(guò)氧化等過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物[23,24].此外,可溶性蛋白也是植物響應(yīng)脅迫的重要代謝物[25].為評(píng)價(jià)外源S對(duì)番茄植株抗逆代謝物質(zhì)的調(diào)節(jié)作用,分別在無(wú)Cd和有Cd脅迫條件下研究不同濃度S處理下番茄植株對(duì)脯氨酸、可溶性蛋白的積累.

2.2.1 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株體內(nèi)脯氨酸含量的影響

由圖2(a)可知,與對(duì)照組相比,外源S顯著提升番茄根中脯氨酸含量.S濃度為2 mmol·L-1時(shí),根中脯氨酸含量是對(duì)照組的1.28倍.Cd脅迫時(shí),根中脯氨酸含量比對(duì)照增加39.58%,2 mmol·L-1+Cd處理組是1 mmol·L-1+Cd(脅迫對(duì)照組)的1.20倍,0 mmol·L-1+Cd(脅迫缺S組)的1.8倍(P<0.05).表明Cd脅迫導(dǎo)致番茄根中脯氨酸累積,外源S的添加誘導(dǎo)根中脯氨酸含量上升響應(yīng)Cd脅迫.

圖2 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株脯氨酸含量的影響

葉中脯氨酸含量如圖2(b)所示,單獨(dú)S處理時(shí),脯氨酸含量呈現(xiàn)小幅度的劑量依賴(lài)變化.Cd脅迫下,葉中脯氨酸含量隨S濃度呈劑量依賴(lài)性提升.S濃度為2 mmol·L-1和4 mmol·L-1時(shí)葉中脯氨酸含量分別是脅迫對(duì)照組的1.12、1.18倍(P<0.05).表明外源S可以促進(jìn)Cd脅迫下脯氨酸的累積響應(yīng)Cd脅迫.脯氨酸含量增加可視為S調(diào)控番茄植株對(duì)Cd脅迫響應(yīng)的信號(hào),可能是其抵御Cd毒害的重要調(diào)控途徑之一[26].

2.2.2 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株體內(nèi)可溶性蛋白含量的影響

在植物中,可溶性蛋白是滲透調(diào)節(jié)劑和活性氧清除劑,因此可以減少重金屬對(duì)植物細(xì)胞的損害[27].番茄植株可溶性蛋白變化如圖3所示,在無(wú)Cd條件下,外源施加2 mmol·L-1和4 mmol·L-1S時(shí),根中可溶性蛋白量分別是對(duì)照組的2.87、2.30倍.Cd脅迫條件下,番茄根中可溶性蛋白累積量隨著S劑量增大同步增加(P<0.05).當(dāng)S濃度為2 mmol·L-1和4 mmol·L-1時(shí),番茄的根中可溶性蛋白含量是脅迫對(duì)照組的1.39、1.65倍(如圖3(a)所示).葉中可溶性蛋白含量如圖3(b)所示,與單獨(dú)Cd處理相比,2 mmol·L-1+Cd和4 mmol·L-1+Cd處理番茄植株葉中可溶性蛋白含量增加21.23%和9.41%(P<0.05).由此可見(jiàn),Cd脅迫條件下,外源施加S能夠有效增加番茄葉片中可溶性蛋白含量,緩解Cd對(duì)植株帶來(lái)的危害.

圖3 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株可溶性蛋白含量的影響

綜上所述,Cd脅迫誘導(dǎo)番茄植株可溶性蛋白含量增加可歸因于番茄植株的自我平衡機(jī)制,緩解Cd對(duì)植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷所導(dǎo)致的滲透電位失衡問(wèn)題[25,27].而外源S使植株體內(nèi)可溶性蛋白含量進(jìn)一步累積,降低植株的Cd毒性效應(yīng),從而提高番茄植株對(duì)Cd脅迫的抗性.

2.3 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株氮代謝的影響

圖4 外源S對(duì)Cd脅迫下番茄植株和的影響

2.3.3 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株N代謝關(guān)鍵酶活性的影響

在本實(shí)驗(yàn)中,NR活性受Cd和S的影響顯著(如圖5(a)、(b)所示).單獨(dú)S處理?xiàng)l件下,隨著S濃度的增加,根系中NR活性上升(P<0.05),但在葉片中含S條件下NR活性無(wú)顯著變化.Cd脅迫下,番茄植株根和葉中NR活性均明顯下降,外源S能在一定程度上緩解該抑制作用,2 mmol·L-1S處理時(shí)植株根和葉中NR活性分別是脅迫對(duì)照組的1.16、1.06倍;S濃度為4 mmol·L-1時(shí)無(wú)顯著變化(如圖5(a)、(b)所示).結(jié)果表明,外源S對(duì)Cd脅迫下的NR活性有一定的激活作用,2 mmol·L-1時(shí)的效果最為顯著,且在根中作用效果優(yōu)于葉片.

圖5 外源S對(duì)Cd脅迫下番茄植株NR酶和GS酶活性的影響

2.4 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株磷代謝的影響

P參與許多生理過(guò)程,如光合作用和碳水化合物的生產(chǎn),增強(qiáng)應(yīng)激環(huán)境中抗氧化防御系統(tǒng)的活動(dòng)[34,35].為探索外源S在Cd脅迫條件下對(duì)植株P(guān)代謝的調(diào)節(jié)作用,在無(wú)脅迫和Cd脅迫條件下添加不同濃度S分析番茄植株P(guān)含量和酸性磷酸酶(APA)活性變化.

2.4.1 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株P(guān)含量的影響

在無(wú)Cd脅迫條件下,隨著S濃度的增加根系中P的含量上升,葉片中磷含量下降;Cd脅迫下,番茄根中P含量顯著下降,葉中P含量上升(如圖6所示).

圖6 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株P(guān)含量的影響

表明葉中可能需要更多的P維持Cd脅迫下植物的代謝,因此S促進(jìn)P從根中轉(zhuǎn)移到葉中.Cd進(jìn)入植物后,P可以通過(guò)促進(jìn)液泡中不溶性Cd-磷酸絡(luò)合物的形成和細(xì)胞壁中果膠酸鹽/蛋白質(zhì)螯合Cd的形式來(lái)降低Cd的遷移率[35].因此在Cd脅迫下,植物體內(nèi)P可能一部分與Cd形成Cd-磷酸絡(luò)合物,使植物體內(nèi)可利用P缺乏.外源S處理后可能促進(jìn)番茄P元素由根向葉中轉(zhuǎn)移,一方面加強(qiáng)對(duì)Cd的螯合,另一方面維持自身代謝以緩解Cd脅迫.在缺硫情況下,植物可能通過(guò)抗逆響應(yīng)調(diào)節(jié)或影響P攝取相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)提高植物對(duì)磷的攝取量[36-40].

2.4.2 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株P(guān)代謝關(guān)鍵酶活性的影響

APA是植物體內(nèi)的一種誘導(dǎo)酶,可以水解有機(jī)磷,APA活性的增加與許多物種和植物部分的低水平Pi相關(guān)[41].無(wú)Cd條件下,S誘導(dǎo)APA活性上升,但在Cd脅迫時(shí)根和葉中APA的變化趨勢(shì)不同(如圖7所示).

圖7 外源硫?qū)d脅迫下番茄植株APA酶活性的影響

在根中,與對(duì)照相比Cd處理后APA活性升高1.55倍(如圖7(a)所示);在葉中,Cd脅迫下APA活性是對(duì)照的1.05倍(如圖7(b)所示),可能由于Cd脅迫造成番茄體內(nèi)Pi缺乏,導(dǎo)致APA酶活性上升水解有機(jī)磷維持體內(nèi)Pi的需求[42].與Cd脅迫對(duì)照相比,S濃度為2 mmol·L-1和4 mmol·L-1時(shí),葉中APA活性是其1.06、1.22倍(P<0.05).

3 結(jié)論